薛曉寧 徐翮飛 張 娟 侯 偉 張 瑾（通信作者）

青島國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（山東，青島，266071）

乙型腦炎病毒屬于黃病毒屬黃病毒科，病毒主要在蚊與蚊中傳播， 還可在豬和水鳥(niǎo)等動(dòng)物中傳播，經(jīng)感染的蚊蟲(chóng)叮咬可傳播到人［1］。大部分感染者沒(méi)有癥狀或者出現(xiàn)輕微癥狀，少數(shù)感染者發(fā)展為腦炎，出現(xiàn)包括突發(fā)頭疼、高熱、定向障礙、昏迷等癥狀。四分之一的重癥患者死亡，30%存活的重癥患者存在永久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［2］。

因?yàn)楦腥菊哐褐羞_(dá)不到足夠高的病毒，通過(guò)PCR 方法檢測(cè)血液中病毒核酸相對(duì)困難。 目前主要是通過(guò)檢測(cè)血漿或者腦脊液中的特異性抗體對(duì)乙型腦炎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷［3］。 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR） 是第三代PCR 技術(shù)，是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。 其中應(yīng)用最廣泛的是微滴式數(shù)字PCR（ddPCR），把核酸分子稀釋到一定濃度，生成一定數(shù)目的微滴，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，讀取陽(yáng)性微滴數(shù)目，計(jì)算出樣品的原始濃度［4］，在低濃度的核酸含量下也可靈敏和準(zhǔn)確地進(jìn)行絕對(duì)定量。

本研究建立了乙型腦炎病毒核酸ddPCR 檢測(cè)方法，并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）相比較，初步判斷ddPCR 在檢測(cè)乙型腦炎病毒中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

乙型腦炎病毒核酸來(lái)自乙型腦炎病毒滅活疫苗。 用于特異性檢測(cè)的常見(jiàn)蟲(chóng)媒病毒核酸（登革病毒，寨卡病毒，基孔肯亞病毒，黃熱病毒）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。 所有樣本均通過(guò)商品化試劑盒檢測(cè)。

1.2 儀器和試劑

bio-rad T100 普通RCR；QX200TM Droplet DigitalTM PCR 系統(tǒng)包括微滴生成儀和微滴讀取儀（Biorad 公司）；Quantistudio 5 熒光定量PCR（ABI公司）。 One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes （1864021，Biorad 公司）；One Step Prime-ScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）（Takara）；乙型腦炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海之江生物有限公司。委托上海生工生物有限公司以pUC57 為克隆載體合成包括擴(kuò)增片段在內(nèi)500 bp 長(zhǎng)度的基因序列，最終獲得pUC57- JEV 作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)及優(yōu)化

從NCBI 網(wǎng)站獲得乙型腦炎病毒NS3 基因，用Primer Express 3.0 設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增乙型腦炎病毒的引物和探針。 序列如下： JEV-F 5’AGAGCACCAAGGGAATGAAATAGT3’，JEV-R 5’AATAGGTTGTAGTTGGGCACTCTG3’，Probe-JEV 5’-FAM-CCACGCCA-CTCGACCCATAGACTG-TAMRA-3’。 引物和探針均由Invitrogen 生物有限公司合成。 采用設(shè)計(jì)好的引物和探針建立qPCR 和ddRT-PCR 方法， 包括擴(kuò)增循環(huán)條件的優(yōu)化及引物、探針濃度的優(yōu)化。

1.4 qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系為20 μL，其中包括One Step RT-PCR Buffer III 10 μL， 引物和探針 （各10umol） 0.4 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix Ⅱ0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，RNA 2 μL，RNase Free dH2O 5.6 μL。反應(yīng)條件：42 ℃5 min， 95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s （收集熒光信號(hào)）共40 個(gè)循環(huán)。

1.5 ddPCR 反應(yīng)體系和條件

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果， 確定ddPCR 反應(yīng)體系為：Supermix 5 μL，Reverse transcriptase 2 μL，300 mmol/L DTT 1 μL，10 μMol/L 引物1.4 μL（終濃度700 nmol/L），10 μMol/L 探針0.5 μL（終濃度250 nmol/L），RNA模板1 μL， RNase-free Water 7.7 μL，共20 μL。 將配制好的20 μL PCR 反應(yīng)液， 轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡樣本孔中，再加入70 μL 微滴發(fā)生油至油孔中，利用微滴生成器制備反應(yīng)微滴。 將每個(gè)樣品的微滴分別轉(zhuǎn)移至96 孔PCR 反應(yīng)板中對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中，在普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。 反應(yīng)條件設(shè)置為：42 ℃60 min；95 ℃10 min；95 ℃30 s，56.9 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)；98 ℃10 min；4 ℃∞。ddPCR 反應(yīng)結(jié)束后用微滴分析儀對(duì)微滴進(jìn)行分析，Quantasoft 1.7.4 軟件完成對(duì)數(shù)據(jù)的自動(dòng)處理。

1.6 特異性驗(yàn)證

用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室乙型腦炎病毒進(jìn)行ddPCR特異性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室保存的多種蟲(chóng)媒病毒核酸，包括：登革病毒（DFV），寨卡病毒（ZIKV），基孔肯亞病毒（CHIKV），乙型腦炎病毒（JEV），黃熱病毒（YFV），按照上述優(yōu)化條件進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證ddPCR 反應(yīng)的特異性，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（NTC）和陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性質(zhì)粒）。

2 結(jié)果

2.1 ddPCR 反應(yīng)條件的確定

ddPCR 方法的準(zhǔn)確性與PCR 擴(kuò)增體系中的引物、 探針濃度和反應(yīng)溫度密切相關(guān)。 為獲得最佳ddPCR 效果，對(duì)引物、探針濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。以pUC57- JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，200～900 nmol/L 設(shè)置引物濃度，50～300 nmol/L 設(shè)置探針濃度，選擇55～65 ℃設(shè)置梯度溫度，分別進(jìn)行ddPCR。 根據(jù)陽(yáng)性熒光擴(kuò)增值與本底間差異，以及陽(yáng)性液滴產(chǎn)生的數(shù)量進(jìn)行選擇，最佳引物濃度為700 nmol/L，最佳探針濃度為250 nmol/L 。 最佳退火溫度為56.9 ℃時(shí)，陽(yáng)性微滴與陰性微滴區(qū)分得最開(kāi)，且之間空白處微滴數(shù)目最少（圖1）。

圖1 不同退火溫度ddPCR 擴(kuò)增乙型腦炎病毒核酸一維散點(diǎn)圖（A）和不同引物濃度ddPCR 擴(kuò)增乙型腦炎病毒核酸一維散點(diǎn)圖（B）

2.2 靈敏度分析

紫外分光光度法測(cè)定pUC57- JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，稀釋，終濃度為1×106，然后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，qPCR 檢測(cè)到1×102的pUC57-JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，ddPCR 檢測(cè)到1×101的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒， 檢出限為16.1 copies/μL（圖2）。

圖2 梯度稀釋擴(kuò)增pUC57-JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 A. qPCR； B. ddPCR

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按已優(yōu)化的ddPCR 檢測(cè)條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，以pUC57-JEV 為模板，使用新建立的體系進(jìn)行3 個(gè)濃度3 次重復(fù)測(cè)定。 結(jié)果顯示，相同濃度模板的反應(yīng)之間陽(yáng)性微滴數(shù)接近， 變異系數(shù)分別為3.45%、3.65%、4.17%（表1）， 說(shuō)明建立的ddPCR 檢測(cè)體系重復(fù)性好。

表1 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

將JEV、YFV、DFV、CHIKV、ZIKV 的RNA 進(jìn)行ddPCR 方法特異性檢測(cè)， 結(jié)果表明： 除了pUC57-JEV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和JEV RNA 有特異性擴(kuò)增外，其他4 種病毒和陰性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果均為陰性 （圖3），表明建立的ddPCR 擴(kuò)增體系特異性高。

圖3 ddPCR 檢測(cè)乙型腦炎核酸特異性驗(yàn)證

3 討論

乙型腦炎又叫日本腦炎，是一種嚴(yán)重的蚊媒傳播的人獸共患病，可引起豬流產(chǎn)或早產(chǎn)，感染人群可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦炎，致死性高，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。青島是山東省東部沿海城市，乙腦發(fā)病率一直低于全國(guó)同期發(fā)病水平，2007-2012年曾連續(xù)6 年無(wú)報(bào)告病例［5］。 但2013 年出現(xiàn)乙腦疫情暴發(fā)，2013-2018 年間青島乙腦報(bào)告病例44 例，年平均發(fā)病率為0.08/10 萬(wàn)。 病例多為45 歲以上人群，病死率高達(dá)13.64%，后遺癥發(fā)生率為38. 64%［6］。乙腦目前沒(méi)有特效的治療藥物，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵因素。

臨床目前主要是通過(guò)檢測(cè)血漿或者腦脊液中的特異性抗體對(duì)乙型腦炎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。 但因?yàn)辄S病毒屬病毒間存在較強(qiáng)的交叉免疫， 抗體檢測(cè)敏感性和特異性存在局限性［7］。目前基于病原體核酸擴(kuò)增的巢氏PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、LAMP 等技術(shù)已經(jīng)用于乙型腦炎病毒的檢測(cè)，但乙型腦炎病毒感染后患者血液中病毒載量通常比較低，病毒血癥持續(xù)時(shí)間也很短，這些方法檢測(cè)血液中病毒核酸相對(duì)困難［8］。ddPCR 是繼普通PCR 和qPCR 之后的第三代PCR技術(shù)，在反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)混合液被分割成10 000～20 000 個(gè)油滴， 目標(biāo)核酸被隨機(jī)分配到獨(dú)立微滴種，每個(gè)油滴對(duì)應(yīng)1 個(gè)反應(yīng)單元，可以檢測(cè)樣本中極低含量核酸分子，研究表明ddPCR 的靈敏度可以達(dá)到1 copy/μL。 本研究針對(duì)乙型腦炎病毒NS3 基因序列設(shè)計(jì)特異引物和Taqman 探針， 建立了乙型腦炎病毒核酸qPCR 和ddPCR 檢測(cè)方法，并對(duì)這兩種方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較和分析。 ddPCR 檢測(cè)方法的敏感度能夠達(dá)到16.1 copies/μL，檢測(cè)靈敏度明顯優(yōu)于熒光PCR（100 copies/μL），在機(jī)體低病毒含量的情況下用于病原體檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì)。 該方法與其它主要蚊媒傳播病原體， 如黃熱病毒、寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯亞病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，能有效應(yīng)用于臨床樣本中乙型腦炎病毒的檢測(cè)。

本研究建立的乙型腦炎病毒ddPCR 為臨床診斷乙型腦炎提供了有力的技術(shù)儲(chǔ)備，同時(shí)也為病毒定量檢測(cè)提供了一種新方法。