蘇堯 陳莉 徐先明

上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院（上海 201600）

妊娠期糖尿病（GDM）在2015年至2016年被美國糖尿病協(xié)會(huì)更新其定義為“妊娠前無糖尿病，在妊娠中晚期診斷為糖尿病的人”，GDM 發(fā)病率在全球范圍內(nèi)約1%～30%［1］。腸道菌群被發(fā)現(xiàn)通過影響人體的代謝和免疫［2］，從而在GDM 的發(fā)生發(fā)展中扮演了越發(fā)重要的角色，較為熱門的學(xué)說有內(nèi)毒素血癥、胰島素抵抗等。研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌與OGTT 結(jié)果呈正相關(guān)，可能是GDM 的潛在監(jiān)測和治療性微生物標(biāo)記［3］。擬桿菌可獲取和降解植物多糖，為人體提供約15%的能量，PEDERSEN 等［4］發(fā)現(xiàn)口服擬桿菌菌株導(dǎo)致無菌小鼠體內(nèi)脂肪含量快速增加，同時(shí)空腹血糖和胰島素水平也顯著升高，出現(xiàn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。GDM 孕婦毛螺菌科和瘤胃菌科豐度明顯高于正常健康孕婦［5］，這兩種菌與糖耐試驗(yàn)中1 h 血糖水平負(fù)相關(guān)，它們是能量代謝的優(yōu)勢菌，可分解膳食纖維產(chǎn)生丁酸［6］。目前降糖的研究中主要包括抑制胰島β 細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌，調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶活性以及調(diào)節(jié)腸道菌群等多種途徑。有研究補(bǔ)充含有乳酸菌的益生菌可產(chǎn)生類似二甲雙胍的作用，可改善胰島素抵抗和降低血糖［7］。

本研究旨在分析上海地區(qū)孕婦孕中期GDM孕婦和健康孕婦腸道菌群的差異，探討其在GDM發(fā)病機(jī)制中的作用，以期為GDM 的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組選擇2019年9月至2020年6月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院南院產(chǎn)科建卡及規(guī)律產(chǎn)檢的妊娠期糖耐量正常孕婦（gestational normal glucose tolerance，GNGT）22 例以及確診患有妊娠期糖尿病的孕婦（GDM 組）20 例。

入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）上海松江常住居民，當(dāng)?shù)仄胀嬍常?）漢族，（3）單胎妊娠，（4）自然受孕，（5）孕24～28 周（OGTT 時(shí)間）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有傳染性疾病，如艾滋病、活動(dòng)性肝炎、梅毒等；（2）孕前患有糖尿病或糖耐量異常；（3）有嚴(yán)重的應(yīng)激性生活事件發(fā)生、嚴(yán)重焦慮、抑郁者；（4）合并高血壓、慢性高血壓、慢性腎炎等慢性病史者；（5）近1 個(gè)月內(nèi)腹瀉或合并消化道慢性病史；（6）入組前2 個(gè)月內(nèi)服用抗生素；（7）合并消化道疾病或有胃腸道腫瘤、手術(shù)史。

本研究為觀察性病例對照研究，已獲得上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 病歷信息采集通過孕婦大卡收集一般信息，包括年齡、孕前體質(zhì)量、身高、孕前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、民族以及妊娠情況，包括OGTT 時(shí)間、孕周、孕次、產(chǎn)次、血壓、妊娠合并癥及并發(fā)癥，既往病史等。

1.2.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)BMI（kg/m2）=體質(zhì)量（kg）/身高（cm）2。GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2015年美國糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布更新的糖尿病醫(yī)學(xué)診治標(biāo)準(zhǔn)［1］：空腹血糖（FBG）≥5.1 mmol/L（92 mg/dL），1 h血糖（1 h PBG）≥10.0 mmol/L（180 mg/dL），2 h 血糖（2 h PBG）≥8.5 mmol/L（153 mg/dL），出現(xiàn)以上任一血糖值即診斷為GDM。

1.2.3 胰島素敏感性計(jì)算公式［8］（1）胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=空腹血糖水平（FBG，mmol/L）×空腹胰島素水平（FINS，mIU/L）/22.5；（2）胰島素分泌指數(shù)（HOMA-IS）：HOMA-IS=1/HOMAIR；（3）胰島β 細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β，%）=20×空腹胰島素水平（FINS，mIU/L）/（空腹血糖水平（FBG，mmol/L）-3.5）。

1.2.4 糞便情況調(diào)查5 mL 伯優(yōu)TM 糞便核酸保存管購自上海伯豪生物技術(shù)有限公司，入組的孕婦在行OGTT 篩查當(dāng)天用保存管采集新鮮晨便，利用管蓋上的取樣勺隨機(jī)拾取三處不同部位的糞便樣本，于門診交與研究人員置于-80 ℃冰箱保存，后續(xù)用Illumina Hiseq2500 平臺檢測42 例孕婦的腸道菌群構(gòu)成。具體操作如下：（1）糞便DNA的提?。豪肕agnetic Fecal DNA Extraction Kit 抽提糞便標(biāo)本中的菌群基因組DNA。（2）DNA 樣本檢測：使用ExKubitdsDNA HS 分析試劑盒檢測DNA 的質(zhì)量，篩選符合檢測標(biāo)準(zhǔn)的DNA 樣本。（3）PCR 擴(kuò)增：利用聚合酶鏈反應(yīng)特異性擴(kuò)增16SrRNA 的V3-V4可變區(qū)。反應(yīng)采用TransGen AP221-02：Trans Start Fastpfu DNA 聚合酶，體系包括10 ng of template DNA，2 μL 引物等，總共20 μL。引物序列：上游為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′），下游為806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。得到16SrRNA 基因片段后通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。（4）基因測序：利用Illumina Hiseq2500 平臺，通過激光掃描反應(yīng)板讀取模板序列聚合的核苷酸種類，對采集到的熒光信號進(jìn)行建庫分析，從而讀取模板DNA 片段的序列。

1.2.5 腸道菌群指數(shù)分析利用Trimmomatic 軟件，通過RDP classifer 貝葉斯算法聚類為OTU，然后對物種分類信息進(jìn)行注釋。采用Usearch 軟件統(tǒng)計(jì)分析獲得相對豐度和多樣性等相關(guān)指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)性檢驗(yàn)的計(jì)量資料用（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25～P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。采用ROC 曲線預(yù)測腸道菌群對GDM的診斷價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 GDM 組和GNGT 組的臨床資料比較本研究中的GDM 組和GNGT 組孕婦的年齡、OGTT 孕周、孕前BMI、孕次、產(chǎn)次、收縮壓和舒張壓的組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 42 例孕婦的基本特征比較Tab.1 Comparison of the demographic Characteristics among 42 pregnant women M（P25，P75）

2.2 兩組孕婦門水平及屬水平腸道菌群的構(gòu)成及相對豐度

2.2.1 門水平兩組孕婦腸道菌群的相對豐度比較在門水平上，42例孕婦的孕中期腸道菌群標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)22 個(gè)菌門，相對豐度前7 位的菌門構(gòu)成：厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門、柔膜菌門和其他菌門，見圖1。與GNGT組比較，GDM 組孕婦擬桿菌門和其他菌門的相對豐度明顯升高，而放線菌門、疣微菌門和柔膜菌門的相對豐度均降低（P＜0.05），厚壁菌門和變形菌門的相對豐度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 GDM 組和GNGT 組孕婦門水平腸道菌群相對豐度的分布柱狀圖Fig.1 Relative abundance of the intestinal flora between two groups based on phylum level

2.2.2 屬水平兩組孕婦腸道菌群的相對豐度比較屬水平上，42 例孕婦的孕中期腸道菌群標(biāo)本共發(fā)現(xiàn)315 個(gè)菌屬，相對豐度前8 位的菌屬分別是：擬桿菌屬、糞桿菌屬、其他菌屬-A、巨單胞菌屬、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬、Lachnoclostridium 屬、Escherichiashigella 屬和瘤胃菌屬-UCG014，見圖2。與GNGT 組比較，GDM 組孕婦擬桿菌屬的平均相對豐度顯著升高，而產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬、Escherichiashigella 屬和瘤胃菌屬-UCG014 的相對豐度降低，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他四個(gè)菌屬的相對豐度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 GDM 組和GNGT 組孕婦屬水平腸道菌群相對豐度的分布柱狀圖Fig.2 Relative abundance of the intestinal flora between two groups based on genus level

2.3 兩組孕婦腸道菌群的α多樣性及OTUs比較見表2，GDM 組孕婦腸道菌群的OTUs、Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均顯著高于GNGT 組孕婦（P＜0.05），而兩組的Simpson 指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 GDM 組和GNGT 組孕婦腸道菌群多樣性比較Tab.2 Comparison of the diversity of intestinal flora in two groups ±s

表2 GDM 組和GNGT 組孕婦腸道菌群多樣性比較Tab.2 Comparison of the diversity of intestinal flora in two groups ±s

組別GDM 組GNGT 組t 或U 值P 值樣本數(shù)（例）20 22 Ace 指數(shù)2326.53±780.72 817.03±224.48-8.339＜0.05 OTUs 969.05±298.23 458.05±107.41-7.247＜0.05 Chao1 指數(shù)1703.98±553.53 686.39±166.60-7.902＜0.05 Shannon 指數(shù)4.48±0.72 3.91±0.67-2.630＜0.05 Simpson 指數(shù)［M（P25，P75）］0.03（0.02，0.07）0.04（0.03，0.12）170.00＞0.05

2.4 腸道菌群與糖代謝相關(guān)性的矩陣熱圖孕中期的腸道菌群中，擬桿菌門和擬桿菌屬的相對豐度與OGTT1 小時(shí)胰島素呈正相關(guān)；厚壁菌門的相對豐度與1 小時(shí)胰島素呈負(fù)相關(guān)；放線菌門與FBG呈負(fù)相關(guān)；瘤胃菌屬-UCG014 與HbA1c、1 h PBG、1 小時(shí)胰島素和HOMA-IR 呈負(fù)相關(guān)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 孕中期腸道菌群與糖代謝指標(biāo)相關(guān)性的熱圖Fig.3 Heat map of the correlation between intestinal flora and glucose metabolism indicators in the second trimester

2.5 ROC 曲線分析腸道菌群對GDM 的診斷價(jià)值擬桿菌門的AUC 值為0.759（0.605～0.913），最佳cut off 值為0.277，其約登指數(shù)為0.523，敏感性為75.0%，特異性為77.3%；擬桿菌屬的AUC 值為0.745（0.588～0.903），最佳cut off 值為0.250，其約登指數(shù)為0.518，敏感性為70.0%，特異性為81.8%，其他菌門和屬均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05 或AUC ＜0.5），見表3、圖4-5。

圖4 ROC 曲線分析孕中期腸道菌群在門水平對GDM 的診斷價(jià)值Fig.4 ROC curve analysis of the diagnostic value of intestinal flora at the phylum level in the second trimesterfor GDM

表3 ROC 分析腸道菌群在門和屬水平對GDM 的診斷價(jià)值Tab.3 ROC analysis of the diagnostic value of intestinal flora at the phylum and genera level for GDM

3 討論

圖5 ROC 曲線分析孕中期腸道菌群在屬水平對GDM 的診斷價(jià)值Fig.5 ROC curve analysis of the diagnostic value of intestinal flora at the genera level in the second trimester for GDM

本研究重點(diǎn)探討了孕中期腸道菌群和妊娠期糖尿病的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GDM 組孕婦腸道菌群的α多樣性顯著高于GNGT 組，有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的α 多樣性對糖代謝紊亂具有影響［9］?，F(xiàn)有研究表明腸道菌群紊亂可通過不同的機(jī)制來誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生：（1）腸道菌群在宿主免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用，細(xì)菌脂多糖通過識別Toll 樣受體觸發(fā)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)［10］，從而介導(dǎo)腸道慢性炎癥，導(dǎo)致胰島素抵抗。（2）作為擬桿菌等腸道微生物的代謝產(chǎn)物，包括乙酸鹽和丙酸鹽在內(nèi)的SCFA 通過G 蛋白偶聯(lián)受體抑制組蛋白脫乙?；福?1］，來調(diào)節(jié)宿主的能量獲取和代謝能力，SCFA 的膳食補(bǔ)充可改善2 型糖尿病患者的腸道菌群紊亂和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，并通過增強(qiáng)產(chǎn)SCFA 細(xì)菌的活性正向促進(jìn)SCFA 產(chǎn)生。

擬桿菌門作為人類腸道菌群的優(yōu)勢菌群，可通過不同的機(jī)制來影響糖代謝途徑。CANI 等［12］研究發(fā)現(xiàn)感染擬桿菌的無菌小鼠出現(xiàn)血清中支鏈氨基酸水平明顯增加，且誘導(dǎo)了胰島素抵抗。擬桿菌（革蘭氏陰性桿菌）可通過細(xì)胞壁的脂多糖成分增加腸道通透性來介導(dǎo)代謝性內(nèi)毒素血癥，從而導(dǎo)致肥胖和糖尿病的發(fā)生。綜上所述，擬桿菌可能與妊娠期糖尿病具有一定的相關(guān)性。本研究驗(yàn)證了以上推論，無論是GDM 組還是GNGT 組孕婦，厚壁菌和擬桿菌所占比例都是最高的，但GDM 組的擬桿菌明顯高于糖耐量正常的孕婦，且擬桿菌門和擬桿菌屬均與孕婦的1 h 胰島素呈正相關(guān)，通過ROC 曲線分析，進(jìn)一步確定了擬桿菌在GDM 的診斷中的價(jià)值。

腸道菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)，尤其擬桿菌的比例增加，可能是導(dǎo)致GDM 的危險(xiǎn)因素之一。因此，改善腸道菌群有望成為防治GDM 的靶點(diǎn)，以下三個(gè)方面可作為參考：（1）醫(yī)學(xué)營養(yǎng)療法：提倡地中海飲食有助于降低機(jī)體的炎癥應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙。飲食中營養(yǎng)成分可直接促進(jìn)或抑制菌群的生長繁殖，其中的小分子物質(zhì)會(huì)通過影響機(jī)體的內(nèi)分泌、代謝和免疫系統(tǒng)對菌群產(chǎn)生影響［13］。有研究發(fā)現(xiàn)低纖維素飲食會(huì)導(dǎo)致菌群過度損傷腸道粘液層，促進(jìn)腸腔中脂多糖、炎癥因子和葡萄糖等小分子進(jìn)入血液循環(huán)，最終影響代謝［14］。（2）微生態(tài)調(diào)節(jié)劑：人體內(nèi)益生菌可通過調(diào)節(jié)人體腸道黏膜的屏障功能和免疫系統(tǒng)功能促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，保持腸道環(huán)境健康。有研究表明奶粉中添加低聚半乳糖后喂養(yǎng)新生兒，可檢測到新生兒糞便中雙歧桿菌屬豐度明顯增加。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)飲食中增加膳食纖維的比例后腸道中雙歧桿菌、乳酸菌等對腸道炎癥具有保護(hù)性作用菌群豐度增高，同時(shí)SCFA 含量增加［15］。（3）糞菌移植：糞便微生物群移植通過將健康機(jī)體的糞便菌液移植到患者體內(nèi)來治療疾病。操縱腸道菌群來促進(jìn)健康很有前景，但是尚不清楚在腸道中定植的規(guī)則。不過已有研究表明通過改善飲食和生活方式或者使用益生菌干預(yù)可以改變腸道微生物群落［16］。