姚春陽，曹雨欣，徐文豪，馬先強(qiáng)

（1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600；2. 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 264000；

3. 濱州市濱城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心 256600；4. 惠民縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心 251700）

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種人獸共患的病原體，魏氏梭菌按照分泌毒素類型主要分為A、B、C、D、E五種類型[1，2]，A型菌引起人畜氣性壞疽，還可以引起馬匹的壞死性腸炎，B型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起羊羔痢疾、腸毒血癥，特別是一周內(nèi)的羊羔極易感染，臨床表現(xiàn)為腹瀉、食欲不振等，且一經(jīng)出現(xiàn)，致死快，救治困難，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是奶牛、犢牛及羊腸毒血癥、仔豬紅痢和雞的壞死性腸炎的主要病原菌，D型可引起羔羊、綿羊、山羊、牛及灰鼠腸毒血癥。E型偶爾引起犢牛和羔羊腸毒血癥[3-6]。魏氏梭菌為條件性致病菌，當(dāng)天氣、飼養(yǎng)條件驟變時(shí)往往導(dǎo)致牛、羊、雞、家兔等動(dòng)物發(fā)病，造成養(yǎng)殖戶的重大損失[7，8]。

B型產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生α、β、ε3種致死性毒素，β毒素是該菌主要致病因子之一，具有細(xì)胞毒性，β毒素可特異性地結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞上，引起血管壞死、出血和繼發(fā)的缺氧組織壞死，β毒素也能損害神經(jīng)系統(tǒng)，從而使動(dòng)物表現(xiàn)嚴(yán)重的精神沉郁[9]。β毒素基因可編碼 336個(gè)氨基酸分子量大小約為35 ku，本研究將β毒素基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序及截短表達(dá)，研究如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

B魏氏梭菌 C58- 1、pET32a（+） 和Ecoli. BL21感受態(tài)細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存和制備。

LB培養(yǎng)基為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pMD 18-T、限制性核酸內(nèi)切酶快切酶 BamHⅠ和SalⅠ、Premix Taq、T4DNA連接酶為TaKaRa 試劑公司所售，細(xì)菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組提取 根據(jù)Omega公司產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)品說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank: KP064405.1魏氏梭菌β毒素基因，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，如表1:

表1 引物序列及長(zhǎng)度

1.2.3 β毒素基因克隆

使用PCR技術(shù)擴(kuò)增β756片段，反應(yīng)參數(shù): 94℃ 3min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，共32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物回收，連接PMD 18-T載體后送生工上海測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.4 PETβ-756重組載體的構(gòu)建和初步鑒定

雙酶切所用酶為Qcut BamH Ⅰ和Q cutSal Ⅰ，表達(dá)質(zhì)粒和回收的β756基因同時(shí)用這兩個(gè)酶進(jìn)行鑒定，重組載體命名為PETβ-756。

1.2.5 β毒素基因的表達(dá)

將PETβ-756轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，涂板于氨芐霉素抗性平板上，過夜培養(yǎng)，挑取陽性單菌落，按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接入氨芐霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，37℃搖床180轉(zhuǎn)搖菌到OD600=0.6，加入IPTG 至終濃度 1mmol /L，37℃，180轉(zhuǎn)誘導(dǎo)培養(yǎng)5h后。

1.2.6 β756基因的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)

取4.5mL誘導(dǎo)后的重組表達(dá)菌，離心收集沉淀后用0.35mL的PH為7.4的無菌PBS重懸菌液，超聲破碎重組菌，離心后取沉淀并用0.35mL 8M的尿素進(jìn)行溶解，將誘導(dǎo)前樣本及誘導(dǎo)后樣本及沉淀用相關(guān)試劑進(jìn)行處理后，85℃水浴5min，使用12%的蛋白質(zhì)電泳膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析，跑完蛋白膠后，用市售的即用型考馬斯亮藍(lán)快速染色液進(jìn)行染色，染色后用脫色液對(duì)染色膠進(jìn)行脫色，次日用蒸餾水沖洗兩次，用蛋白膠照相儀對(duì)其觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 β毒素DNA的PCR擴(kuò)增及回收

β毒素DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后，在組外光下可見約678bp的基因條帶（圖1），與計(jì)劃中結(jié)果相符。

圖1 PEDV PCR擴(kuò)增β基因

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

重組載體PETβ-756經(jīng)過1.2.4中所用酶切鑒定后，在紫外光下756bp大小處可見相關(guān)β毒素基因片段，測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件分析后未發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)DNA堿基發(fā)生突變，這表明重組載體PETβ-756成功構(gòu)建。

2.3 β毒素基因的表達(dá)

經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后，在約45KD大小處有可見目的條帶，其大小與預(yù)期蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相符，經(jīng)BandScan5.0軟件分析表達(dá)的β毒素融合蛋白量約占胞內(nèi)總體蛋白量含量的20%（圖2）主要以不可溶形式存在。

圖2 β基因的SDSPAGE分析

3 討論

魏氏梭菌產(chǎn)生的毒素眾多，其中致死性毒素至少有12種，B型魏氏梭菌起主要致病作用的毒素有3種（α、β1、ε），β毒素蛋白序列與目前公布的所有產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和C型同源性均在99.4%以上，β毒素作為產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和C型重要毒素蛋白，具有良好的抗原性。本試驗(yàn)克隆了B型魏氏梭菌C58-1β毒素的主要抗原區(qū)域，并成功對(duì)克隆基因進(jìn)行了載體構(gòu)建及測(cè)序分析，而且本試驗(yàn)所構(gòu)建的含有β毒素截短基因的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)效率較高，表達(dá)量約菌體蛋白的20%。該蛋白的成功表達(dá)為今后魏氏梭菌亞單位疫苗的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。