劉歡，徐小琳*，武占省,2，劉思琪

(1 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2 西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱(chēng) PGPR)是指分布于植物根際周?chē)軌虼碳に拗髦参锷L(zhǎng)或抑制有害微生物的一類(lèi)有益土壤細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)[1]。近年來(lái)，PGPR因其良好的促生、抑菌作用成為有機(jī)農(nóng)業(yè)中生物肥料和生物防治的重要組成部分[2]，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與綠色發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3]。大量研究表明，植物根際促生菌不僅能通過(guò)固氮、溶磷、分泌植物生長(zhǎng)激素等作用來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還可以通過(guò)誘導(dǎo)植物建立抵抗或忍耐機(jī)制，增強(qiáng)植物在鹽脅迫條件下的生存能力[4]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì) PGPR 進(jìn)行全基因組測(cè)序，為分析PGPR的生理生態(tài)功能，揭示PGPR的作用機(jī)制和代謝調(diào)控提供了有利條件。Kang等人研究表明LeifsoniaxyliSE134中trp 基因簇以及乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(ysnE)參與生長(zhǎng)素 IAA 合成前體物色氨酸的生物合成[5]。ZipA被發(fā)現(xiàn)在PseudomonasaurantiacaStrainJD37基因組中，其編碼的受體蛋白可能與鐵載體產(chǎn)生有關(guān)，它可以促進(jìn)植物吸收鐵離子并形成特定的螯合物以預(yù)防病原體[6]。pst 基因以及 pho 基因可參與芽孢桿菌的溶磷過(guò)程，用基因工程方法使這兩個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，將增加溶磷量，更好地促進(jìn)植物生長(zhǎng)[7]。誘導(dǎo)SOS1和NHX1基因編碼的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)和適應(yīng)鹽分積累[8]。通過(guò)挖掘相關(guān)功能基因，解析不同菌株的主要促生特性，在分子水平上深化對(duì)各菌株生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)，能夠?yàn)閺?qiáng)化研究各菌株促生特性以及提高植物根部定殖效率、提高植物抗鹽脅迫水平和菌株代謝互補(bǔ)等提供理論支持。

EnterobacterhormaecheiWu-15是本課題組分離自新疆鹽漬化土壤的棉花根際的解鹽促生菌，前期實(shí)驗(yàn)證明Wu-15具有良好的解鹽促生能力[9]。本文以該菌株為材料，運(yùn)用第二代測(cè)序技術(shù)和第三代單分子測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行全因組測(cè)序分析，尋找菌株中與解鹽促生相關(guān)的基因，以期能為進(jìn)一步深入探究Wu-15解鹽促生作用相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

EnterobacterhormaecheiWu-15 由本實(shí)驗(yàn)室自行篩選，16 s rDNA 鑒定為霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)；曾用名為Rs-5。

1.2 基因組DNA的提取

參照 Michael 方法[10]提取Wu-15基因組DNA。

1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

使用熒光染料(Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)檢測(cè) DNA 總量并通過(guò) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 的完整性，之后將DNA 稀釋的工作液保存于 4 ℃，儲(chǔ)存液保存于-20 ℃。

1.4 全基因組測(cè)序

以EnterobacterhormaecheiWu-15 菌株為材料，基于 Illumina NovaSeq和PacBio Sequel 測(cè)序平臺(tái)對(duì)Wu-15全基因組進(jìn)行測(cè)序。本研究采用全基因組鳥(niǎo)槍法(Whole Genome Shotgun，WGS)策略[11]，構(gòu)建不同插入片段的文庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作委托給上海派森諾生物技術(shù)有限公司。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾及整理

二代測(cè)序采用 FastQC[11]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，SOAPec進(jìn)行校正，三代下機(jī)數(shù)據(jù)用HGAP[133]和CANU[14]軟件進(jìn)行組裝，得到contig序列。第二代數(shù)據(jù)用于校正第三代結(jié)果：將二代高質(zhì)量數(shù)據(jù)用pilon[15]軟件對(duì)第三代contig結(jié)果進(jìn)行校正，最終得到完整的序列，相關(guān)數(shù)據(jù)已上傳到NCBI，BioProject ID為PRJNA686495。

1.6 功能基因的注釋

以Wu-15全基因組測(cè)序所得基因序列和通用數(shù)據(jù)庫(kù)，如GO、COG和KEGG功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得基因功能注釋結(jié)果。

用BLAST2GO軟件對(duì)GO功能進(jìn)行了注釋?zhuān)⒏鶕?jù)生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能對(duì)Wu-15基因組中的編碼基因進(jìn)行了GO分類(lèi)。此外，通過(guò)與COG及KEGG進(jìn)行比對(duì)，對(duì)Wu-15基因組進(jìn)行了全面的預(yù)測(cè)，并對(duì)其關(guān)鍵基因進(jìn)行了詳細(xì)的功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量分析

2.1.1 DNA的總量

采用PROMEGA熒光定量設(shè)備進(jìn)行DNA定量分析，結(jié)果如表1所示。由表可知，經(jīng)測(cè)定Wu-15菌株DNA濃度為63.80 ng·μL-1，經(jīng)過(guò)計(jì)算，最后得出菌株Wu-15的DNA總量為3.19 μg，樣品質(zhì)量合格，總量滿足2次或者2次以上建庫(kù)需要。

表1 Picogreen熒光檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 DNA的完整性

凝膠電泳被用來(lái)檢測(cè)DNA大致的濃度，并看其是否降解、有沒(méi)有污染。結(jié)果如圖1所示，由圖可觀察到條帶單一明亮，無(wú)彌散拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明DNA沒(méi)有降解；條帶明亮、不是隱隱約約的一條線，說(shuō)明DNA濃度足夠高；膠孔處沒(méi)有出現(xiàn)彌散現(xiàn)象和條帶，說(shuō)明DNA沒(méi)有被其它蛋白和雜質(zhì)污染。

圖1 Wu-15基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 二代測(cè)序數(shù)據(jù)整理

測(cè)序數(shù)據(jù)中含有的低質(zhì)量、帶接頭的reads，這將對(duì)后續(xù)的信息分析造成很大的干擾。為了保證后續(xù)信息分析的質(zhì)量，有必要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾。數(shù)據(jù)過(guò)濾的基本情況見(jiàn)表2。

表2 數(shù)據(jù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)

2.2.2 三代測(cè)序數(shù)據(jù)整理

對(duì)三代下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表3。

表3 三代測(cè)序數(shù)據(jù)序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)

2.3 菌株Wu-15基因組的組成

2.3.1 基因組拼裝結(jié)果

裝配結(jié)果見(jiàn)表4。Wu-15菌株通過(guò)全基因組測(cè)序結(jié)果表明，Reads 總數(shù)為 13,733,028 條；堿基總數(shù)高達(dá) 4,614,006 bp；開(kāi)放閱讀框平均GC含量為56.96%，開(kāi)放閱讀框平均長(zhǎng)度為962.03 bp，開(kāi)放閱讀框總長(zhǎng)度為4 079 019 bp。有3個(gè)原噬菌體和29個(gè)基因島。

表4 基因組拼裝的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3.2 基因組圈圖

將預(yù)測(cè)信息集成到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的 GBK(GenBank)格式文件中，然后使用 cgview 繪制基因組圖[16]，最后使用 Photoshop CS 編輯圖譜。以 chr 序列為例，最終結(jié)果如圖 2所示。

圖2 Enterobacter hormaechei Wu-15基因組圈圖(chr)

由內(nèi)向外，第一圈是基因組大小的標(biāo)識(shí)，每個(gè)刻度為100 kb；第二個(gè)圓是(G-C/G+C)值，該值為正時(shí)正鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼基因，數(shù)值為負(fù)時(shí)則正好相反。第三圈代表GC含量，內(nèi)部區(qū)域表明該區(qū)域的GC含量低于基因組的平均GC含量。第四圈和第七圈是基因組正負(fù)鏈上的基因，不同顏色代表COG的不同功能分類(lèi)；第五圈和第六圈代表CDS、tRNA 和 rRNA 在基因組中的位置。

2.4 基因組注釋

進(jìn)行基因組功能注釋主要是為了分析基因的功能，從而在分子水平上刨析該物種。GO是基因本體論的縮寫(xiě)，進(jìn)行GO分析的主要目的是為了解決同一基因在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中的定義混亂和同一基因在不同物種中的定義混亂的問(wèn)題。COG數(shù)據(jù)庫(kù)全稱(chēng)是：直系同源基因簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，把某一蛋白質(zhì)與庫(kù)中的蛋白進(jìn)行比對(duì)，并將其歸入適當(dāng)?shù)腃OG分類(lèi)，對(duì)于預(yù)測(cè)蛋白功能很有用。KEGG全稱(chēng)是京都基因與基因組百科全書(shū)，它能系統(tǒng)性的分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑及該基因相關(guān)的功能。蛋白編碼基因功能注釋的概述性結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 蛋白編碼基因功能注釋概述

2.4.1 GO注釋

GO注釋由BLAST2GO軟件完成[17]。根據(jù)GO注釋方法，將其注釋結(jié)果分為3大類(lèi)(生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成)，Wu-15基因功能集中在生物過(guò)程(圖3)。在生物過(guò)程分類(lèi)水平上，129個(gè)基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，與代謝過(guò)程相關(guān)的基因有2 669個(gè)，與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因有174個(gè)，包括磷酸鹽饑餓反應(yīng)(GO:0016036)、氧應(yīng)激反應(yīng)(GO:0006979)、活性氧物種反應(yīng)(GO:0000302)等。分子功能分類(lèi)中，催化活性相關(guān)基因有2 179個(gè)，表現(xiàn)在Wu-15的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外代謝反應(yīng)，129個(gè)基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，22個(gè)基因與抗氧化活性有關(guān)；其中，與催化活性相關(guān)的GO注釋基因數(shù)量占很大比例，說(shuō)明Wu-15的分子功能主要集中催化胞內(nèi)外物質(zhì)生成、運(yùn)輸以及代謝等功能上，印證了解鹽促生菌Wu-15的特性。

圖3 Enterobacter hormaechei Wu-15的GO功能注釋

2.4.2 COG注釋

通過(guò)比較全基因組數(shù)據(jù)，把不同序列注釋到不同的COG分類(lèi)中(圖4)。其中富集基因最多的S類(lèi)有940個(gè)，然而這一部分基因功能未知，需進(jìn)一步探索。編碼蛋白質(zhì)的基因共有21類(lèi)，共4 050個(gè)基因，其中，有397個(gè)基因負(fù)責(zé)碳水化合物的運(yùn)輸和代謝，321個(gè)基因編碼氨基酸運(yùn)輸和代謝相關(guān)蛋白，319個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，說(shuō)明COG注釋的基因大多與細(xì)菌細(xì)胞的基本功能有關(guān)。此外，與細(xì)胞壁和膜形成有關(guān)的基因278個(gè)，與能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因233個(gè)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因(1.9%)，證明細(xì)菌使用了大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；與復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)的基因148個(gè)，139個(gè)與輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)的基因，64個(gè)與次生代謝物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)的基因，用于合成次生代謝物，如參與不溶性磷溶解的各種有機(jī)酸，有70個(gè)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的基因，說(shuō)明該菌株運(yùn)動(dòng)性較強(qiáng)，有利于菌株的遷移和存活；此外，Wu-15整個(gè)基因組中沒(méi)有與核質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)以及細(xì)胞骨架相關(guān)的基因。

圖4 Enterobacter hormaechei Wu-15的COG功能注釋

COG主要確定了碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、轉(zhuǎn)錄與無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)等功能，說(shuō)明菌株可以生成多種次生代謝產(chǎn)物，并能調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)鹽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而幫助植物抵抗鹽脅迫。

2.4.3 KEGG注釋

蛋白質(zhì)編碼基因的KO和pathway注釋主要由KEGG的KAAS自動(dòng)注釋系統(tǒng)完成[18]，以“原核生物”為基因集，進(jìn)行判別。KO注釋完成后，KO被映射到相應(yīng)的KEGG通路上。Wu-15的KEGG注釋主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在細(xì)胞加工過(guò)程中，與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)有關(guān)的基因有118個(gè)，與原核生物細(xì)胞群落形成有關(guān)的基因201個(gè)。在代謝過(guò)程中，有515個(gè)與碳水化合物有關(guān)的基因，292個(gè)氨基酸合成基因；在環(huán)境信息處理過(guò)程中，有307個(gè)膜運(yùn)輸相關(guān)的基因，192個(gè)與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因；在遺傳信息處理過(guò)程，有54個(gè)折疊，分類(lèi)和降解相關(guān)的基因，83個(gè)與翻譯相關(guān)的基因，90個(gè)復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因，4個(gè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因(圖5)。

圖5 Enterobacter hormaechei Wu-15的KEGG功能注釋

Wu-15菌株中被注釋最多的為與信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的基因1 052個(gè)，說(shuō)明該菌株能夠與外界進(jìn)行跨膜運(yùn)輸和能量物質(zhì)交換，印證了菌株調(diào)節(jié)離子濃度進(jìn)而應(yīng)對(duì)滲透脅迫的現(xiàn)象。

2.5 解鹽促生功能相關(guān)基因

以Wu-15全基因組測(cè)序所得序列與不同數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，之后對(duì)注釋出的基因進(jìn)行綜合比對(duì)分析，得出如下結(jié)果。

2.5.1 溶磷相關(guān)的基因

溶解土壤中不溶性磷是根際促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一種重要方式。如表6所示，本文在Wu-15菌株的基因組中鑒定了多個(gè)溶磷基因。葡萄糖酸(Gluconic acid，GA)被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)菌的主要有機(jī)酸之一，它在無(wú)機(jī)磷酸鹽的溶解中發(fā)揮了重要作用。Wu-15具有編碼GDH(葡萄糖脫氫酶)活性的基因，并含有編碼輔因子的pqq基因，包括pqqBCE，這些基因編碼的酶可以催化合成GA；菌株中含有的磷酸酶可以水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和羥基；三磷酸酶能將三磷酸分解成二磷酸和磷酸。由下表可知，Wu-15中與GA合成相關(guān)的基因有4個(gè)、酸性磷酸酶編碼基因1個(gè)、堿性磷酸酶相關(guān)基因1個(gè)、有三磷酸酶編碼基因1個(gè)。

表6 與溶磷相關(guān)基因的統(tǒng)計(jì)

2.5.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)基因

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以降低滲透勢(shì)和水勢(shì)，維持膨壓，進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。

如表7所示，在該菌株中發(fā)現(xiàn)了編碼甜菜堿醛脫氫酶和膽堿脫氫酶的基因，這兩個(gè)基因是甜菜堿合成途徑中的關(guān)鍵基因；treY/treS和treZ是海藻糖合成的關(guān)鍵基因。另外，在Wu-15中發(fā)現(xiàn)滲透保護(hù)劑結(jié)合蛋白、脯氨酸/甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還有膽堿/甘氨酸/脯氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等在滲透脅迫中發(fā)揮作用。

表7 Enterobacter hormaechei Wu-15耐鹽滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)基因統(tǒng)計(jì)

2.5.3 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因

Wu-15可以提高植物耐鹽性并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Wu-15中某些基因編碼組氨酸激酶，這些酶對(duì)K+攝取系統(tǒng)(kdp)很關(guān)鍵，而K+攝取系統(tǒng)在緩解鹽脅迫中起到重要作用[19]。轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在抵抗?jié)B透脅迫中起到重要作用，如K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Nha),其用于導(dǎo)入H+和泵出Na+，在Wu-15基因組中也被發(fā)現(xiàn)(表8)。

表8 與鹽離子相關(guān)編碼基因統(tǒng)計(jì)

2.5.4 IAA合成相關(guān)的基因

植物激素IAA是最豐富的天然植物激素，PGPR可以通過(guò)多種途徑(吲哚乙酰胺途徑、吲哚丙酮酸途徑、色胺途徑、吲哚乙腈途徑、色氨酸側(cè)鏈途徑)，并依賴(lài)色氨酸合成IAA。吲哚丙酮酸途徑被認(rèn)為是IAA生物合成的重要途徑。圖6是吲哚丙酮酸途徑合成IAA的示例圖。經(jīng)過(guò)篩選，在Wu-5基因組中發(fā)現(xiàn)ipdC基因，該基因編碼吲哚丙酮酸脫羧酶(EC:4.1.1.74)，該酶能將吲哚丙酮酸脫羧生成吲哚乙醛，這一反應(yīng)是吲哚丙酮酸途徑的限速步驟。在Gang等人的全基因組學(xué)分析中，也發(fā)現(xiàn)了吲哚丙酮酸通路中的ipdC基因[20]。

圖6 IAA合成代謝途徑

2.5.5 ACC脫氨酶編碼基因

ACC 脫氨酶(ACCD)是一種植物生長(zhǎng)激素，它能夠減少乙烯的釋放進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。在Wu-15菌株的篩選過(guò)程中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編碼ACC脫氨酶的基因ACDS，然而卻發(fā)現(xiàn)了dcyD基因，該基因編碼D-半胱氨酸脫巰基酶(D-Cdes)的生成，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)該酶的氨基酸序列與ACC脫氨酶序列高度一致，因此可以推測(cè)，Wu-15菌株中的dcyD并不是真正的特異性D-Cdes，它可能同時(shí)具有ACCD和D-CDes活性。

3 討論

根際促生菌減少了合成肥料和農(nóng)藥的大量使用，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中展現(xiàn)出不可或缺的作用。對(duì)根際促生菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)第二代和第三代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分子水平上的解釋?zhuān)U明解鹽促生基因的代謝途徑和功能，能為PGPR解鹽促生相關(guān)機(jī)制提供有效的參考數(shù)據(jù)。

土壤中的磷以不溶性磷的形式存在，難以被植物吸收和利用。溶磷微生物是一類(lèi)能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用形式的微生物[21]。溶磷菌的溶磷機(jī)制因菌株不同而有所差異，目前，更多的研究集中在磷酸酶、氫質(zhì)子和有機(jī)酸分泌方面[22]。本文在Wu-15菌株中鑒定了多個(gè)相關(guān)基因，如aphA，其能編碼酸性磷酸酶的產(chǎn)生，而酸性磷酸酶可以從不同的有機(jī)磷底物上水解磷酸基團(tuán)，供植物吸收利用；ygiF產(chǎn)生三磷酸酶；gcd編碼的葡萄糖脫氫酶GDH及其輔因子可以催化葡萄糖酸合成，這些物質(zhì)都在菌株的溶磷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

脯氨酸、多糖、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物對(duì)鹽堿脅迫反應(yīng)的敏感指標(biāo)，PGPR通過(guò)分泌這些滲透調(diào)節(jié)劑來(lái)增強(qiáng)植物的抗鹽堿性[23]。在Wu-15菌株中篩選滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)了編碼甜菜堿醛脫氫酶和膽堿脫氫酶的基因，這些基因在甜菜堿的形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。此外，Wu-15中發(fā)現(xiàn)了麥芽低聚糖海藻糖合酶和麥芽低聚糖海藻糖水解酶的編碼基因，水解酶在(1→4)-α-D-葡萄糖苷與海藻糖之間的糖苷鍵發(fā)生作用，催化海藻糖(1→4)-α-D-葡聚糖的生成；麥芽糖α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶由treS編碼，該酶能將麥芽糖轉(zhuǎn)化為α-海藻糖，這些酶促反應(yīng)在海藻糖合成過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。

鹽脅迫擾亂了細(xì)胞內(nèi)離子的穩(wěn)態(tài)并減慢植物的新陳代謝，過(guò)量的Na+/K+會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞缺水、膜功能障礙和離子毒性等[24]。因此，植物正常的細(xì)胞功能和生長(zhǎng)發(fā)育中需維持低水平的Na+/K+濃度。從堿性土壤中分離的D5A菌株全基因組中發(fā)現(xiàn)了幾種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和激酶kdpD/kdpE，其能幫助植物緩解鹽脅迫[25]。前期試驗(yàn)表明，Wu-15能顯著降低根對(duì)Na+的吸收，緩解植物所受到的鹽脅迫,因此探究菌株Wu-15逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因，在Wu-15基因組中發(fā)現(xiàn)了編碼K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等相關(guān)基因，這些基因被用來(lái)導(dǎo)入H+和泵出Na+，這些基因的發(fā)現(xiàn)從分子水平證實(shí)了Wu-15解鹽促生功能(表7)。

合成IAA是許多根際促生菌的特性。以色氨酸為前體的IAA的合成可分為5類(lèi)：吲哚乙腈、色胺、色氨酸側(cè)鏈氧化酶、吲哚-3-丙酮酸和吲哚乙酰胺。細(xì)菌可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)途徑合成IAA。在吲哚-3-丙酮酸(IpyA)途徑[26]中，色氨酸首先氧化脫氨形成吲哚丙酮酸，然后吲哚丙酮酸經(jīng)過(guò)吲哚丙酮酸脫羧酶的作用形成吲哚乙醛，最后再氧化為IAA。基因ipdC(吲哚丙酮酸脫羧酶EC:4.1.1.74)被發(fā)現(xiàn)在Wu-15全基因組中，ipdC是吲哚丙酮酸途徑合成吲哚乙酸的關(guān)鍵基因，說(shuō)明菌株Wu-15可能通過(guò)IpyA途徑合成IAA，不過(guò)還需要實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

ACC 脫氨酶可以降解乙烯的前體物質(zhì) ACC，生成氨和羥基丁酸，減少植物體乙烯數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。McDonnell等人發(fā)現(xiàn)了編碼d-半胱氨酸脫硫酶的At1g48420基因具有ACC脫氨酶活性[27]。經(jīng)過(guò)篩選，在Wu-15菌株中發(fā)現(xiàn)了chr_2553，該基因編碼d-半胱氨酸脫硫酶，然而前期的實(shí)驗(yàn)鑒定出該菌株有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力，所以推測(cè)該基因可能也具有ACC脫氨酶活性。

4 結(jié)論與展望

本研究用BLAST比對(duì)方法從分子水平成功挖掘了EnterobacterhormaecheiWu-15與植物耐鹽性相關(guān)的功能基因，其中包括溶磷相關(guān)基因7個(gè)、滲透調(diào)節(jié)物相關(guān)基因14個(gè)、反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因6個(gè)、IAA合成相關(guān)基因ipdC、ACC脫氨酶相關(guān)基因dcyD，本研究從分子生物學(xué)角度探究了根際促生菌，為菌株的實(shí)際應(yīng)用提供了有價(jià)值的基因數(shù)據(jù)，也為解鹽促生菌進(jìn)一步的優(yōu)化改良奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。