劉丹青，金玉環(huán)，郭力，李永光，黃先忠,2*

(1 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2 安徽科技學(xué)院/農(nóng)學(xué)院，作物生物技術(shù)中心，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

由于固定生長(zhǎng)的特點(diǎn)，植物極度依賴其所在的生存環(huán)境，因此環(huán)境因素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響[1]。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)是一類重要的調(diào)控子，一般通過(guò)結(jié)合在脅迫相關(guān)基因的順式作用元件，參與植物對(duì)干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫的響應(yīng)[2]。CONSTANS(CO)和FLOWERINGLOCUST(FT)是擬南芥(Arabidopsisthaliana)光周期途徑的重要的轉(zhuǎn)錄因子[3]。在長(zhǎng)日誘導(dǎo)條件下，AtCO誘導(dǎo)FT在葉片中的表達(dá)[4]。CO基因在進(jìn)化時(shí)通過(guò)基因復(fù)制產(chǎn)生兩個(gè)及以上的拷貝，形成COL(CONSTANS-like)基因家族[5]。COL基因?qū)儆谥参顱BX轉(zhuǎn)錄因子家族，N端有1或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域，主要參與蛋白互作；C末端含有由43個(gè)氨基酸組成的CCT(CO,CO-like,TOC1)結(jié)構(gòu)域，主要參與CO蛋白的核定位[6-7]。除了B-box和CCT結(jié)構(gòu)域外，一些COL蛋白的近C末端還包含一個(gè)纈氨酸-脯氨酸(VP)基序(-I/V-V-P-S/T-F)[7]。COL基因家族的鋅指結(jié)構(gòu)域的核酸多樣性顯著高于CCT結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化過(guò)程中B-box結(jié)構(gòu)變異較大，而CCT結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中非常保守[8]。

根據(jù)B-box的數(shù)量和保守性，可以將擬南芥CO基因家族的17個(gè)成員劃分成3個(gè)亞組。亞組Ⅰ包括CO、COL1、COL2、COL3、COL4和COL5基因，這組基因在N端含有2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)；亞組Ⅱ包括COL6、COL7、COL8和COL16基因，近N端只有1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)；亞組Ⅲ包括COL9、COL10、COL11、COL12、COL13、COL14和COL15基因，含有1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)和1個(gè)保守性較低的鋅指結(jié)構(gòu)域[5]。

COL家族基因通過(guò)光周期途徑整合晝夜節(jié)律以及光信號(hào)相關(guān)基因來(lái)調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間，在調(diào)控植物開(kāi)花過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。過(guò)表達(dá)AtCOL7和AtCOL12調(diào)節(jié)擬南芥的開(kāi)花時(shí)間[10-11]。OsCOL10、OsCOL13、OsCOL15和OsCOL16對(duì)水稻開(kāi)花有調(diào)控作用[12-15]。此外，COL家族基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、影響植株的形態(tài)發(fā)育以及響應(yīng)多種非生物脅迫。例如，AtCOL3促進(jìn)側(cè)根發(fā)育[16]，擬南芥AtCOL4通過(guò)ABA依賴途徑正向調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[17]。香蕉(MusaacuminataL.)MaCOL1參與了果實(shí)的成熟[18]。

近年來(lái)，對(duì)擬南芥近緣種的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，而新疆是擬南芥近緣種的分布中心。小鼠耳芥(Arabidopsispumila)屬于十字花科鼠耳芥屬早春短命植物，廣泛分布于新疆，具有體型小，生長(zhǎng)周期短，后代多等特點(diǎn)[19-20]。新疆小鼠耳芥具備光合作用強(qiáng)，繁殖率高，抗逆能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是研究生物與環(huán)境相適應(yīng)機(jī)制理想的材料。本研究以小鼠耳芥為對(duì)象，完成了ApCOL轉(zhuǎn)錄因子家族在全基因組水平上的鑒定以及響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)分析，為進(jìn)一步探究小鼠耳芥ApCOL蛋白功能及遺傳應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

本研究中所用到的小鼠耳芥種子為本實(shí)驗(yàn)保存。小鼠耳芥種子滅菌和植株室內(nèi)的培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[19]中的方法。

首先將小鼠耳芥種子滅菌后播撒在1/2 MS培養(yǎng)基平板上，于4 ℃冰箱春化2～3 d，然后置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16 h光照，8 h黑暗，光照強(qiáng)度200 μmol·m-2·s-1)，待長(zhǎng)出2～3片真葉后，將幼苗移栽至含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(1∶1)的盆缽中，放置于植物生長(zhǎng)間培養(yǎng)。PEG脅迫處理：將生長(zhǎng)30 d的小鼠耳芥幼苗培養(yǎng)在15% PEG6000的營(yíng)養(yǎng)液中，分別在0、12、24、48 h取樣并立即置于液氮速凍，-80 ℃保存以備提取RNA。

1.2 小鼠耳芥COL基因家族的全基因組鑒定與理化性質(zhì)分析

從TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)下載擬南芥的基因組信息文件(包括DNA序列文件、CDS序列文件、蛋白質(zhì)序列文件和gff3文件)，小鼠耳芥全基因組數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室提供(數(shù)據(jù)暫未公開(kāi))。從Pfam 33.1數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)中下載CCT(PF06203.15)和zinc finger B-box(PF00643.25)的保守結(jié)構(gòu)域模型，利用該模型在HMMER3.0軟件中對(duì)基因組功能注釋的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行本地化檢索，最高e值設(shè)為1×10-10。將得到的同源核苷酸序列分別通過(guò)Pfam(E-value=0.001)以及SMART數(shù)據(jù)庫(kù)(http://smart.embl-heidelberg.de/)檢驗(yàn)其是否同時(shí)具有CCT和zf-B_box結(jié)構(gòu)域[5,7]。

利用在線網(wǎng)站ExPASy Proteomics Server(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)ApCOL氨基酸序列進(jìn)行分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用Cell-Ploc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)ApCOL蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 小鼠耳芥COL基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

利用perl程序解析小鼠耳芥基因組數(shù)據(jù)的gff3文件，選取ApCOL基因的結(jié)構(gòu)信息和染色體位置信息，并利用在線網(wǎng)站MapGene2Chromosome v2(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)和GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行染色體定位分析和基因結(jié)構(gòu)作圖。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建與蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)分析

采用MEGA X軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建COL基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1 000次循環(huán)[21]，構(gòu)建擬南芥和小鼠耳芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。并將進(jìn)化樹(shù)文件導(dǎo)入在線網(wǎng)站iTOL(https://itol.embl.de/)進(jìn)行調(diào)整。根據(jù)COL蛋白的結(jié)構(gòu)特性，利用ClustalX1.8(https://www.onlinedown.net/soft/38221.htm)分析擬南芥和小鼠耳芥COL氨基酸序列比對(duì)，結(jié)合GeneDoc(https://genedoc.software.informer.com/)調(diào)整并繪制COL氨基酸序列比對(duì)圖。

1.5 小鼠耳芥與擬南芥COL基因的共線性分析

使用Perl腳本標(biāo)記每個(gè)COL基因在染色體上的位置，利用TBtools的one step MCScanX獲取COL基因家族物種間的共線性關(guān)系[22]。使用OrthoVenn2(https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home)鑒定小鼠耳芥與擬南芥之間的直系同源基因。利用Circos(http://circos.ca/software/)對(duì)2個(gè)十字花科植物間的共線基因?qū)椭毕低椿驅(qū)M(jìn)行作圖。

1.6 ApCOL基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分布

檢索小鼠耳芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，提取每個(gè)ApCOL基因起始密碼子上游的2 000 bp區(qū)域作為啟動(dòng)子序列信息，通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)ApCOL啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。并將預(yù)測(cè)結(jié)果整理篩選出順式作用元件，并利用Gene Structure Display Server(http://gsds.gao-lab.org/)進(jìn)行可視化分析。

1.7 總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

以小鼠耳芥葉為材料，使用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒提取小鼠耳芥所取材料的總RNA。使用M-MLV(H-)Reverse transcriptase試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR按照Fast SYBR Mixture試劑盒(康為世紀(jì))操作，反應(yīng)在Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-time PCRSystem(ABI,Foster City,CA,USA)上進(jìn)行。此外，本實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立性重復(fù)操作。采用Primer 3.0軟件(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)候選基因的qRT-PCR特異性引物(表1)，以小鼠耳芥ApGAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算候選基因相對(duì)表達(dá)量[23]。利用Excel 2019和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性檢驗(yàn)[24]，采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)候選基因的定量結(jié)果進(jìn)行柱形圖分析[25]。

表1 本研究qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠耳芥COL家族基因的鑒定及染色體分布

以Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中PF06203和PF00643為參照，在小鼠耳芥中鑒定出34個(gè)COL基因家族成員，并根據(jù)每個(gè)ApCOL與擬南芥CO和COL的相似程度為其命名(表2)。ApCOL氨基酸數(shù)目在290～435之間，分子量介于31.67～47.96 kDa，理論等電點(diǎn)在4.8～8.3之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，34個(gè)ApCOL蛋白均位于細(xì)胞核內(nèi)。染色體圖譜顯示，34個(gè)ApCOL不均勻地分布在14條染色體上，每條染色體上有1～4個(gè)基因，各染色體的分布比例為2.94～11.76%(圖1)。其中Chr1、Chr3、Chr4、Chr6、Chr7和Chr8染色體上均含有3個(gè)ApCOL基因，Chr2、Chr9、Chr10、Chr14和Chr15染色體各含有2個(gè)ApCOL基因，Chr5和Chr11染色體有1個(gè)ApCOL基因，Chr13染色體含有4個(gè)ApCOL基因。

表2 小鼠耳芥COL基因家族簡(jiǎn)況

紅色虛線連接著ApCOL復(fù)制基因?qū)Α?/p>

2.2 小鼠耳芥COL基因家族分類與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為鑒定34個(gè)ApCOL和17個(gè)AtCOL的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，借助MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化分析結(jié)果顯示小鼠耳芥和擬南芥的51個(gè)COL基因家族可分為3個(gè)亞組(Ⅰ～Ⅲ)，其中最大的類群是亞組Ⅲ(21個(gè)成員)，亞組Ⅰ含有18個(gè)COL基因，亞組Ⅱ含有12個(gè)成員(圖2)。小鼠耳芥和擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，小鼠耳芥COL基因家族成員在擬南芥中均有分枝，這也說(shuō)明了兩個(gè)物種中COL家族基因具有很大的同源性。

圖2 擬南芥和小鼠耳芥COL家族成員構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 ApCOL家族基因結(jié)構(gòu)、基序及保守結(jié)構(gòu)域分析

為了解ApCOL基因家族的結(jié)構(gòu)，根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(圖3A)，利用GSDS構(gòu)建小鼠耳芥ApCOL家族基因的結(jié)構(gòu)，比較ApCOL外顯子和內(nèi)含子(圖3B)。ApCOL基因中存在2～4個(gè)外顯子和1～3個(gè)內(nèi)含子(圖3B)。分析發(fā)現(xiàn)，亞組Ⅰ的12個(gè)ApCOL基因和亞組Ⅱ的8個(gè)ApCOL基因高度保守，均含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，亞組Ⅲ中的ApCOL11.1和ApCOL11.2含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，而另外12個(gè)ApCOL基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)域注釋和多個(gè)氨基酸序列比對(duì)表明(圖3C)，亞組I的ApCOL包含一個(gè)B-box 1、一個(gè)B-box 2、一個(gè)附加的VP基序和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域。

圖3 小鼠耳芥COL基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和結(jié)構(gòu)

其中B-box 1結(jié)構(gòu)域位于N端由半胱氨酸組成的保守性較高的鋅指結(jié)構(gòu)域；B-box 2的保守性低于B-box 1；VP基序距離CCT結(jié)構(gòu)域約16～20個(gè)氨基酸殘基；CCT結(jié)構(gòu)域位于C末端由43個(gè)氨基酸組成[5]。但ApCOL5.1和ApCOL5.2的B-box 1結(jié)構(gòu)發(fā)生了氨基酸序列丟失的現(xiàn)象(圖4 A)。

亞組II中的8個(gè)ApCOL僅有1個(gè)B-box 1結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域，其中ApCOL7.2的B-box 1結(jié)構(gòu)不完整(圖4B)。亞組III組14個(gè)ApCOL均含有1個(gè)B-box 1結(jié)構(gòu)域、1個(gè)保守性較低的鋅指結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域(圖4C)。

A：亞組Ⅰ，B：亞組Ⅱ，C：亞組Ⅲ。

2.4 小鼠耳芥和擬南芥COL基因成員的共線性分析

物種間共線性區(qū)域是不同物種中一些在位置上靠近的基因共同從同一個(gè)祖先基因組中進(jìn)化而來(lái)。為進(jìn)一步研究COL的進(jìn)化關(guān)系，鑒定了2種十字花科植物小鼠耳芥和擬南芥之間的COL基因，在小鼠耳芥和擬南芥之間總共有30對(duì)共線性基因(圖5)，其中22對(duì)是小鼠耳芥與擬南芥之間的直系同源基因，說(shuō)明小鼠耳芥和擬南芥的關(guān)系較近。此外，8個(gè)ApCOL(ApCO1、ApCOL1.2、ApCOL9.1、ApCOL9.2、ApCOL10.1、ApCOL11.2、ApCOL12.1和ApCOL12.2)與擬南芥AtCOL不存在共線關(guān)系。

At1-5為擬南芥的染色體編號(hào)；Ap1-16為小鼠耳芥的染色體編號(hào)；綠線和紅線連接擬南芥和小鼠耳芥之間的共線性基因?qū)Γ患t線連接小鼠耳芥和擬南芥之間的直系同源基因?qū)Α?/p>

2.5 小鼠耳芥中COL基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為解析小鼠耳芥COL基因家族成員的調(diào)控模式，進(jìn)一步分析了小鼠耳芥的ApCOL基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分布，采用其轉(zhuǎn)錄起始位置上游2 000 bp序列在PlantCARE網(wǎng)站查找各類順式作用元件(圖6)。順式作用元件分析結(jié)果表明，ApCOL基因家族含有較多的光響應(yīng)、激素應(yīng)答、脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)的元件(圖6A)。34個(gè)小鼠耳芥COL家族基因共含有27種光信號(hào)響應(yīng)元件，例如：G-Box、Box 4、TCT-motif、GT1-motif、GATA-motif、AE-box、ATCT-motif、I-box、circadian、MRE等順式作用元件。其中ApCOL12.1的光信號(hào)元件數(shù)量最多，共有27個(gè)，而ApCOL4.2僅含有4個(gè)光信號(hào)元件(圖6A)，說(shuō)明ApCOL家族成員的啟動(dòng)子具有光誘導(dǎo)的特性，可能參與光周期調(diào)控途徑。其次，ApCOL基因啟動(dòng)子區(qū)域存在大量激素應(yīng)答和脅迫響應(yīng)元件(圖6B)，例如低溫響應(yīng)元件(LTR)、抗氧化響應(yīng)元件(ARE)、防御與脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(TGA-element、AuxRR-core、TGA-box和AuxRE)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、赤霉素響應(yīng)元件(P-box、GARE-motif和TATC-box)、水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif)(表3)。15個(gè)ApCOL基因(ApCO1、ApCO2、ApCOL1.1、ApCOL1.2、ApCOL3.1、ApCOL4.2、ApCOL5.1、ApCOL6.1、ApCOL8.1、ApCOL11.2、ApCOL12.1、ApCOL14.2、ApCOL15.2、ApCOL16.1和ApCOL16.2)共含有20個(gè)干旱響應(yīng)元件(MBS)，提示ApCOL基因在干旱脅迫中可能具有重要功能(圖6B)。

A—統(tǒng)計(jì)ApCOL基因順式作用元件B—激素應(yīng)答和脅迫響應(yīng)順式作用元件的分布圖

表3 ApCOL啟動(dòng)子順式作用元件

2.6 ApCOL在干旱脅迫下的表達(dá)模式

為了揭示COL家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，利用15%滲透壓PEG溶液(PEG6000)模擬干旱脅迫，本研究對(duì)14個(gè)ApCOL基因在PEG脅迫下的基因表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，PEG模擬干旱脅迫促進(jìn)大多數(shù)ApCOL基因發(fā)生的差異表達(dá)(圖7)。ApCO1、ApCO2、ApCOL1.1和ApCO1.2在PEG脅迫下的表達(dá)量不同，但是其表達(dá)趨勢(shì)完全一致，ApCO1、ApCO2、ApCOL1.1和ApCO1.2表達(dá)量均在PEG脅迫處理48 h后出現(xiàn)峰值，分別為對(duì)照的6.39、11.23、7.81和3.98倍。ApCOL2.1在PEG脅迫處理12和24小時(shí)后顯著上調(diào)37.57%和28.42%，48 h較對(duì)照顯著下調(diào)20.88%；ApCOL2.2在PEG處理12和48 h較對(duì)照分別顯著上調(diào)29.75%和56.04%。ApCOL8.1和ApCOL8.2表達(dá)量均在PEG脅迫處理24 h后顯著下調(diào)，較對(duì)照分別下調(diào)33.43%和45.90%；其中PEG脅迫處理48 h，ApCOL8.2表達(dá)量較對(duì)照顯著上調(diào)61.11%，而ApCOL8.1在48 h表達(dá)量與對(duì)照無(wú)顯著差異。ApCOL11.1和ApCOL11.2在PEG脅迫處理12和24 h出現(xiàn)下調(diào)，而在處理48 h較對(duì)照顯著上調(diào)1751.37%和1491.15%。ApCOL13.1在PEG處理24和48 h出現(xiàn)顯著性峰值，較對(duì)照分別上調(diào)56.30%和207.56%；與ApCOL13.1相比，ApCOL13.2在PEG脅迫下的表達(dá)水平均較低，但是其表達(dá)趨勢(shì)與ApCOL13.1相似，ApCOL13.2在處理24和48 h較對(duì)照分別顯著上調(diào)19.25%和12.62%。與對(duì)照相比，ApCOL16.1和ApCOL16.2在PEG處理各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，ApCOL16.1分別下調(diào)58.42%、36.05%和80.89%，ApCOL16.2分別下調(diào)74.81%、53.31%和91.40%。此外，除了ApCOL2.1/2.2和ApCOL13.1/13.2外，其它復(fù)制基因?qū)憫?yīng)PEG脅迫的表達(dá)特征相似，由此表明，在PEG模擬干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中，ApCOL復(fù)制基因?qū)χg對(duì)響應(yīng)干旱脅迫的模式存在相似性和特異性，進(jìn)一步說(shuō)明干旱脅迫調(diào)控小鼠耳芥ApCOL家族基因的表達(dá)。此外，小鼠耳芥ApCOL響應(yīng)干旱處理的表達(dá)模式分析結(jié)果有助于篩選重要候選功能基因，ApCOL基因的干旱響應(yīng)功能及作用機(jī)制有待深入研究探討。

小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平有顯著性差異。

3 討論

隨著植物基因組研究的深入，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物基因表達(dá)的研究為現(xiàn)今植物基因功能研究的熱點(diǎn)之一。隨著多種物種基因組測(cè)序的完成，許多植物的COL基因家族成員及大小已得到分析，其中擬南芥、水稻(Oryzasativa)、葡萄(Vitisvinifera)、白菜(Brassicapekinensis)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)中分別含有17、16、12、25、42個(gè)COL基因。本研究利用最新組裝的小鼠耳芥全基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定34個(gè)小鼠耳芥COL家族基因(12個(gè)亞組Ⅰ，8個(gè)亞組Ⅱ，14個(gè)亞組Ⅲ)。結(jié)果顯示小鼠耳芥COL家族基因數(shù)量遠(yuǎn)多于擬南芥COL基因的數(shù)量。

染色體定位結(jié)果顯示，34個(gè)ApCOL基因不均勻地分布于小鼠耳芥的14條染色體上。內(nèi)含子和外顯子的組成可為基因在進(jìn)化分析研究中提供重要證據(jù)，同一亞組間的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度相似，說(shuō)明進(jìn)化中位于同一亞組ApCOL蛋白質(zhì)的外顯子數(shù)目、長(zhǎng)度以及內(nèi)含子相位是相對(duì)保守的。這一結(jié)果表明這些基因可能具有相同的固定剪接模式，而個(gè)別ApCOL蛋白質(zhì)的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)發(fā)生異化的現(xiàn)象，可能是在進(jìn)化過(guò)程中基因功能發(fā)生了分化所導(dǎo)致的。相似性極高的基因結(jié)構(gòu)與序列說(shuō)明了小鼠耳芥COL基因進(jìn)化的高度保守性，且不同亞組間的ApCOL基因一定程度上具有結(jié)構(gòu)多樣性。說(shuō)明COL基因家族進(jìn)化過(guò)程中，COL基因結(jié)構(gòu)的多樣性保證了一些新功能基因的出現(xiàn)。此外，小鼠耳芥與擬南芥的共線性分析表明，兩種十字花科植物間COL直系同源基因間存在著較為復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系。順式作用元件對(duì)于基因表達(dá)是必不可少的，其數(shù)量與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。啟動(dòng)子順式作用元件檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ApCOL基因上游存在多種光響應(yīng)元件，以及參與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、激素調(diào)控和逆境脅迫的順式調(diào)控元件，說(shuō)明ApCOL家族成員可能通過(guò)參與不同的信號(hào)通路在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境脅迫中發(fā)揮作用。

非生物脅迫的調(diào)控機(jī)制依賴于大量脅迫相關(guān)基因的激活和調(diào)控[26]。Ghd2是一種水稻COL基因，Ghd2能促進(jìn)發(fā)育和黑暗誘導(dǎo)的衰老，通過(guò)加速干旱誘導(dǎo)的葉片衰老，賦予水稻對(duì)干旱的敏感性[27]。通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)ApCOL16.1和ApCOL16.2表達(dá)水平受干旱脅迫處理表達(dá)水平明顯降低。而12個(gè)ApCOL(ApCO1、ApCO2、ApCOL1.1、ApCOL1.2、ApCOL2.1、ApCOL2.2、ApCOL8.1、ApCOL8.2、ApCOL11.1、ApCOL11.2、ApCOL13.1和ApCOL13.2)基因在干旱脅迫處理表達(dá)水平顯著上升，表明這些基因都是潛在的干旱脅迫相關(guān)基因，在非生物脅迫的調(diào)控過(guò)程中可能扮演重要的角色。研究結(jié)果為更深入和全面的解析短命植物小鼠耳芥響應(yīng)非生物脅迫下的調(diào)節(jié)機(jī)制及適應(yīng)荒漠環(huán)境生存及發(fā)育的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究分析了小鼠耳芥基因組中ApCOL基因家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件、染色體分布以及共線分析，推測(cè)了小鼠耳芥ApCOL基因家族成員數(shù)量的進(jìn)化歷程。利用qRT-PCR對(duì)小鼠耳芥ApCOL家族基因在PEG模擬干旱脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，初步分析了ApCOL家族基因的功能，為進(jìn)一步探究ApCOL蛋白功能及遺傳應(yīng)用提供理論依據(jù)。