梁佳明，王肖肖，張藍(lán)云，胡旭佳

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650093）

鮮味是食品質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，因為它影響著消費者對食品的偏好[1]。鮮味是5 種基本味覺之一，同時也是被理論界最后確認(rèn)的一種味道[2-3]。鮮味的概念提出于1908年[4]，鮮味是包括鮮味氨基酸、5’-呈味核苷酸、鮮味多肽在內(nèi)的多種鮮味物質(zhì)[5-7]與鮮味受體結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)啟動一系列復(fù)雜的信號傳遞過程，再經(jīng)由味覺神經(jīng)傳入到大腦的味覺中樞，經(jīng)分析整合產(chǎn)生的化學(xué)風(fēng)味[8]。鮮味受體是一種能響應(yīng)L-谷氨酸、一定程度上響應(yīng)L-天冬氨酸的C型G蛋白偶聯(lián)受體，這種受體是屬于T1R家族，包括T1R1和T1R3[9-11]。相關(guān)研究報道了味覺感受細(xì)胞中的通道蛋白CALHM1[12]，進一步闡述了這一路徑的分子機制。

鮮味物質(zhì)廣泛存在于各種天然產(chǎn)品中，包括奶酪、肉類、海鮮產(chǎn)品[13-15]，尤其是在蘑菇中。蘑菇令人愉悅的鮮味主要來源于多肽、呈味氨基酸及5’-核苷酸和有機酸[16-17]。不同類型的鮮味物質(zhì)與鮮味受體的作用方式不同，分子動力學(xué)實驗證明鮮味肽與鮮味受體T1R1/T1R3的結(jié)合域不同于其他鮮味物質(zhì)與鮮味受體結(jié)合的結(jié)合域，這也導(dǎo)致了鮮味肽具有獨特的味道[18-20]。鮮味肽是一種分子質(zhì)量小于5 000 u的寡肽。其風(fēng)味特征主要取決于氨基酸組成、肽鏈長度、末端氨基酸殘基、側(cè)鏈、帶電離子和空間結(jié)構(gòu)等[21-23]。鮮味肽最初從用木瓜蛋白酶處理過的牛肉中純化出來，一級結(jié)構(gòu)鑒定為Lys-Gly-Asp-Glu-Ser-Leu-Ala，具有明顯的鮮味。隨后，在各種食物中，陸續(xù)已經(jīng)有100多種鮮味肽被發(fā)現(xiàn)，如從帕爾馬火腿和金華火腿中分離并確認(rèn)的水溶性多肽Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val和Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr[24]；還有一些酸性多肽Asp-Glu-Ser、Glu-Asp-Glu、Thr-Glu和Ser-Glu-Glu[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，鮮味肽不僅不會掩蓋食物中的其他風(fēng)味，如酸、甜、苦和咸，它們還增強了這些風(fēng)味特征[27-28]。因此，它在蔬菜、肉類、乳制品甚至葡萄酒的風(fēng)味改良中有許多應(yīng)用[29-30]。但是關(guān)于鮮味肽的味覺特性仍存在爭議，需要發(fā)現(xiàn)更多的鮮味多肽闡述其鮮味機制和作用特性。

野生食用菌味道鮮美，云南是中國乃至全世界野生食用菌種質(zhì)資源最為豐富的地區(qū)[23]，云南野生食用菌有850多種，占全世界食用菌種的40%以上，占中國食用菌的90%以上[31]。據(jù)調(diào)查，云南省野生食用菌資源量50萬 t左右，社會產(chǎn)量10萬 t，產(chǎn)值約20億 元。居我國食用菌種類、自然產(chǎn)量、社會產(chǎn)量和出口量之首[32]。其中牛肝菌，物種繁多，而且其加工品也遠(yuǎn)銷歐美和日韓，是貿(mào)易量最大的野生食用菌之一，但是野生食用菌具有很強的季節(jié)性，僅產(chǎn)于每年的6—10月，目前仍以原料型或粗加工傳統(tǒng)產(chǎn)品為主，產(chǎn)品附加值低，在很大程度上影響了野生食用菌的消費量和市場，已難以滿足現(xiàn)代消費需求。如何最大限度地保持原有的風(fēng)味，進行科學(xué)的加工和貯藏是野生菌產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。

本研究根據(jù)野生牛肝菌的鮮美程度和消費量，選取蘭茂牛肝菌進行鮮味成分分析，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)對蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中的鮮味氨基酸及5’-核苷酸進行分析，選取具有強烈鮮味的菌蓋進行凝膠過濾色譜（gel filtration chromatography，GFC）和反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）的分離純化，對獲得的樣品通過納升級超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，nano UPLCMS/MS）檢測方法進行氨基酸序列檢測和分子質(zhì)量測定，每一過程均由感官評價進行指導(dǎo)實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘭茂牛肝菌購買于昆明木水花野生菌市場；Sephadex G15 上海麥克林生化試劑有限公司；5 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala），純度均大于98.0%） 美國Sigma公司；5 種核苷酸（5’-腺苷酸（5’-adenosine acid，5’-AMP）、5’-鳥苷酸（5’-guanosine acid，5’-GMP）、5’-胞苷酸（5’-cytidine acid，5’-CMP）、5’-尿苷酸（5’-uridine acid，5’-UMP）、5’-肌苷酸（5’-inosine acid，5’-IMP），純度均大于98.0%） 中國藥品生物制品檢定所。實驗中使用的化學(xué)試劑均為分析純，所有凍干粉末和合成的多肽都貯存在-40 ℃冰箱中。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DF-35粉碎機 溫嶺林大機械公司；超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；HC-3018R低溫高速離心機 安徽器械有限公司； 1260高效液相色譜儀美國Agilent公司；nano UPLC-MS/MS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 蘭茂牛肝菌水提物的制備

新鮮蘭茂牛肝菌菌柄和菌蓋分開清洗，切成片狀，烘干去水，制成干物質(zhì)，備用。按照1∶40（g/mL）的料液比，加入去離子水，置于高壓反應(yīng)釜中反應(yīng)2 h，于4 ℃、4 000 r/min離心20 min?；厥丈锨逡?，冷凍干燥，制得蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋水提物粉末，于-40 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘭茂牛肝菌中游離氨基酸含量的檢測

通過Waters AccQ·Tag柱前衍生法結(jié)合HPLC技術(shù)，對蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中的5 種游離氨基酸天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）進行定量分析。

樣品溶液的制備：將1.0 g蘭茂牛肝菌水提物干粉，用200 mL的50%乙醇溶液進行稀釋，超聲2 次，每次30 min，抽濾去渣，合并濾液，濾液80 ℃旋蒸近干，超純水定容至10 mL，待衍生。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：用0.1 mol/L HCl溶液對氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（1 nmol/μL）進行稀釋，配制成濃度分別為0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 nmol/μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

空白液的制備：0.1 mol/L鹽酸溶液。

衍生化處理：分別取上述三液各400 μL于1.5 mL離心管中，加入1 mol/L的衍生試劑A（1 mol/L三乙胺-乙腈溶液）200 μL，衍生試劑B（0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液）200 μL，加入正己烷800 μL，混勻，12 000 r/min離心5 min，取下層溶液，0.22 μm濾膜過濾，超聲5 min，待測。

HPLC條件：Waters AccQ·Tag分析柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動相A：10% AccQ?Tag的水溶液，流動相B：60%乙腈溶液；梯度洗脫條件：0～0.3 min，100%～97% A，0%～3% B；0.3～37 min，97%～95% A，3%～5% B；37～38 min，95%～89% A，5%～11% B；38～90 min，89%～67% A，11%～33% B；90～93 min，67% A，33% B；柱溫37 ℃；檢測波長254 nm；流速1 mL/min；進樣量20 μL。

1.3.3 蘭茂牛肝菌中核苷酸含量的檢測

采用HPLC技術(shù)檢測蘭茂牛肝菌中5’-核苷酸的含量。稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL溫水進行溶解，超聲15 min；用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)樣品的pH值至1.7±0.1，靜置1 min，用1 mol/L NaOH溶液將樣品的pH值調(diào)整至4.5±0.1。將溶液轉(zhuǎn)至50 mL刻度管中，去離子水反復(fù)清洗離心管3 次，轉(zhuǎn)移到刻度管中，去離子水定容至50 mL，混勻后經(jīng)濾紙過濾，濾液采用SAX固相萃取柱凈化，3 mL甲醇、3 mL水進行活化，取1 mL濾液上樣，抽至近干，1 mL磷酸二氫鉀進行洗脫，抽干，用磷酸二氫鉀定容至1 mL，混勻后0.22 μm濾膜過濾，待測。

HPLC條件：Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為10 mol/L磷酸二氫鉀（pH 5.6）溶液；等度洗脫；柱溫37 ℃；流速0.6 mL/min；檢測波長254 nm；進樣體積10 μL。

1.3.4 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋水提物感官分析

感官評估小組由10 名成員組成，男性5 名，女性5 名，年齡21～30 歲，均為無嗅覺和味覺障礙的專家。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)評估員方法（ISO-8586-12012：感官分析-感官評價員的挑選、訓(xùn)練和監(jiān)督的一般指南），所有團隊成員都接受了識別基本口味（包括甜味、苦味、酸味、咸味和鮮味）的培訓(xùn)，并擁有至少1 a的感官評估經(jīng)驗。評估在感官實驗室進行，該實驗室符合ISO國際標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)Zhang Jianan等[33]的報道，稍作修改。以氯化鈉（3.5 mg/mL）、蔗糖（10 mg/mL）、檸檬酸（0.8 mg/mL）、咖啡因（0.8 mg/mL）和谷氨酸鈉（3.5 mg/mL）-氯化鈉（3.5 mg/mL）分別用作咸、甜、酸、苦和鮮味的標(biāo)準(zhǔn)對照液。為了最大限度地減少純化過程中殘留試劑對感官評價的影響，待測樣品在測試前進行2 次凍干。將待測樣品的凍干粉末用去離子水配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，通過加入氫氧化鈉（1.0 mol/L）或鹽酸（1.0 mol/L）將樣品pH值調(diào)整至6.5。比較供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)對照溶液的味道，評估小組成員對供試品溶液給出0～12 分的味覺得分，0 分代表沒有味道，12 分代表具有強烈味道。為了避免疲勞和遺留影響，在2 個不同樣本的測試中，評估小組成員被要求用50～60 mL的飲用水漱口2 次，并休息2 min。結(jié)果為3 次重復(fù)實驗的平均值。

1.3.5 GFC分離

取樣品粉末溶于去離子水中，配制成20 mg/mL的樣品溶液。上樣于Sephadex G-15凝膠過濾色譜柱中，以去離子水為洗脫液，流速為0.75 mL/min。肽鍵在波長214 nm處有最大的吸收峰，回收波長214 nm處的餾出液。各餾分分別標(biāo)記為F1、F2、F3和F4，冷凍干燥，-40 ℃條件下貯存，備用。

1.3.6 RP-HPLC純化

選取GFC分離獲得的鮮味最強的組分，溶解于去離子水。進樣于Shim-Pack VP-ODS C18色譜柱（10 mm×250 mm）進一步純化，收集各組分，冷凍干燥，于-40 ℃貯存，備用。

RP-HPLC純化條件：HPLC系統(tǒng)；檢測波長214 nm；流動相A：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流動相B：0.1%三氟乙酸-水溶液；等比例洗脫；流速2 mL/min，進樣體積100 μL，樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

1.3.7 nano UPLC-MS/MS分析多肽的氨基酸序列和測定分子質(zhì)量

樣品制備：RP-HPLC純化出的鮮味較佳的組分，溶解于去離子水，加入二硫蘇糖醇，配制成終濃度為10 mmol/L的溶液，置于56 ℃水浴中還原1 h。加入吲哚-3-乙酸使其終濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)40 min，萃取物進行凍干。在nano UPLC-MS/MS分析前，用20 μL 0.1%甲酸溶液對凍干粉末進行重懸。

UPLC條件：Ultimate 3000系統(tǒng)；色譜柱：填料為C18-AQ樹脂（1.9 μm，100 ?）的反相納米柱（150 μm×15 cm）；流動相A：0.1%甲酸-水溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；線性洗脫梯度：0～5 min，6%～9% A，94%～91% B；5～20 min，9%～14% A，91%～86% B；20～50 min，14%～30% A，86%～70% B；50～58 min，30%～40% A，70%～60% B；58～60 min，40%～95% A，60%～5% B；流速600 nL/min；進樣體積5 μL。

MS條件：使用Q型混合型四極桿軌道阱質(zhì)譜儀進行肽段分析，噴霧電壓為2.2 kV，用于離子輸運的毛細(xì)管溫度為270 ℃。質(zhì)譜第一階段全掃描范圍設(shè)置為m/z300.0～1 600.0，分辨率60 000，分離寬度3.00 Da。串聯(lián)質(zhì)譜分析中采用一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜的掃描模式。依次選擇一級質(zhì)譜中離子強度最高的10 個離子進行二級串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)解離，每個樣品重復(fù)進樣一次。

1.3.8 GFC和RP-HPLC分離純化獲得的亞組分的感官評價

采用1.3.4節(jié)方法，對GFC和RP-HPLC分離純化獲得的亞組分進行感官評價，選取具有最強鮮味的組分進行進一步的實驗。

1.3.9 合成肽的感官描述和鮮味閾值的評估

nano UPLC-MS/MS檢測出的多肽序列委托無錫亞肽生物科技有限公司進行合成，合成肽的純度在98%以上。將合成肽溶解于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，按1.3.4節(jié)方法進行感官描述。

滋味稀釋分析實驗常用于檢測食品中的風(fēng)味成分并確定其閾值。本實驗采用滋味稀釋實驗，分析待測溶液中風(fēng)味成分的閾值。實驗前，以味精為標(biāo)準(zhǔn)對團隊成員進行訓(xùn)練，培訓(xùn)評價小組成員對味精味道的熟悉，以確保樣本評估的準(zhǔn)確性。用去離子水對合成多肽的凍干粉末進行溶解，并按1∶1的體積比逐漸稀釋。這一系列稀釋液按濃度上升的順序分配給感官評估小組成員，每個稀釋液取2 mL，品嘗5 s。在對每個樣本進行評估后，用去離子水清潔口腔數(shù)秒后，再品嘗下一個樣品，以避免疲勞和遺留影響。將供試溶液與2 個空白對照品（蒸餾水）進行比較。如果在某一濃度上，研究小組的成員能夠識別出味覺上的差異，那么稱此時的樣品濃度為可識別的閾值。對小組成員的評價結(jié)果進行記錄，評價過程中不允許討論和交流。結(jié)果為3 個重復(fù)實驗的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 21軟件進行單因素方差分析。采用S-N-K檢驗，比較各處理間的平均值，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭茂牛肝菌不同部位鮮味氨基酸差異

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程如表1所示，由回歸方程計算出樣品中氨基酸含量，結(jié)果見圖1，谷氨酸含量顯著高于另外4 種氨基酸（P＜0.05），在菌蓋中有著更高的含量。由于谷氨酸能夠作用于鮮味受體啟動細(xì)胞信號傳遞過程，產(chǎn)生鮮味味覺，因此蘭茂牛肝菌菌蓋是一個很好的鮮味物質(zhì)來源。

表1 氨基酸線性回歸方程和精密度Table 1 Linear regression equations and precision for umami amino acids

圖1 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中鮮味氨基酸含量變化Fig.1 Comparison of umami amino acid contents in stipe and pileus of L.asiatica

2.2 蘭茂牛肝菌不同部位核苷酸差異

對蘭茂牛肝菌中5 種5’-核苷酸進行分析，核苷酸線性回歸方程如表2所示。由回歸方程計算得出樣品中核苷酸含量，結(jié)果如圖2所示。樣品中5’-核苷酸含量范圍在（0.11±0.02）（菌柄5’-AMP）～（6.69±0.01）g/kg（菌蓋5’-IMP）之間，菌蓋中5’-核苷酸的含量顯著高于菌柄（P＜0.05）。有研究[34]表明，5’-核苷酸的含量可分為低（＜1 mg/g）、中等（1～5 mg/g）和高（＞5 mg/g）3 個范圍，其中菌蓋中的5’-CMP（（1.24±0.02）g/kg）和5’-IMP的含量屬于中等水平范圍，其余5’-核苷酸的含量則屬于低水平范圍。蘑菇中的5 種5’-核苷酸，均有報道顯示具有鮮味，其中5’-GMP、5’-IMP是主要的鮮味活性物質(zhì)，尤其是20世紀(jì)首次從香菇中分離出的5’-GMP更是一種比味精更強的增味劑。菌蓋中含有中等水平的5’-IMP，能夠增強菌蓋整體鮮味。

表2 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程Table 2 Linear regression equations for nucleotide standard

圖2 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中5’-核苷酸含量變化Fig.2 Comparison of 5’-nucleotide contents in stipe and pileus of L.asiatica

2.3 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋的感官分析

由圖3可知，菌柄與菌蓋在5 種味覺上有顯著差異（P＜0.05），菌蓋的鮮味得分（10.0±0.06）顯著高于菌柄（6.0±0.04），有較高的甜味得分（6.1±0.03），苦味得分最低（2.1±0.02）。菌蓋中鮮味氨基酸及核苷酸的含量較高，可以認(rèn)為菌蓋是一種很好的鮮味物質(zhì)來源。

圖3 蘭茂牛肝菌中菌柄及菌蓋的感官評價Fig.3 Sensory evaluation of stipe and pileus of L.asiatica

2.4 菌蓋水提物的凝膠過濾色譜純化及其純化組分感官分析

采用Sephadex G-15作為填充物的凝膠過濾色譜柱對具有更高鮮味強度菌蓋水提物進行分離純化，在波長214 nm處檢測餾出物，結(jié)果如圖4所示，共收集到4 個組分，分別命名為F1、F2、F3和F4。對F1、F2、F3和F4進行感官評價，結(jié)果見圖5，F(xiàn)1組分的鮮味強度為9.01±1.06，與F2（3.20±0.28）、F3（6.61±0.56）和F4（2.00±1.02）有顯著差異（P＜0.05），而酸味和苦味的強度較弱。且通過與圖3比較發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量組分F1與菌蓋水提物的味覺特性具有很好的相關(guān)性，并且表現(xiàn)出了很強烈的鮮味，是關(guān)鍵的味覺物質(zhì)。這些結(jié)果與先前的研究高度一致，即低分子質(zhì)量的組分構(gòu)成了食品中的主要味覺活性化合物[35]，并且具有更強的鮮味。因此，收集組分F1，進行進一步的分離純化實驗。

圖4 蘭茂牛肝菌粗提物的凝膠過濾色譜圖Fig.4 Gel filtration chromatogram of the crude extract of L.asiatica

圖5 蘭茂牛肝菌粗提物凝膠過濾色譜組分的感官評價Fig.5 Sensory evaluation of GPC components of the crude extract of L.asiatica

2.5 RP-HPLC純化組分的感官評價

采用RP-HPLC對F1組分進行分離純化，在波長214 nm處得到2 個組分，分別標(biāo)注為F1a和F1b，它們的保留時間分別為7.059 min和12.100 min，色譜圖如圖6所示。樣品進行感官評價，結(jié)果如圖7所示，在5 種基本味覺中，樣品的鮮味強度顯著高于其他味覺強度（P＜0.05），在鮮味味覺中，F(xiàn)1a（11.01±0.36）與F1b（6.08±0.52）具有顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)1a組分鮮味和甜味較強，酸味、苦味和咸味較弱，并且，F(xiàn)1a在波長214 nm的洗脫圖譜中呈單一峰，用于進一步的氨基酸序列分析和分子質(zhì)量的測定。

圖6 RP-HPLC純化鮮味肽的色譜圖Fig.6 Chromatogram of umami peptides purified by using RP-HPLC

圖7 RP-HPLC純化鮮味肽的感官評價Fig.7 Sensory evaluation of umami peptides purified by using RP-HPLC

2.6 F1a組分的氨基酸序列和分子質(zhì)量

采用nano UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對F1a組分中的鮮味肽進行氨基酸序列和分子質(zhì)量的分析，質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)使用Maxquant（1.6.2.10）檢索目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫，從數(shù)據(jù)庫中剔除不匹配肽段，共鑒定出3 條多肽，分別為FKDLGEENFK、KMDDFAAFVEK和LVNEVTEFAK，其分子質(zhì)量分別為1 225.598、1 357.622 Da和1 148.608 Da，這些肽的具體信息如圖8所示。

圖8 F1a的nano UPLC-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.8 Nano UPLC-MS/MS spectra of F1a

2.7 合成肽的感官評價

為了鑒定這3 條肽的口感特征，委托江蘇無錫亞肽生物科技有限公司合成這3 條肽，純度為98%以上，合成肽的信息如表3所示。將合成肽溶解在去離子水中進行感官評價和閾值分析，所有肽均呈現(xiàn)出鮮味，F(xiàn)KDLGEENFK、KMDDFAAFVEK和LVNEVTEFAK的閾值分別為9.78、10.25 mmol/L和13.01 mmol/L（表4）。

表3 合成肽信息Table 3 Information about synthetic peptides

表4 合成肽的感官評價Table 4 Sensory evaluation of synthetic peptides

多肽的味覺特性與氨基酸組成有關(guān)。采用Li Xuepeng等[36]的氨基酸分類方法，并根據(jù)氨基酸的理化性質(zhì)和口感特征略作修改，將氨基酸分為六大類：鮮味氨基酸、酸性氨基酸、甜味氨基酸、疏水氨基酸、親水性氨基酸和堿性氨基酸，如圖9所示。3 條合成多肽都含有豐富的鮮味氨基酸，含量占比分別為30%、45%和30%，這一類氨基酸是人類鮮味味覺受體T1R1/T1R3的陽性激活劑，有研究表明這類氨基酸是鮮味多肽的一個標(biāo)志[37]，在感官評價中，3 條多肽也表現(xiàn)出了明顯的鮮味與報道相同；并且，圖1顯示，菌蓋中游離氨基酸也含有豐富的鮮味氨基酸，為其鮮味提供了重要貢獻(xiàn)。第2組酸性氨基酸，分別為L-Glu和L-Asp。兩者都是重要的鮮味刺激物，通常包含在鮮味肽的氨基酸序列中[21]；第3組氨基酸分別為丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸被認(rèn)為是甜味氨基酸，在3 條多肽中含量分別為10%、18%和20%，甜味氨基酸利于鮮味肽的鮮味呈現(xiàn)；第4組氨基酸是疏水氨基酸，已經(jīng)觀察到大多數(shù)含有疏水氨基酸的多肽和疏水氨基酸的游離形式都會釋放出苦味，但是在感官評價中僅KMDDFAAFVEK品嘗到較明顯的苦味，另外2 條多肽并未品嘗到苦味，推測可能是由于多肽中含有的大量親水氨基酸，在形成高級空間結(jié)構(gòu)時，疏水氨基酸并未裸露出來，以及有較高甜味氨基酸影響了苦味的呈現(xiàn)；最后一組氨基酸是堿性氨基酸，堿性氨基酸、親水氨基酸和疏水氨基酸通常也是構(gòu)成鮮味肽必需的。有報道指出，多肽的C末端氨基酸殘基的差異對味覺效果有影響[38]。氨基酸殘基類型的不同可能影響肽的口感強度。Chaudhari等[20]研究表明，堿性C末端氨基酸殘基對肽和受體之間相互作用的活性部位有非常重要的影響。本研究鑒定的3 條多肽C末端氨基酸殘基均為K，這可能增強了合成肽的呈鮮強度。因此，酸性氨基酸、鮮味相關(guān)氨基酸和堿性C末端氨基酸，都對多肽的鮮味有貢獻(xiàn)。合成肽的味覺特征如表4所示，F(xiàn)KDLGEENFK、KMDDFAAFVEK和LVNEVTEFAK在水溶液中有較強的鮮味，F(xiàn)KDLGEENFK和LVNEVTEFAK有明顯的甜味，KMDDFAAFVEK有著輕微的苦味，另外3 條多肽都有輕微澀味，可能與合成過程中試劑的殘留有關(guān)。

圖9 3 條合成多肽的氨基酸組成圖Fig.9 Amino acid composition of three synthetic peptides

3 結(jié) 論

牛肝菌是一種很好的鮮味物質(zhì)來源，但是牛肝菌中鮮味物質(zhì)的研究甚少。本研究在相同的實驗條件下，選取蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋2 種不同的底物進行實驗，結(jié)果表明菌蓋中鮮味物質(zhì)更為豐富。并以菌蓋為材料進行牛肝菌中特色鮮味肽的提取分離，經(jīng)由nano UPLCMS/MS鑒定3 條新的鮮味肽，分別為FKDLGEENFK（1 225.598 Da）、KMDDFAAFVEK（1 357.622 Da）和LVNEVTEFAK（1 148.608 Da）。通過感官實驗對其風(fēng)味特征進行評價，結(jié)合評價結(jié)果對合成肽的氨基酸組成進行分析，結(jié)果顯示酸性氨基酸、鮮味相關(guān)氨基酸和堿性C末端氨基酸，都對多肽的鮮味有顯著影響。該研究結(jié)果為牛肝菌在食品加工中的進一步應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。