付莎莉 王利剛 張 婧 周正海 陳 欣 費云滟 吳 丹

重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 重慶 401121

動物源性食品因其含有豐富的人體必需營養(yǎng)物質(zhì)，成為人們飲食構(gòu)架中必不可少的組成部分。隨著社會發(fā)展和消費升級，人們對各種動物源性食品的數(shù)量、質(zhì)量的需求都在增長[1]。實際生產(chǎn)中，不同品種肉類因養(yǎng)殖成本、物流成本等因素影響，其產(chǎn)品銷售價格差異較大，一些不法商販在肉類及其制品中摻雜摻假牟取暴利。肉類摻假不僅影響市場經(jīng)濟(jì)秩序，破壞食品營養(yǎng)價值，還存在消費者因食用未標(biāo)示的肉類原料產(chǎn)生過敏反應(yīng)的健康問題[2]，以及宗教信仰問題等[3]。肉制品特別是深加工肉制品僅靠感官和肉類形態(tài)學(xué)為主的鑒別方法，無法準(zhǔn)確鑒別其種類和品質(zhì)，而基于核酸水平的PCR技術(shù)可高效、準(zhǔn)確檢測食品中的動物源性成分，現(xiàn)將PCR及其衍生技術(shù)在動物源性成分檢測中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下，以期為食品監(jiān)管技術(shù)手段的選擇提供參考。

1 PCR技術(shù)原理及其衍生方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)可以在生物體外將DNA片段準(zhǔn)確有效進(jìn)行復(fù)制，實現(xiàn)DNA片段數(shù)量大幅度增加。實際工作中，只要能夠從樣品中提取出微量的DNA，就可以直接利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，通過對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行分析比對，便可以獲得樣品所屬物種的信息。隨著使用需求的不同，沿用不同的使用條件，PCR技術(shù)已經(jīng)衍生出了多種應(yīng)用方法，下面就近年來在食品動物源性成分檢測中常用的實時熒光PCR法和數(shù)字PCR法進(jìn)行闡述。

1.1 實時熒光PCR法

實時熒光PCR(Real-Time PCR)技術(shù)在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，可通過監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程中熒光染料或特異性標(biāo)記探針造成的熒光信號的改變，實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測[4]。實時熒光PCR法在動物源性成分的檢測中的關(guān)鍵在于針對檢測目標(biāo)，選擇適宜的熒光標(biāo)記基團(tuán)來設(shè)計特異性引物。而熒光探針Real-Time PCR技術(shù)，還需要設(shè)計熒光探針序列。表1列出了豬、牛、羊、雞、鴨、鵝的引物和探針序列，在肉類鑒別檢測中熒光報告基因往往需要具有較強(qiáng)的特異性，特異性熒光報告基因主要包括線粒體基因DNA、細(xì)胞基因組中重復(fù)序列和單拷貝序列。Real-Time PCR在動物源性檢測中的應(yīng)用如下。

1.1.1 單重?zé)晒馓结樂?/p>

Zhang[9](2007)等以牛線粒體Cyt b基因為分析對象設(shè)計了特異性引物和Taqman熒光探針來檢測熱處理后的純?nèi)庵信Ｔ葱猿煞旨昂浚摲椒ㄅNA最低檢出限為35 pg，且未顯示與綿羊、山羊或豬的DNA有交叉反應(yīng)，特異性高。Ali[10](2012)等以豬線粒體Cyt b基因作為分析對象設(shè)計了Taqman熒光探針來檢測混合肉中是否含有豬源性，該方法檢出限低至0.01%，可應(yīng)用于檢測肉制品中是否有豬肉添加。Miguel[11](2005)等以豬線粒體12S rRNA基因作為分析對象設(shè)計了豬源性特異性引物，擴(kuò)增豬肉DNA的411 bp片段，同時擴(kuò)增幾種來自哺乳動物物種DNA的425～428 bp片段用作內(nèi)源性干擾，結(jié)果顯示未與其他動物DNA產(chǎn)生交叉反應(yīng)，該檢測方法對豬肉定量檢測的靈敏度范圍為0.5%～5%。

Yusop[12](2012)等以豬的Cyt b基因作為分析對象設(shè)計引物和分子信標(biāo)探針，建立了Real-Time PCR體系，以多種生肉混合物為樣品，檢測結(jié)果顯示出高特異性，其中豬肉的定量檢出限為0.001ng，而其他肉類品種均為陰性。Mohanad[13](2018)等以豬的染色體DNA和Cyt b基因為研究對象設(shè)計了引物和分子信標(biāo)探針，用于明膠制品中豬源性成分的定量檢測，結(jié)果顯示基于Cyt b基因的檢測方法可檢測出體系中10pg的豬DNA，而基于染色體DNA基因的檢測方法可檢測出體系中1pg的豬DNA。

1.1.2 多重?zé)晒馓结樂?/p>

多重?zé)晒馓结樂丛赗eal-Time PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用多對引物測定，在動物源性檢測中也有較廣泛的應(yīng)用。Iwobi[14](2015)等選擇β-肌動蛋白基因和肌肉生長抑制素基因為分析對象，設(shè)計引物和Taqman探針，采用三重Real-Time PCR用于定性和定量檢測混合肉中牛源性和豬源性成分，結(jié)果表明該引物和探針未與其他動物DNA產(chǎn)生交叉反應(yīng)，定量范圍為0.5%～99.5%，檢出限為20bp。章晶晶[15](2017)等選擇貉子線粒體D-loop基因和狐貍的線粒體基因作為分析對象設(shè)計引物和探針，建立了多重?zé)晒釶CR體系對肉制品中狐貍、貉子源性成分定量分析，其中最低檢測限為狐貍0.5pg/μL、貉子5pg/μL。劉艷艷[16](2016)等選擇線粒體基因組16S rRNA基因為分析對象設(shè)計引物和分子信標(biāo)探針建立的多重Real-Time PCR體系能實現(xiàn)對阿膠原料中驢、馬、驢騾和馬騾源性成分的同時區(qū)分，結(jié)果顯示建立的多重Real-Time PCR體系具有較好的物種特異性和檢測靈敏性，最低檢測限為0.01ng/μL。Mar[17](2012)等選擇t-Glu和Cyt b基因為分析對象設(shè)計引物和探針，檢測熱處理前后混合肉樣中豬、牛和雞肉的含量，最低檢出限為原樣1%、熱處理樣0.32pg/μL。Cheng[18](2014)等選擇β-肌動蛋白基因和生長因子基因設(shè)計引物和Taqman-MGB探針建立多重?zé)晒釶CR體系檢測雞、鴨和豬源性成分在混合DNA中的含量，并以鵝、馬、兔、牛、驢、鯽魚、綿羊和山羊8種源性成分作為陰性對照，結(jié)構(gòu)顯示該方法具有很強(qiáng)特異性，未產(chǎn)生交叉反應(yīng)，檢測限可達(dá)到0.15ng。Druml[19](2015)等選擇偽表皮生長因子基因設(shè)計Taq man-MGB探針和體系，以鑒別混合肉類DNA中三種鹿的含量，該方法顯示出較高特異性，未與肉類產(chǎn)品中可能含有的其他20種動物和43種植物成分產(chǎn)生交叉反應(yīng)，檢測為0.1%。許如蘇[20](2017)等選擇線粒體基因組為研究對象設(shè)計引物及探針，建立了多重Taqman-LNA熒光PCR體系，實現(xiàn)肉制品中豬雞鴨源性成分的同時檢測，且與牛、羊、驢、兔、鵝等常見動物源性成分無交叉反應(yīng)，特異性高，且其檢測限均可低至肉含量的0.001%，靈敏度強(qiáng)。

1.1.3 熒光染料法

熒光染料是能與ds DNA雙螺旋小溝區(qū)域非特異性結(jié)合的染料，在激發(fā)光的作用下結(jié)合狀態(tài)染料的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離狀態(tài)的熒光強(qiáng)度，其熒光信號強(qiáng)度隨擴(kuò)增過程中PCR產(chǎn)物的增加而同步增強(qiáng)，以Sybr Green和EvaGreen較為常見。Soares[21](2013)等以Sybr Green作為熒光染料，選擇豬的Cyt b和18S rRNA基因為分析對象設(shè)計引物，該方法表現(xiàn)出良好特異性，在豬肉添加量0.1%～25%的混合肉樣中檢測豬肉的含量，結(jié)果表明豬DNA在原樣中最低檢出量為5pg、熱處理樣中最低檢出量為20ng。郭云霞[22](2012)等選擇真核生物18S rRNA為對象設(shè)計引物，以SYBR Green I為熒光染料用Real-Time PCR方法檢測了多種動植物食品樣品中的鯊魚源性成分，該方法的檢出限為0.001ng/μL；Kang[23](2018)等則采用Subr Green染料的Real-Time PCR技術(shù)，在100%～0.01%范圍內(nèi)對豬肉和牛肉混合樣品中豬肉的含量進(jìn)行測定，經(jīng)驗證比較得出該方法可以用于檢測牛肉加工制品中是否有豬肉摻假。Lubil[24](2018)等選擇豬的Cyt b基因為對象設(shè)計引物，建立了采用EvaGreen為熒光染料的Real-Time PCR方法來檢測肉制品混合物中豬DNA的含量，并且通過9種其他動物和6種蔬菜為陰性對照，證明了該方法對豬DNA具有特異性。該法在檢測生豬肉和雞肉混合物時檢出限可低至0.001%。同樣以Cytb基因為對象進(jìn)行新引物設(shè)計，Meira[25](2017)等建立了定性定量檢測體系檢測加工食品中馬肉摻假，該方法表現(xiàn)出高靈敏度和特異性，在牛和馬的混合樣品的檢測中，最低可檢測到的馬DNA為0.1pg。Joana[26](2017)等采用EvaGreen熒光染料建立定量檢測體系，通過熔解曲線于標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對對肉制品中豬肉含量進(jìn)行定量檢測，并利用未知肉混合物進(jìn)行重復(fù)驗證，得出該方法特異性較強(qiáng)、重復(fù)性高，豬DNA的最低檢出限為0.01pg。Sakalar[27](2015)等選擇豬和馬的12S rRNA和16S rRNA基因為對象設(shè)計引物，EvaGreen為熒光染料建立了多重Real-Time PCR技術(shù)，可實現(xiàn)在0.1%～10%范圍內(nèi)對混合肉中馬和豬肉的含量進(jìn)行同時檢測，檢出限低至0.00001ng/μL。Sakalar[28](2016)等還設(shè)計了基于EvaGreen的雙重Real-Time PCR檢測體系來檢測肉制品中豬肉和牛肉摻假，該體系異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)0.001%。

1.2 數(shù)字PCR法

單一的Real-Time PCR技術(shù)雖能實現(xiàn)相對定量，但需要建立已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能比對出目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，而檢測結(jié)果受擴(kuò)增效率的影響較大，所以該方法不能對目標(biāo)序列精確定量，而數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)實現(xiàn)了核酸的絕對定量。數(shù)字PCR的快速發(fā)展得益于微流控技術(shù)的逐漸成熟，先后發(fā)展出基于微反應(yīng)腔室、集成化微流控芯片和微滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)[29]，微流控芯片式數(shù)字PCR(cdPCR)技術(shù)通過將納升級的液體樣品封閉在由多個獨立的微池或微通道組成的集成芯片后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)不同微池或微通道的熒光信號情況判讀。微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是一種利用水油乳化液滴系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字PCR的方法[30～33]。兩者中微滴數(shù)字PCR具有一定優(yōu)勢，以下重點介紹微滴數(shù)字PCR的應(yīng)用。

Cai[34](2014)等通過應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，對豬肉和雞肉產(chǎn)品進(jìn)行定量分析，研究結(jié)果表明，肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)量之間均呈線性關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，建立了根據(jù)DNA拷貝數(shù)計算肉質(zhì)量的模型。并通過人工比例污染試驗，混合已知比例的豬肉和雞肉，以驗證該方法的準(zhǔn)確度和適用性，獲得了較好的驗證結(jié)果。該團(tuán)隊于2017年通過應(yīng)用雙微滴數(shù)字PCR技術(shù)，對肉制品中牛肉源性和豬肉源性成分進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步定量。該方法實現(xiàn)了在一個數(shù)字PCR反應(yīng)管內(nèi)同時對牛肉和豬肉混合樣品中的源性成分進(jìn)行識別和定量，同時，通過已知比例成分的混合肉類樣品驗證了該方法的準(zhǔn)確性和適用性[35]。該團(tuán)隊于2018年通過應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，對肉制品中山羊肉和綿羊肉含量的檢測和定量進(jìn)行了研究，建立了一套基于DNA拷貝數(shù)的肉質(zhì)量計算模型。并使用不同動物品種(24種)的樣本進(jìn)行了專一性的驗證，其中包括山羊和綿羊每個種屬各5個品種。方法采用含有山羊和綿羊特異基因片段的質(zhì)粒作為正對照用于校正，方法結(jié)果顯示山羊和綿羊的檢出限和定量限分別為1 copies/μL和5 copies/μL。采用將山羊和綿羊肉按比例混合的模擬樣品進(jìn)行了準(zhǔn)確性和適用性的驗證。結(jié)果顯示該方法具有很高的精確度，具有較好的應(yīng)用前景[36]。

Floren[37](2015)等以真核生物核F2基因作為目標(biāo)靶點，開發(fā)了一種兩步式微滴數(shù)字PCR方法，用于檢測肉制品加工過程中牛、馬、豬源性成分的含量并與熒光定量PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果表明微滴數(shù)字PCR法更具有優(yōu)勢，定量限低至0.01%，檢出限為0.001%。并采用了14種物種驗證其特異性，未顯示出交叉反應(yīng)。Ren[38](2017)等通過采用微滴數(shù)字PCR方法對綿羊、山羊為原料的肉制品中的雞肉含量進(jìn)行定量檢測，該方法在檢驗計算過程中引入倍數(shù)因子，將擴(kuò)增拷貝數(shù)的比例換算為肉源性含量的比例，該法對經(jīng)過熱處理和超高壓處理后的樣品同樣具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，且原料動物不同部位采樣對該方法的精確度無影響。

Noh[39](2019)等建立了一種用于定量分析海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚含量的微滴式數(shù)字PCR方法，確立了魚肉質(zhì)量、DNA含量和DNA拷貝數(shù)量之間的線性關(guān)系，在此基礎(chǔ)上建立了以DNA拷貝數(shù)為計算基礎(chǔ)的肉質(zhì)量計算模型。通過對已知比例混合樣品進(jìn)行定量分析驗證了其準(zhǔn)確性和適用范圍。結(jié)果顯示，該方法可用于海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚的檢測及定量分析，可應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量及真實性認(rèn)證。史艷宇[40](2018)等以鴨線粒體基因為目標(biāo)靶點設(shè)計引物和探針，通過微滴數(shù)字PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測和分析，建立了產(chǎn)品中鴨源性成分的檢測和定量分析方法，與熒光定量PCR比較后得出該方法靈敏度高于熒光定量PCR。

2 研究展望

目前對肉類源性的鑒別檢測主要集中在對蛋白質(zhì)的檢測和對核酸的檢測兩方面。但是蛋白質(zhì)檢測的開展需要高要求的儀器和樣品前處理方法，前處理復(fù)雜、試劑成本高、耗時長、特異性較差，且往往不適用于經(jīng)熱加工處理的肉制品，僅適用于對新鮮肉類的檢測。而基于核酸的檢測方法更具優(yōu)勢，通過對數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知種類特異DNA序列的比對判定樣品種類，更適用于檢測未知樣品。

Taqman熒光探針在實際實驗中存在一定的局限性，無法應(yīng)對靶基因特異序列較短的情況。對體系中存在的與靶基因同源的序列，也很容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，造成最終定量不準(zhǔn)確。分子信標(biāo)靈敏度強(qiáng)，可檢測出單個核苷酸的突變，可以應(yīng)對靶基因特異序列較短狀況，但其設(shè)計要求復(fù)雜，且成本較高[24]。熒光染料法可用于dsDNA序列的擴(kuò)增監(jiān)測，相對熒光探針法設(shè)計要求簡單，成本低?；赗eal-Time PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作便捷的特點，近年來廣泛應(yīng)用于快速定量檢測，在食品檢測領(lǐng)域更是具有較高的應(yīng)用價值。利用Real-Time PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，大量研究建立了畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)制品、奶制品的檢測方法，可應(yīng)用于肉類摻假、奶制品摻假的鑒別。采用Real-Time PCR技術(shù)時仍需注意：熒光染料法雖然檢測簡便、價格便宜，但染料與DNA雙鏈的結(jié)合為非特異性結(jié)合，往往會出現(xiàn)多個終產(chǎn)物，則需要通過擴(kuò)增曲線的判斷來確定多個終產(chǎn)物的特異性[38]。熒光探針法比熒光染料法具有更強(qiáng)的特異性，但至關(guān)重要的目標(biāo)基因選擇以及引物探針設(shè)計還較為困難，若體系中存在與靶基因同源的序列，則易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，使得定量不準(zhǔn)確。數(shù)字PCR法是近幾年才新出現(xiàn)的技術(shù)，可以檢測出混合復(fù)雜樣品中的微量核酸，靈敏度極高，且可以實現(xiàn)核酸的絕對定量。因其具有的明顯優(yōu)勢已在成分鑒定檢測領(lǐng)域快速發(fā)展，在動物源性食品成分檢測中也具有重要作用。

數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用，使很多動物源性食品摻假制假的研究，從以往片面的定性檢測實現(xiàn)了精準(zhǔn)定量檢測的跨越，檢測數(shù)據(jù)能反應(yīng)混合樣品中不同動物源性材料的含量，進(jìn)一步掌握動物源性制品摻假程度?，F(xiàn)階段微生物檢測領(lǐng)域和植物轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域已經(jīng)制定了相關(guān)方法和標(biāo)準(zhǔn)，但在動物源性成分檢測方面檢測方法標(biāo)準(zhǔn)仍空缺，所需試劑和ddPCR儀器價格居高不下，造成了ddPCR在常規(guī)實驗室普及率低。未來隨著國家監(jiān)管投入增加和設(shè)備價格的降低，微滴數(shù)字PCR將更加普及，成為動物源性食品監(jiān)管的檢測技術(shù)支撐。