張晨磊

天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 (天津 301800)

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種結(jié)合化學(xué)發(fā)光和免疫分析的檢測(cè)方法，不僅操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，而且具備較高的檢測(cè)靈敏度與特異度。近年來，化學(xué)發(fā)光免疫分析法被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷、環(huán)境檢測(cè)與食品檢測(cè)等領(lǐng)域，均取得了較好的應(yīng)用效果。1977年，化學(xué)發(fā)光免疫分析法被首次提出，至今已發(fā)展了40余年，檢測(cè)體系趨于成熟[1]。但在實(shí)際臨床應(yīng)用過程中，檢測(cè)數(shù)量眾多、成分復(fù)雜或低豐度的樣品時(shí)，常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析法往往無法達(dá)到預(yù)期的效果，故需對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行優(yōu)化，以提升其檢測(cè)效果。本文旨在綜述新型化學(xué)發(fā)光免疫分析法及其與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的現(xiàn)狀，并展望化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究前景。

1 新型化學(xué)發(fā)光免疫分析法(納米粒子)

以往的常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析法雖可滿足一般檢測(cè)需求，但在實(shí)際應(yīng)用過程中，仍有可能出現(xiàn)特異度不足以及信噪比不高等情況[2]。近年來，基于納米粒子發(fā)展而來的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析法取得了較好的進(jìn)展，使檢測(cè)效果得以有效提升，各類納米粒子的引入可縮短檢測(cè)時(shí)間、降低背景干擾值、提升檢測(cè)的靈敏度及特異度等，常用的納米粒子包括磁性納米粒子、金納米粒子等。

1.1 磁性納米粒子

磁性納米粒子是指可均勻分散于一定基液中的膠態(tài)復(fù)合材料，具有超順磁性、較高的比表面積、可修飾功能基團(tuán)等特性。常用的磁性物質(zhì)有純鐵粉、羰基鐵、磁鐵礦、正鐵酸鹽等,其粒徑一般在10～100 nm。在開展免疫分析的過程中，分離抗原-抗體免疫復(fù)合物通常需耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，且操作步驟煩瑣。將磁性微粒引入化學(xué)發(fā)光免疫分析法中，使其成為免疫反應(yīng)和分離的固相載體，是加速抗原-抗體免疫復(fù)合物分離的有效措施。磁性微粒與抗體相連后，通過免疫反應(yīng)即可捕獲靶物質(zhì)，由此形成免疫復(fù)合物，受外加磁場(chǎng)作用后，免疫復(fù)合物便會(huì)發(fā)生滯留，進(jìn)而達(dá)到分離的效果，同時(shí)，還可降低樣品中基質(zhì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生的干擾。目前，基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析法在癌胚抗原、甲胎蛋白、皮質(zhì)醇等物質(zhì)的檢測(cè)中已得到了廣泛的應(yīng)用[3]。有研究報(bào)道，在對(duì)人血清前列腺特異抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，相較于化學(xué)發(fā)光免疫分析法，應(yīng)用基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，不但能減少約50%的反應(yīng)試劑用量，還可縮短反應(yīng)時(shí)間，降低背景值，提高靈敏度[4]。

在基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析法中，磁性微粒的表面修飾有利于提高檢測(cè)效率，其不僅可直接修飾抗體，還可應(yīng)用于鏈霉親和素放大體系、異硫氰酸熒光素的異硫氰酸熒光素-抗異硫氰酸熒光素體系。有研究報(bào)道，在對(duì)磁性微粒進(jìn)行修飾時(shí)，首先應(yīng)用聚醚酰亞胺，其次應(yīng)用戊二醛，將其與抗體進(jìn)行連接，可加大磁性微粒和抗體間的距離，從而減少免疫反應(yīng)時(shí)存在的空間位阻[5]。

1.2 金納米粒子

在實(shí)施化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)時(shí)，金納米粒子可對(duì)魯米諾發(fā)光體系內(nèi)自由基的產(chǎn)生與電子轉(zhuǎn)移起到催化作用，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。有學(xué)者分析了金納米粒子在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的作用，發(fā)現(xiàn)金納米粒子的引入可使魯米諾發(fā)光體系內(nèi)發(fā)光反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度提升4倍以上，表明金納米粒子可催化魯米諾發(fā)光反應(yīng)[6]。有研究指出，應(yīng)用酶標(biāo)記抗體修飾金納米粒子后，將其用作反應(yīng)抗體來檢測(cè)癌胚抗原，其靈敏度較常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析法提升了3個(gè)數(shù)量級(jí)[7]。由此可知，金納米粒子的應(yīng)用不僅可促進(jìn)自由基的產(chǎn)生及電子轉(zhuǎn)移，而且可作為信號(hào)放大載體，增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)[8]。

2 與其他技術(shù)的聯(lián)合

除了納米粒子外，與其他技術(shù)的聯(lián)合也可提高化學(xué)發(fā)光分析法的檢測(cè)性能。

2.1 與化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的聯(lián)合

化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是指受到供體基團(tuán)的激發(fā)作用后，將一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量由供體轉(zhuǎn)移至受體，轉(zhuǎn)移時(shí)無光子介入，不會(huì)出現(xiàn)輻射反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的信號(hào)背景值明顯低于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，可提高檢測(cè)的靈敏度，但能量轉(zhuǎn)移效率較低[9]。為解決這一問題，很多學(xué)者為選擇合適的能量受體開展了相關(guān)的研究。其中，以金納米粒子為首選，有學(xué)者在檢測(cè)甲胎蛋白時(shí)，將辣根過氧化酶催化的魯米諾發(fā)光體系作為能量供體，金納米粒子作為能量受體，甲胎蛋白不同的抗原表位的抗體分別與辣根過氧化酶及金納米粒子進(jìn)行結(jié)合，開展雙抗夾心反應(yīng)，通過結(jié)合2種抗原表位的抗體，達(dá)到共振能量轉(zhuǎn)移的目的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的效率與納米粒子的直徑密切相關(guān)，相較于直徑為20 nm的金納米粒子，直徑為40 nm的金納米粒子具備更高的轉(zhuǎn)移效率，考慮主要是由于后者具備更大的消光系數(shù)，且具有更大的表面積，可修飾更多的抗體[10]。為提高能量轉(zhuǎn)移效率，部分碳納米材料也被應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移中，如石墨烯、氧化石墨烯等，同時(shí)被證實(shí)為化學(xué)發(fā)光的超級(jí)受體。

2.2 與微陣列芯片技術(shù)的聯(lián)合

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異度的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。微陣列芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物(如玻片、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子反應(yīng)，通過特定的儀器，如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)快速、并行、高效地檢測(cè)分析反應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。有學(xué)者在硅烷化的玻璃微陣列芯片上實(shí)施化學(xué)發(fā)光免疫分析，各檢測(cè)孔內(nèi)放置待檢測(cè)物的對(duì)應(yīng)抗體，并引入金納米粒子，達(dá)到催化的效果，用于同時(shí)檢測(cè)甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)與糖類抗原153(Carbohydrate antigen 153，CA153)蛋白，結(jié)果顯示，在48 min內(nèi)，48個(gè)樣品檢測(cè)工作全部完成，同時(shí)金納米粒子的介入提升了信號(hào)強(qiáng)度，達(dá)到了高靈敏度及高通量檢測(cè)的目的[11]。也有研究者在硅烷化的玻璃芯片上應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)癌胚抗原及糖類抗原199(Carbohydrate antigen 199，CA199)蛋白，亦取得了不錯(cuò)的效果[12]。由此可見，微陣列芯片技術(shù)是實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析高通量檢測(cè)的重要技術(shù)。

2.3 與免疫層析技術(shù)的聯(lián)合

免疫層析法的原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，基于毛細(xì)現(xiàn)象，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異度結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異的免疫診斷。有學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法與免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)沙丁胺醇與萊克多巴胺，首先，在層析膜的結(jié)合區(qū)固定酶標(biāo)萊克多巴胺抗體與沙丁胺醇抗體，然后，在2個(gè)檢測(cè)區(qū)對(duì)沙丁胺醇-牛血清白蛋白與萊克多巴胺-牛血清白蛋白進(jìn)行固定，再將樣品滴加至硝酸纖維素膜一端后，隨著樣品的流動(dòng)進(jìn)入到固定有抗體的結(jié)合區(qū)，使樣品內(nèi)存在的抗原與抗體結(jié)合，過量未發(fā)生結(jié)合的酶標(biāo)抗體則會(huì)繼續(xù)流動(dòng)，進(jìn)入到檢測(cè)區(qū)位置，分別結(jié)合沙丁胺醇-牛血清白蛋白與萊克多巴胺-牛血清白蛋白，上述整個(gè)檢測(cè)過程不超過20 min，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度相對(duì)較快[13]。

2.4 與流動(dòng)注射技術(shù)的聯(lián)合

基于流動(dòng)注射技術(shù)的化學(xué)發(fā)光免疫分析法已在臨床廣泛應(yīng)用，多通道噴墨式微量給樣可提升聚二甲基硅氧烷聚合作用，在多孔玻璃上開微孔反應(yīng)器，孔洞直徑為1.5 mm，來實(shí)施免疫反應(yīng)與發(fā)光檢測(cè)，該技術(shù)不僅可減少樣品用量，而且具備極高的檢測(cè)靈敏度。以免疫球蛋白A作為檢測(cè)樣本時(shí)，其可取得0.1 ng/ml的檢測(cè)下限，明顯低于微孔板的0.86 ng/ml[14]。根據(jù)微孔反應(yīng)器具備的微陣列模式，通過增加給樣通道可實(shí)現(xiàn)多組分的微量檢測(cè)。

3 結(jié)論與展望

隨著研究的不斷深入，各種新型化學(xué)發(fā)光免疫分析法以及化學(xué)發(fā)光免疫分析法與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可有效提升化學(xué)發(fā)光免疫分析法的靈敏度及特異度，并實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測(cè)。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，化學(xué)發(fā)光免疫分析法仍存在不足，如儀器體積較大，檢測(cè)結(jié)果可能受到樣品基質(zhì)的影響，檢測(cè)小分子的精密度受限等[15]。為進(jìn)一步提高化學(xué)發(fā)光免疫分析法的檢測(cè)效果，臨床仍需開展更多的試驗(yàn)研究，如降低化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)儀器的成本，縮小儀器體積，使其更便于攜帶；強(qiáng)化處理檢測(cè)樣本基質(zhì)的能力，提高檢測(cè)穩(wěn)定性；進(jìn)一步完善多通道以及多組分的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)技術(shù)，提升檢測(cè)效率；發(fā)展化學(xué)發(fā)光免疫分析法聯(lián)用技術(shù)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。