卓澤文，林彥汐，李名志，楊自兵，朱麗婷，孔令保， 王 婷（江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院 330045）

流行性乙型腦炎是由乙型腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）引起的一種蚊媒性人獸共患傳染病[1，2]，在我國屬乙類傳染病，每年夏秋季重點傳染病防控、災(zāi)后疫情防控都將其列為重點。另一方面，JEV給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失，仔豬、種豬、母豬感染后會導(dǎo)致繁殖障礙、流產(chǎn)甚至死亡[3，4]。近年來，隨著養(yǎng)豬集約化程度的提升，大中型養(yǎng)豬企業(yè)受養(yǎng)殖量大、物流運輸廣等因素影響，致使多種病原菌混合感染、新病原菌感染、病原菌突變種感染等情況多發(fā)，難以判斷致病原因，因此急需一種特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本較低的診斷方法。

2000年，Notomi T等[5]在《Nucleic Acids Research》上報道了一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)，該方法通過采用具有高鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，針對目的基因上的六段區(qū)域設(shè)計四條引物，在等溫條件下、1h左右，高效、特異地擴增目的基因，反應(yīng)結(jié)果可視化。一直以來，LAMP技術(shù)以其特異性強、靈敏度高、反應(yīng)時間短、設(shè)備簡單且鑒定便捷及時而受到研究人員青睞[6-11]。此項技術(shù)經(jīng)過20年的發(fā)展，在指示劑、輔助劑、儲存方法等方面得到了極大的發(fā)展[8-16]。特別是Bst 3.0 DNA聚合酶，加入了逆轉(zhuǎn)錄酶活性。因此本試驗基于實驗室保存的相關(guān)材料，以JEV P3病毒株為模板，使用Bst 3.0 DNA聚合酶利用RT-LAMP技術(shù)進行反應(yīng)，建立一種新型、靈敏、快速、實用的JEV檢測方法。

1 材料與方法

1.1 生物材料

JEV P3病毒株，BHK-21細胞，E.coli DH5α菌株，pET-28a-LTB-NS1重組質(zhì)粒均由本實驗室保藏。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；TRIzol RNA分離試劑購自Ambion公司；甜菜堿、鈣黃綠素、DMSO購自Solarbio公司；100mmol· L-1MnCl2溶液購自Sigma公司；2k DNA Marker購自康體生命科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、核酸電泳10× Loading buffer購自TaKaRa公司；Bst 3.0 DNA聚合酶及其緩沖液、100mmol· L-1MgSO4購自NEB公司；2.5mmol· L-1dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自GenStar公司；DEPC水購自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇購自西隴化工股份有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

PCR儀——美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)——上海勤翔科學儀器有限公司；瓊脂糖水平電泳儀——上海天能科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)實驗室已有的生物材料，將JEV NS1序列導(dǎo)入在線設(shè)計軟件Primer Explorer V5 （http: //primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.htmL）設(shè)計并篩選出一組LAMP引物，引物序列為JEV-F3 5′-GCGGAGTCAGATCTGTCACT-3’， JEV-B3 5’-TTCCGGGGCAAAGAGGAT-3’， JEV-FIP 5’-ACCACACTGAGGTCCACTGCATTCACCAAATGTGGGAAGCCGTAAG-3’和JEV-BIP 5’-TATCGCTCAGCCCCTAAACGCCTTCCCCATGCTTTCCAGCC-3’。擴增片段長度為217bp， 引物由北京擎科生物科技有限公司合成，工作濃度為10μmol· L-1。

1.5 模板的提取及PCR和RT-PCR檢測

提取E.coli DH5α-pET-28a-LTB-NS1重組質(zhì)粒，質(zhì)粒的提取參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書，并保存在-20℃冰箱；以NS1重組質(zhì)粒為模板，分別以內(nèi)引物和外引物做PCR反應(yīng)，檢測引物的特異性。采用TRIZOL法提取JEV P3病毒株核酸，利用cDNA Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得JEV cDNA，然后以JEV cDNA為模板，利用設(shè)計的內(nèi)引物和外引物進行PCR反應(yīng)。

外引物PCR體系為: 2× Cata Amp Taq PCR Mix 10μL，外引物0.4μL，模板0.4μL，補加ddH2O至20μL。反應(yīng)程序為: 94℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30個循環(huán)；72℃ 10min，37℃ 10s。內(nèi)引物PCR體系為: 2× Cata Amp Taq PCR Mix 10μL，內(nèi)引物0.4μL，模板0.4μL，補加ddH2O至20μL。反應(yīng)程序為: 94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃ 10min，37℃ 10s。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，緩沖溶液為TAE溶液。

1.6 LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系成分包括: 外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP、dNTPs、Bst 3.0 DNA 聚合酶、10×等溫擴增緩沖液Ⅱ（1×緩沖溶液含2mmol· L-1MgSO4）、MgSO4、甜菜堿、模板、ddH2O。Bst 3.0 DNA聚合酶使用說明書推薦的LAMP反應(yīng)體系中各組分終濃度分別為: 1×等溫擴增緩沖液Ⅱ（含2mmol·L-1MgSO4）、6mmol· L-1MgSO4（共 計8mmol· L-1MgSO4）、0.2μmol· L-1外引物F3/B3、1.6μmol· L-1內(nèi)引物FIP/BIP、0.32U·μL-1Bst 3.0 DNA聚合酶，1.4mmol· L-1dNTPs、DNA或RNA模板＞10拷貝。

以Bst 3.0 DNA聚合酶使用說明書推薦的體系為基礎(chǔ)，并結(jié)合相關(guān)文獻報道[3，4，14，18，21]，以質(zhì)粒DNA為模板，采取單因素試驗，對反應(yīng)溫度（65、66、67、68、69、70℃）、甜菜堿濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol· L-1）、Mg2+濃度（4、6、8、10mmol· L-1）、Bst 3.0 DNA聚 合 酶 濃 度（0.08、0.16、0.24、0.32U·μL-1）等進行優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)體系。

1.7 可視化檢測的建立

本試驗采用鈣黃綠素-MnCl2作為可視化指示劑，鈣黃綠素溶于DMSO后再稀釋至工作濃度。依據(jù)已有的文獻報道[14]及反應(yīng)前后顏色深淺的比較，確定MnCl2的終濃度為0.5mmol·L-1，鈣黃綠素終濃度為40μmol· L-1。

1.8 JEV-RT-LAMP檢測

BHK-21細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，鋪滿密度約80%時接種JEV P3株病毒，約80% 細胞出現(xiàn)病變時收獲細胞，提取樣本總RNA并立即加入LAMP反應(yīng)體系進行反應(yīng)，驗證LAMP反應(yīng)體系的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗證

為了驗證針對JEV NS1設(shè)計的引物的特異性，分別以NS1重組質(zhì)粒和JEV P3病毒株的cDNA為模板進行PCR擴增，另外以ddH2O為陰性對照，結(jié)果（圖1）顯示以NS1質(zhì)粒（泳道2和5）和JEV cDNA（泳道3和6）為模板時擴增得到條帶，而陰性對照組（泳道1和4）未出現(xiàn)條帶，表明設(shè)計的引物與模板均能夠很好的匹配。

圖1 模板材料驗證

2.2 LAMP反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

以JEV NS1重組質(zhì)粒為模板，ddH2O為陰性對照，采取單因素試驗，對反應(yīng)溫度（65、66、67、68、69、70℃）、甜菜堿 濃 度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol· L-1）、Mg2+濃 度（4、6、8、10mmol· L-1）、Bst 3.0 DNA聚合酶濃度（0.08、0.16、0.24、0.32U·μL-1）進行優(yōu)化。反應(yīng)1h后，80℃ 5min終止反應(yīng)；置于4℃冰箱冷卻10min后用2%瓊脂糖凝膠電泳，緩沖溶液為TAE溶液。

根據(jù)凝膠電泳結(jié)果顯示，最佳反應(yīng)溫度為67℃（圖2）；最佳甜菜堿濃度為0.8mol· L-1（圖3）；最佳Mg2+濃度為4mmol· L-1（圖4）；最佳酶終濃度為0.32U·μL-1（圖5）。

圖2 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化

圖3 甜菜堿終濃度優(yōu)化

圖4 Mg2+濃度優(yōu)化

圖5 酶終濃度優(yōu)化

通過上述試驗探索確定了LAMP反應(yīng)的最佳體系。在20μL的體系中，各組分終濃度分別為: 1×等溫擴增緩沖液Ⅱ（含2mmol· L-1Mg2+）、0.2μmol· L-1外引物F3/B3、1.6μmol·L-1內(nèi)引物FIP/BIP、0.8mol· L-1甜菜堿、0.32U·μL-1Bst 3.0 DNA聚合酶、2mmol· L-1MgSO4，2μL dNTPs、0.5μL模板，補加ddH2O至20μL。

2.3 可視化檢測的建立

在體系中加入鈣黃綠素-MnCl2指示劑，陰性結(jié)果為橘黃色，陽性結(jié)果為綠色，通過配以綠色背景可以增加色差，輔助判斷（圖6）。

圖6 可視化檢測的建立

2.4 JEV-RT-LAMP檢測

提取接種JEV P3病毒株的BHK-21細胞總RNA，立即加入LAMP反應(yīng)體系進行反應(yīng)，以DEPC水為陰性對照，使用3%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示LAMP體系能夠?qū)崿F(xiàn)對JEV核酸的一步快速檢測（圖7）。

圖7 JEV病毒核酸RT-LAMP檢測

3 討論

JEV嚴重危害我國人畜健康，雖然自2007年起，乙腦疫苗加入國家免疫規(guī)劃，有效地降低了我國乙型腦炎發(fā)病率，但由于我國的氣候條件、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等諸多因素影響，個別省份的乙型腦炎發(fā)病率并未明顯下降，在2014年中國疾控中心就表示部分地區(qū)乙腦反彈的情況，并且我國JEV的流行株也從基因Ⅲ型轉(zhuǎn)為基因Ⅰ型[17]，因此研發(fā)一種新型的JEV快速檢測試劑十分必要。

而目前商業(yè)診斷試劑市場上針對JEV的血清學檢測的診斷效果有限，且成本高昂。核酸檢測成本較低，但常規(guī)RT-PCR和real-time PCR等仍存在著時間長、操作復(fù)雜的問題。這些方法都需要配備十分昂貴的相關(guān)精密儀器設(shè)備，人員也要經(jīng)過技術(shù)培訓，限制了它們在病毒快速診斷中的應(yīng)用，很難在野外、災(zāi)區(qū)、基層實驗室和豬場推廣使用。而LAMP技術(shù)的提出打破傳統(tǒng)核酸擴增技術(shù)需要溫度循環(huán)的常規(guī)，十分符合WHO制定的“ASSURED”診斷試劑標準，為核酸擴增技術(shù)普及、條件不足的基層開展現(xiàn)場檢測提供了方便[3，4]。

JEV屬于RNA病毒，傳統(tǒng)的LAMP反應(yīng)使用的Bst DNA聚合酶沒有逆轉(zhuǎn)錄活性，以往包括近些年的一些研究都是通過混合逆轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)對JEV核酸的檢測，如杜鵑[4]等研究者以LAMP技術(shù)為核心建立了兩步法和一步法兩種檢測JEV的方法，周玉鵬等[18]也建立了檢測基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的RTLAMP方法。而Bst 3.0 DNA聚合酶的出現(xiàn)能夠直接針對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增，使檢測更加便捷高效[19]，但相關(guān)報道不多。Silva等[19，20]使用Bst 3.0 DNA聚合酶實現(xiàn)對寨卡病毒的RT-LAMP檢測，表示Bst 3.0 DNA聚合酶在RNA酶抑制劑存在的條件下依然不影響其活性；高彥萍等[21]使用Bst 3.0 DNA聚合酶實現(xiàn)對馬鈴薯卷葉病毒的RT-LAMP檢測，但凝膠電泳顯示梯狀條紋并不清晰。因此本研究通過試驗，進一步明確了Bst 3.0 DNA聚合酶的高逆轉(zhuǎn)錄活性和DNA聚合酶活性。

關(guān)于LAMP檢測的高特異性和高靈敏度方面，已經(jīng)有大量文獻證實[4-10，12，19，20]，在指示劑、輔助劑、儲存方法等方面的發(fā)展也有大量文獻報道[8-10，12-16]，本文不在贅述。本試驗前期依據(jù)Notomi T等[5]在《Nucleic Acids Research》上發(fā)表的原始文獻設(shè)計引物，極易形成引物二聚體，加之65℃左右的恒溫不足以打開NS1質(zhì)粒的雙鏈，LAMP反應(yīng)過程又極易造成氣溶膠污染，對結(jié)果判定造成極大干擾。因此我們認為，在準備LAMP實驗過程中，引物的設(shè)計極為重要，應(yīng)當避免引物間3′端配對，產(chǎn)生引物二聚體。實驗過程中，應(yīng)當將電泳區(qū)與體系的反應(yīng)與配制區(qū)分開，反應(yīng)完成后置于4℃靜置10min后再電泳，這些舉措能夠減少氣溶膠的產(chǎn)生和對實驗造成的污染。甜菜堿對LAMP的輔助能力，不同文獻評價不一[4，14，21]，本試驗結(jié)果表明甜菜堿對LAMP反應(yīng)有著積極的作用，能夠使反應(yīng)效率提升。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗建立的新方法通過使用高逆轉(zhuǎn)錄活性和DNA聚合酶活性的Bst 3.0 DNA聚合酶，實現(xiàn)乙腦病毒RNA核酸的一步快速檢測，為研制一款靈敏度高、特異性強、檢測成本低、可在豬場和基層實驗室簡單操作的JEV快速檢測試劑盒提供了重要的參考，也為今后研發(fā)針對RNA病毒核酸的高效檢測方法提供了經(jīng)驗。