陳志云 秦長(zhǎng)生 王 玲 徐金柱李東文 莫 羨 趙丹陽(yáng) 楊 華

（1.中山市林業(yè)有害生物防治檢疫站，廣東 中山 528403；2.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510520）

橙帶藍(lán)尺蛾Milionia basalis（鱗翅目Lepidoptera；尺蛾科Geometridae），主要危害羅漢松屬和陸均松屬植物，在廣西有該蟲(chóng)對(duì)竹柏Podocarpus nagi造成危害的報(bào)道[1]。該蟲(chóng)以幼蟲(chóng)危害葉片，大爆發(fā)時(shí)可將整株植株全部吃光，嚴(yán)重影響植株生長(zhǎng)及品質(zhì)。同時(shí)成蟲(chóng)具有一定的遷飛能力；幼蟲(chóng)、卵、蛹等亦可隨植株轉(zhuǎn)移進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。該蟲(chóng)在我國(guó)廣西省博白[1]、浙江省杭州[2]、廣東省深圳[3]、陽(yáng)春、肇慶[4]、江西省大余縣[5]、海南省及臺(tái)灣地區(qū)均有發(fā)生。

昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)多種農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)具有高毒力，對(duì)環(huán)境友好。多年來(lái)，作為一種重要的害蟲(chóng)防治措施受到廣泛研究。因侵染過(guò)程涉及多種因素作用，寄主一般難于產(chǎn)生抗藥性，此外，病原真菌還能在土壤中大量宿存，不但可以寄生昆蟲(chóng)，而且能夠在生態(tài)系統(tǒng)中寄主昆蟲(chóng)缺乏的情況下在不同環(huán)境下?tīng)I(yíng)腐生生活，在適宜條件下能隨蟲(chóng)口的增加而大量繁殖，與害蟲(chóng)的發(fā)生保持較好的一致性，能起到對(duì)害蟲(chóng)持續(xù)控制的作用。但是也有一些不可避免的缺點(diǎn)，例如防治效果較為緩慢；控制有害生物的范圍較窄；易受到環(huán)境因素的制約和干擾等。

將化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物農(nóng)藥的聯(lián)合應(yīng)用可以有效避免或緩解化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物農(nóng)藥的防治弊端[6-9]。但目前關(guān)于橙帶藍(lán)尺蛾生物防治的相關(guān)報(bào)道較少，因此本文以8 株具有較高毒力的昆蟲(chóng)病原真菌（7株綠僵菌和1 株白僵菌）為研究對(duì)象，分別測(cè)定其對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)的室內(nèi)毒力。并針對(duì)已篩選出的高毒力菌株，探究其與4 種高效低毒的化學(xué)藥劑混用對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾的協(xié)同致死作用，為協(xié)調(diào)橙帶藍(lán)尺蛾的化學(xué)防治與生物防治提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 橙帶藍(lán)尺蛾飼養(yǎng)參考Yoshinori Shintani[10]的飼養(yǎng)方法，成蟲(chóng)采集于廣東省中山市，放在塑料保鮮盒里帶到實(shí)驗(yàn)室。將收集的成蟲(chóng)根據(jù)腹部頂端的形態(tài)進(jìn)行性別鑒定，可見(jiàn)到產(chǎn)孵瓣者為雌性，可見(jiàn)抱握器者為雄性，將雌雄成蟲(chóng)按照1 ∶3 的比例置于三面尼龍網(wǎng)的 (34 cm×25 cm×34 cm)昆蟲(chóng)籠中，籠底放置一層報(bào)紙。以20%蜂蜜水進(jìn)行飼喂。養(yǎng)蟲(chóng)籠置于25℃（光周期為L(zhǎng) ∶D=16 ∶8）條件下。將羅漢松Podocarpus macrophyllus的枝條（高約30 cm 長(zhǎng)，直徑約3 cm）放置于籠中作為產(chǎn)卵處。用小毛筆和鑷子將產(chǎn)于樹(shù)枝上的卵塊收集至培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），培養(yǎng)皿內(nèi)放入保濕的紙巾，在25 ℃下光照培養(yǎng)，光周期為16L ∶8D，相對(duì)濕度 70%。幼蟲(chóng)孵化后，每30 只一組，用小毛筆將其轉(zhuǎn)移到每一個(gè)培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿底部鋪上保濕的紙巾。以羅漢松葉片進(jìn)行飼喂，每日補(bǔ)充葉片。待幼蟲(chóng)蛻皮1 次后，將2 齡幼蟲(chóng)移入15 cm 培養(yǎng)皿中用于室內(nèi)毒力測(cè)定。

1.1.2 供試菌株 供試驗(yàn)的菌株由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)生物殺蟲(chóng)劑團(tuán)隊(duì)保藏（表1），各菌株均用馬鈴薯蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PPDA 培養(yǎng)基）連續(xù)培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 待篩選菌株來(lái)源Table 1 Origin of 8 entomopathogenic fungi

1.1.3 化學(xué)藥劑 5%氯蟲(chóng)苯甲酰胺懸浮劑（美國(guó)杜邦公司）；1.2%煙堿·苦參堿乳油（內(nèi)蒙古赤峰市帥旗農(nóng)藥有限責(zé)任公司）；2.5%高效氯氟氰菊酯懸浮劑（南京紅太陽(yáng)股份有限公司）；3%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽水乳劑（廣西田園生化股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 橙帶藍(lán)尺蛾高毒力菌株篩選 采用噴霧塔法進(jìn)行綠僵菌和白僵菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾的室內(nèi)毒力測(cè)定，將供試菌株配制成濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液備用，將橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)的培養(yǎng)皿置于噴霧塔的載物上，每次噴霧體積為2 mL，每組處理幼蟲(chóng) 30 頭，重復(fù) 3 次，將處理后試蟲(chóng)幼蟲(chóng)重新放入9cm 培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱中，于25 ℃、相對(duì)濕度 70% 、光周期16L:8D 條件下培養(yǎng)，以羅漢松葉片進(jìn)行飼喂并且每日觀察死亡情況。用鑷子輕觸蟲(chóng)體，不能活動(dòng)者視為死亡。根據(jù)公式計(jì)算校正死亡率。

根據(jù)上述結(jié)果篩選出致病力較好的病原菌株，用0.05%吐溫-80 水溶液依次將其稀釋為1×108孢子/mL、1×107孢子/mL、1×106孢子/mL、1×105孢子/mL、1×104孢子/mL，采用噴霧法對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)進(jìn)行處理，方法同上，以0.05%吐溫-80 水溶液為空白對(duì)照。根據(jù)校正死亡率與藥劑濃度進(jìn)行回歸分析，得到毒力回歸方程及致死中濃度LC50。

1.2.2 綠僵菌和化學(xué)藥劑的最佳混配試驗(yàn) 根據(jù)上述結(jié)果將已經(jīng)篩選出來(lái)的高毒力綠僵菌菌株配成孢子濃度為1.00×108孢子/mL 的懸浮液，化學(xué)藥劑分別配成試蟲(chóng)死亡率保持在30%～70%的濃度，5%氯蟲(chóng)苯甲酰胺為25 ug/mL；1.2%煙堿·苦參堿乳油為12 ug/mL；2.5%高效氯氟氰菊酯懸浮劑為12.5 ug/mL；3%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽為15 ug/mL。采用噴霧法，每組處理幼蟲(chóng)30 頭，重復(fù) 3 次，處理第3 天統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率。根據(jù)Mansour[11]的協(xié)同毒力指數(shù)（c.f）定性評(píng)判混用的聯(lián)合作用，其中c.f ≥20 時(shí)為增效作用，c.f ≤-20 時(shí)為拮抗作用，-20 ＜c.f ＜20 時(shí)為相加作用。

混劑理論死亡率Pm= 1-(1-Pa)×(1-Pb)，Pa、Pb分別為各單劑的試蟲(chóng)死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，采用Duncan 氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。并運(yùn)用Probit 機(jī)率值分析法求出毒力回歸方程、致死中時(shí)間LT50、致死中濃度LC50、95%置信區(qū)間等。

2 結(jié)果與分析

2.1 8 株昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)室內(nèi)毒力

采用定量噴霧法測(cè)定了8 株昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的室內(nèi)毒力，從死亡率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)來(lái)看（圖 1），不同菌株均表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，即幼蟲(chóng)死亡率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增大。接種后1～2 d 未出現(xiàn)死蟲(chóng)，第3 天部分菌株處理組開(kāi)始出現(xiàn)幼蟲(chóng)行動(dòng)遲緩甚至死亡現(xiàn)象，死亡高峰基本出現(xiàn)在4～6 d（圖2）。

圖1 不同菌株對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)的毒力Fig. 1 Virulence of different strains to the 2nd-3rd instar larvae of M. basalis

圖2 不同菌株處理橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)日死亡數(shù)量Fig. 2 The daily death of differemt fungi against 2nd-3rd instar larvae of M. basalis

當(dāng)孢懸液濃度為1.00×108孢子/mL 時(shí)，處理8 d 后，供試的8 株病原菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的毒力存在顯著差異（P<0.05），校正死亡率為46.15%～98.89%，LT50值為 4.043～6.563 d（表2）。其中菌株M09、Mac985、Ma3297 和Mf1245 的校正死亡率均大于85%，分別為98.72%、96.15%、88.46%和87.18%。此外，M09、Mac985、Ma3297菌株的LT50均小于5 d，分別為4.043、4.226、4.868 d。綜合校正死亡率、LT50值，菌株M09、Mac985、Ma3297 顯示出較強(qiáng)的殺蟲(chóng)毒力。

表2 8 株昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)室內(nèi)毒力Table2 Toxicity of 8 entomopathogenic fungi to M. basalis 2nd～3rd instar larvae

2.2 3 株高效綠僵菌不同濃度對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3齡幼蟲(chóng)毒力

3 株綠僵菌對(duì)M09、Mac985、Ma3297 對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)的致死中濃度LC50有所不同，其中M09 的LC50最高，為1.64×104孢子/mL；Ma3297 次之，LC50為7.95×104孢子/mL；Mac985 毒力最低，LC50為1.62×106孢子/mL（表3）。

表3 M09、F985 和Ma3297 對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾2～3 齡幼蟲(chóng)的毒力Table3 Toxicity of M09, F985 and Ma3297 to M. basalis 2nd-3rd instar larvae

2.3 最佳混配組合篩選結(jié)果

以濃度為1.00×108孢子/mLM09 孢懸液與4 種化學(xué)藥劑混配后處理橙帶藍(lán)尺蛾3 齡幼蟲(chóng)，致死效果都比較好，其死亡率分別為100%、92.41%、86.15%、87.50%，綠僵菌M09 與高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽混配后對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾的聯(lián)合毒力為增效作用（表4）。

表4 混配藥劑對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾聯(lián)合作用結(jié)果Table4 Synergism of Ma09 and 3 pesticides against M. basalis

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)中使用的7 株綠僵菌和1 株白僵菌均對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾具有一定的毒力，但白僵菌毒力較弱。綠僵菌M09、Mac985、Ma3297 處理8 d 后的校正死亡率均大于85%，并且LT50小于5 d，LC50分別為1.64×104孢子/mL、1.62×106孢子/mL 和7.95×104孢子/mL，對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾具有較強(qiáng)的毒力。綜合比較校正死亡率、LT50和LC50，綠僵菌M09 菌株表現(xiàn)出眾，用于與4 種化學(xué)殺蟲(chóng)劑混配進(jìn)行協(xié)同作用測(cè)定，結(jié)果表明4 種混配劑的致死率均大于85%，并且綠僵菌M09 與高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽混配后表現(xiàn)為增效作用。

昆蟲(chóng)病原真菌是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的生物藥劑之一，近年來(lái)成為生物防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)，且在多種農(nóng)林害蟲(chóng)防治方面均有應(yīng)用范例。鄭宏[12]發(fā)現(xiàn)綠僵菌MaF-13 對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾具有較強(qiáng)的毒力作用，以1.0×108孢子/mL 孢子懸浮液接種10 d 后幼蟲(chóng)死亡率均達(dá)到100% ；LT50為3.99 d。何學(xué)友等人[13]測(cè)定了5 株綠僵菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力，其中MaFZ-13、MaXJ-04 菌株對(duì)幼蟲(chóng)的致死率較高，以1.0×107孢子/mL 濃度處理15 d 后分別達(dá)到96.7% 、95.0% ，LT50分別為5.01、5.48 d。本實(shí)驗(yàn)中3 株綠僵菌的校正死亡率在85%以上，LT50均小于5 d，由于昆蟲(chóng)病原菌菌株之間具有差異性，因此所得結(jié)果與前人報(bào)道有差異，但從其校正死亡率、LT50和LC50考慮，本實(shí)驗(yàn)篩選得到的3 株高毒力菌株也具有一定的生防應(yīng)用潛力。大量研究表明綠僵菌致死高峰出現(xiàn)在3～7 d，本研究中7 株綠僵菌的死亡高峰均在4～6 d 內(nèi)出現(xiàn)，與之前研究是一致的。但由于室內(nèi)毒力測(cè)定與林間試驗(yàn)環(huán)境不同，通常林間防治效果結(jié)果大多在10 d 以后產(chǎn)生，因此使得昆蟲(chóng)病原菌的防治時(shí)效較慢，限制了其在農(nóng)林生物防治中的應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題，很多學(xué)者提出將昆蟲(chóng)病原菌與低劑量化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配，以達(dá)到協(xié)同增效的作用，提高防治效果，如曹偉平等人[14]將球孢白僵菌Beauveria bassianaHFW-0514 與低劑量的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺混用后LT50均顯著降低。Chunhua Zou 等人[9]將玫煙色棒束孢Paecilomyces fumosoroseus的菌株IfB01與吡蟲(chóng)啉混配具有明顯增效作用，并且LT50明顯縮短?；瘜W(xué)藥劑可以有助于昆蟲(chóng)病原真菌侵入，從而提高侵染速度，使其更容易進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)部。提高昆蟲(chóng)病原真菌的防治時(shí)效同時(shí)還可以降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量，避免化學(xué)藥劑過(guò)多使用而產(chǎn)生的“3R”問(wèn)題。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[15]，氯蟲(chóng)苯甲酰胺、煙堿·苦參堿、高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾用藥后7 d的林間防治效果可以達(dá)90%以上，因此本試驗(yàn)選用這4 種化學(xué)藥劑與綠僵菌Ma09 進(jìn)行混配，發(fā)現(xiàn)綠僵菌M09 與高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽表現(xiàn)出增效作用，綠僵菌與上述2 種殺蟲(chóng)劑混用，可以縮短殺蟲(chóng)時(shí)間、提高殺蟲(chóng)效率、減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用。本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用綠僵菌M09、Mac985、Ma3297 和Mf1245 處理8 d 后校正死亡率均大于85%，效果與化學(xué)藥劑相當(dāng)且明顯，因此可以考慮在早期預(yù)防上單獨(dú)使用綠僵菌進(jìn)行防治，隨著綠僵菌大規(guī)模商品化，成本亦逐年降低，僅僅略高于化學(xué)農(nóng)藥，但是效果更好更環(huán)保。但是當(dāng)高齡蟲(chóng)口密度上升，突然出現(xiàn)害蟲(chóng)大爆發(fā)的時(shí)候則必須考慮如何在短時(shí)間內(nèi)將蟲(chóng)口密度降下來(lái)，此時(shí)綠僵菌等生物防治的時(shí)效性較長(zhǎng)，不適用于防治，因此可以考慮使用化學(xué)藥劑和生物藥劑進(jìn)行混配，在短時(shí)間內(nèi)將蟲(chóng)口密度降低。本實(shí)驗(yàn)中使用混配劑在防治3 d 后就表現(xiàn)出了明顯的防治效果，與化學(xué)農(nóng)藥防效相當(dāng)且比生物農(nóng)藥防治時(shí)間短，十分適合用于害蟲(chóng)大爆發(fā)或者應(yīng)急性防治中。本實(shí)驗(yàn)利用了綠僵菌與化學(xué)藥劑進(jìn)行混配，取得了明顯的室內(nèi)試驗(yàn)效果，但上述結(jié)果還需在林間試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。