李秋瑩，徐瑾秀，張婧陽，孫 彤，勵建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是化能異養(yǎng)型的革蘭氏陰性菌，呈桿狀，無菌毛，有數(shù)根極端鞭毛，能分泌黃綠色熒光色素發(fā)出熒光，廣泛存在于土壤、水生環(huán)境和高蛋白高脂肪食品中[1]。其在4 ℃仍能生長繁殖，是引起低溫條件下水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的一種優(yōu)勢腐敗菌[2]。熒光假單胞菌具有較強的水解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，可以產(chǎn)生吲哚、苯酚、腐胺、尸胺、硫化氫等有毒物質(zhì)，并導(dǎo)致水產(chǎn)品感官不可接受性的黏液、異味[2]。熒光假單胞菌可在水產(chǎn)品生產(chǎn)設(shè)備表面形成生物膜，增強了其對水產(chǎn)品加工過程中各種環(huán)境壓力的耐受性，使其難以抑制[3]。此外，作為一種條件致病菌，熒光假單胞菌能夠?qū)е轮T如敗血癥、感染性休克及血管內(nèi)凝血等危害人體健康[4]。這嚴重降低了水產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性。因此，控制熒光假單胞菌的生長對延長水產(chǎn)品貨架期、提高水產(chǎn)品的安全性具有重要意義。

細菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal transduction system，TCS）能夠感應(yīng)環(huán)境變化，應(yīng)對環(huán)境變化引起的負面效應(yīng)[5]，參與調(diào)控細菌的趨化性、滲透壓、形態(tài)分化、營養(yǎng)物質(zhì)代謝、耐藥性等諸多生理過程[6]。通常TCS由組氨酸激酶（histidine kinase，HK）和對應(yīng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（response regulator，RR）組成[7]。當感受到胞外信號時，HK C端的組氨酸殘基（His）發(fā)生自磷酸化反應(yīng)，并將磷酸基團轉(zhuǎn)移到對應(yīng)RR位于N端的天冬氨酸殘基（Asp）上，磷酸化的RR可與靶基因結(jié)合并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達[8]。鑒于這種能識別和應(yīng)對多種環(huán)境刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制在細菌生存適應(yīng)中的重要作用，研究其在水產(chǎn)品熒光假單胞菌的作用機制，可為該腐敗菌的靶向控制提供新思路。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多微生物的基因組序列被公布。為進一步探究熒光假單胞菌對水產(chǎn)品腐敗的致腐機理，本實驗室前期對分離自冷藏大菱鲆的熒光假單胞菌PF08菌株進行全基因組測序和功能基因注釋。然而，TCS蛋白一般包括幾個互不相關(guān)的功能域，基因組注釋常常會因為整個編碼區(qū)相似度不高而導(dǎo)致注釋不準確[9]。目前，關(guān)于假單胞菌屬TCS的研究多集中在某個基因上，而缺少對于基因組中所有TCS的全面分析。因此，本研究采用生物信息學(xué)方法從全基因組范圍預(yù)測PF08菌株的TCS基因，將預(yù)測到的TCS與假單胞菌屬其他模式菌進行比較，并對其結(jié)構(gòu)、功能和進化關(guān)系進行分析，以期為進一步探究水產(chǎn)品熒光假單胞菌PF08菌株中TCS對環(huán)境適應(yīng)的調(diào)控機制及其致腐機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌PF08菌株分離自腐敗大菱鲆，是其優(yōu)勢腐敗菌，已完成全基因組測序，其序列（CP032618.1）可從美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載。熒光假單胞菌F113、銅綠假單胞菌PA01和惡臭假單胞菌KT2440的基因組信息來自NCBI，其相應(yīng)的TCS信息由微生物信號傳導(dǎo)數(shù)據(jù)庫MiST（http://mistdb.com/）檢索獲得[10]。

1.2 方法

1.2.1 TCS的鑒定

參照師舷等[11]的方法，利用TCS中HK和RR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域篩選熒光假單胞菌PF08中可能存在的HK和RR。HK的保守結(jié)構(gòu)域HATPase_c（Pfam02518）和RR的保守結(jié)構(gòu)域Response_reg（Pfam00072）下載自Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/），并用HMMER軟件（下載自http://hmmer.org/download.html）構(gòu)建該保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型（hmmbuild），然后在熒光假單胞菌PF08全基因組序列中用上述的隱馬爾科夫模型分別搜尋可能的HK和RR（hmmsearch）。通過NCBI的BLASTp程序確認搜到的HK和RR，確認標準如下：1）催化結(jié)構(gòu)域HATPase_c必須位于HK的C末端，且其上游具有二聚化或磷酸化結(jié)構(gòu)域HisKA；2）RR的N-末端具有磷酸受體結(jié)構(gòu)域REC[11]?；蜷g距小于300 bp的HK和RR為成對TCS；同時擁有HisKA和REC結(jié)構(gòu)域的蛋白為融合HK；單個的HK或RR定義為孤兒HK或RR[12]。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析利用SMART（Simple Modular Architecture Research Tool，http://smart.embl-heidelberg.de）完成；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行預(yù)測；采用Clustal X分別對HK和RR進行多重序列比，并利用MEGA7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）建立系統(tǒng)發(fā)育樹；從京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫中獲取TCS的功能信息，同時參考已研究細菌TCS的功能對熒光假單胞菌PF08中各TCS的功能進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單胞菌PF08基因組中TCS的鑒定

利用保守結(jié)構(gòu)域HATPase_c（Pfam02518）和Response_reg（Pfam00072）對熒光假單胞菌PF08菌株全基因組中的TCS進行了搜索。結(jié)果表明，熒光假單胞菌PF08共有147 個TCS基因，63 個基因編碼HK蛋白（38 個經(jīng)典HK和25 個融合HK），其中32 個經(jīng)典HK和7 個融合HK與相應(yīng)RR組成了39 個成對TCS（表1）。另外84 個基因編碼RR蛋白，包括39 個HK-RR對和45 個孤兒RR。其中，AYG05564.1、AYG05979.1、AYG05997.1、AYG06213.1、AYG07392.1、AYG08306.1、AYG09608.1、AYG010767.1等基因所編碼的蛋白質(zhì)只有HATPase_c結(jié)構(gòu)域而缺少HisKA結(jié)構(gòu)域，本研究沒有將它們歸為TCS基因；AYG06573.1和AYG07073.1僅有HATPase_c結(jié)構(gòu)域和REC結(jié)構(gòu)域而缺少HisKA結(jié)構(gòu)域，因此本研究將其歸為RR而非融合HK[11-12]。

表1 熒光假單胞菌PF08全基因組中TCSTable 1 TCSs in the whole genome of P.fluorescens PF08

MiST數(shù)據(jù)庫檢索到假單胞菌屬其他菌株TCS信息，并與熒光假單胞菌PF08菌株在基因組大小、TCS基因數(shù)量、HK和RR組成情況進行比較分析（表2）。有研究表明TCS總蛋白數(shù)目與基因組大小呈正比[13]。熒光假單胞菌PF08菌株的基因組大小、基因組中蛋白數(shù)目均小于熒光假單胞菌F113、銅綠假單胞菌PA01和惡臭假單胞菌KT2440，然而其TCS基因數(shù)目卻更接近于基因組最大的熒光假單胞菌模式菌株F113，分別多于銅綠假單胞菌PA01和惡臭假單胞菌KT2440 27 個和20 個，這可能是因為熒光假單胞菌PF08和F113親緣關(guān)系更近，此外TCS基因數(shù)目差異也與菌株的生存環(huán)境及進化的不同有關(guān)[14]。

表2 熒光假單胞菌PF08菌株與假單胞菌屬其他模式菌的基因組信息和TCS基因比較Table 2 Genome information and TCS genes of P.fluorescens PF08 and other members of Pseudomonas genus

2.2 熒光假單胞菌PF08中HK結(jié)構(gòu)域組成及分類

大部分HK是具有多個結(jié)構(gòu)域且能夠形成同型二聚體的跨膜蛋白[15]。HK的跨膜區(qū)與胞外信號感受有關(guān)。TMHMM Server v.2.0對HK蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果顯示，39 個成對TCS中32 個HK具有至少1 個跨膜區(qū)，6 個孤兒HK中有3 個具有跨膜區(qū)，25 個融合HK中有13 個具有跨膜區(qū)，表明以跨膜區(qū)來看成對TCS的HK蛋白是監(jiān)測胞外環(huán)境變化的主要蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同，熒光假單胞菌PF08菌株中的HK可以分為25 種。38 個經(jīng)典HK分為10 種（圖1a），其中17 個HK蛋白含有HAMP、HATPase_c和HisKA 3 個結(jié)構(gòu)域，9 個HK蛋白僅含有HATPase_c和HisKA 2 個結(jié)構(gòu)域，4 個HK蛋白含PAS、HATPase_c和HisKA 3 個結(jié)構(gòu)域，2 個HK蛋白同時含有HAMP、PAS和HATPase_c和HisKA 4 個結(jié)構(gòu)域，其余6 個HK蛋白含有各異的結(jié)構(gòu)域組合。25 個融合HK分為15 種（圖1b）。這表明與經(jīng)典HK相比，融合HK的數(shù)目雖少，但其結(jié)構(gòu)域組成及功能更為復(fù)雜。該菌株中所有的HK的C端均具有HK的典型結(jié)構(gòu)域HATPase_c和HisKA（部分HK的HATPase_c和HisKA位于N端），其中AYG07090.1、AYG10324.1中H-kinase_dim結(jié)構(gòu)域是HisKA形成二聚體的區(qū)域。HATPase_c結(jié)構(gòu)域是位于胞內(nèi)的HK的催化結(jié)構(gòu)域，負責將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到組氨酸上，HisKA是接受磷酸的受體結(jié)構(gòu)域，它們是磷酸基團傳遞的重要基礎(chǔ)。在HK的N端，除跨膜區(qū)外，大部分HK還存在不同結(jié)構(gòu)域，使HK的結(jié)構(gòu)和功能具有多樣性[11]，如HAMP、PAS、HPT、PBPb、PAC、CHASE2、CheW、GAF。

圖1 PF08菌株中部分HK的結(jié)構(gòu)域組成Fig.1 Structural domains of part of histidine kinases in P.fluorescens PF08

HAMP結(jié)構(gòu)域是一個約50 個氨基酸的α-螺旋區(qū)，存在于HK、腺嘌呤環(huán)化酶、甲基接受蛋白和磷酸酶中，主要功能可能是感應(yīng)與細菌細胞滲透相關(guān)的信號。PAS結(jié)構(gòu)域作為一種信號傳感器結(jié)構(gòu)域可通過相關(guān)輔助因子感應(yīng)外界氧、氧化還原電位和光的變化，參與調(diào)控細菌氧化還原反應(yīng)；此外，AYG10156.1、AYG06111.1、AYG08460.1、AYG08660.1中除PAS結(jié)構(gòu)域外還含有PAC結(jié)構(gòu)域，PAC結(jié)構(gòu)域常與PAS結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成保守的三維PAS折疊。HPT結(jié)構(gòu)域主要參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。PBPb是細菌周質(zhì)底物結(jié)合蛋白，通常與溶質(zhì)結(jié)合的性質(zhì)有關(guān)。PAC結(jié)構(gòu)域有助于三維PAS折疊形成。CHASE2結(jié)構(gòu)域是一個胞外信號感應(yīng)區(qū)域，存在于細菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游的各種跨膜受體中，但由其識別的環(huán)境因素目前尚不清楚。CheW結(jié)構(gòu)域存在于參與細菌趨化性調(diào)控的TCS中，參與調(diào)控細菌趨化性。GAF結(jié)構(gòu)域主要對環(huán)核苷酸結(jié)合發(fā)揮作用。除N端的功能結(jié)構(gòu)域外，部分HK的C端也存在結(jié)構(gòu)域，如HPT結(jié)構(gòu)域、CheW結(jié)構(gòu)域及所有融合HK均存在的REC結(jié)構(gòu)域（部分融合HK的REC結(jié)構(gòu)域位于N端），其中融合HK AYG10324.1中CheW結(jié)構(gòu)域和REC結(jié)構(gòu)域相鄰，該結(jié)構(gòu)域組成與有些細菌含有的一種雙結(jié)構(gòu)域融合蛋白CheV相似[16]，因此推測其可能具有相似的功能，都是通過與趨化受體蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)細菌趨化性。

2.3 熒光假單胞菌PF08中RR結(jié)構(gòu)域組成及分類

RR可以通過與下游基因結(jié)合調(diào)控基因的表達[17]。利用SMART預(yù)測熒光假單胞菌PF08菌株中RR的結(jié)構(gòu)域組成，并對其進行功能預(yù)測。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的差異，PF08菌株中的RR蛋白可以分為15 類（圖2），其中含有REC和Trans reg_C結(jié)構(gòu)域的RR蛋白最多，共24 個；其次為含REC和HTH LUXR的蛋白，共19 個，只含REC的蛋白16 個，這3 種蛋白占總RR的70%以上。

圖2 PF08菌株中部分RR的結(jié)構(gòu)域組成Fig.2 Structural domains of part of response regulators in P.fluorescens PF08

位于N端的磷酸受體結(jié)構(gòu)域REC是所有RR蛋白所必需的（AYG07785.1、AYG09151.1、AYG06573.1的磷酸受體結(jié)構(gòu)域位于C端），此結(jié)構(gòu)域中含有一個保守的天冬氨酸殘基，可接收由對應(yīng)HK傳遞的磷酸基團。此外，RR蛋白的C端一般還具有一個輸出結(jié)構(gòu)域（AYG07785.1、AYG09151.1、AYG06573.1的輸出結(jié)構(gòu)域位于N端）。PF08菌株的輸出結(jié)構(gòu)域主要包括DNA結(jié)合輸出域（AAA、HTH LUXR、Trans reg_C、LytTR）、RNA結(jié)合輸出域（ANTAR）、蛋白質(zhì)結(jié)合輸出域（CheW）和酶功能域（EAL、GGDEF、PP2C_SIG），不同輸出結(jié)構(gòu)域具有不同的生物學(xué)功能。如AAA輸出結(jié)構(gòu)域參與細胞膜融合、蛋白質(zhì)水解和DNA復(fù)制等多種細胞活動。ANTAR發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抗中止作用。CheW調(diào)控細菌趨化性。EAL輸出結(jié)構(gòu)域可以刺激第2信使環(huán)鳥苷二磷酸的降解，并且是二鳥苷磷酸二酯酶功能的一個很好的候補者，其與GGDEF結(jié)構(gòu)域共存時可能與細菌細胞表面黏附性有關(guān)。GGDEF參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可能催化環(huán)二鳥苷二磷酸的合成或水解。HTH LUXR可以作為群體感應(yīng)調(diào)控發(fā)光的轉(zhuǎn)錄激活因子；Trans reg_C可能在DNA結(jié)合中發(fā)揮作用。PP2C_SIG作為一個模塊存在于不同的結(jié)構(gòu)環(huán)境中，并通過靶向和調(diào)節(jié)亞基進行調(diào)控。LytTR常存在于GC含量較少的革蘭氏陰性菌中，參與細胞的自溶調(diào)控。此外，CheY亞家族的RR蛋白無輸出結(jié)構(gòu)域，其可能通過其他方式發(fā)揮作用。

2.4 熒光假單胞菌PF08的HK和RR蛋白進化分析

利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法對熒光假單胞菌PF08菌株的HK和RR構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。從進化關(guān)系看，HK共分為3 個聚簇（圖3a）。融合HK中除AYG07832.1、AYG07961.1、AYG08460.1、AYG08488.1、AYG09609.1和AYG10324.1外，其余19 個融合HK皆位于同一聚簇；除AYG05642.1外，其余經(jīng)典HK皆位于其余2 個聚簇。這表明典型HK和融合HK的親緣關(guān)系較遠，其行使不同的功能。與HK相比，RR在長度和組成上都相對保守[18]。熒光假單胞菌PF08菌株的RR的系統(tǒng)發(fā)生樹共分為6 個聚簇，含有REC和Trans reg_C結(jié)構(gòu)域的RR白皆位于同一聚簇；除AYG06114.1外，含REC和HTH LUXR的RR蛋白皆位于相鄰的2 個聚簇；其他具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白也多位于同一聚簇（圖3b）。基因共同聚簇顯示了高度同源性，表明這些位于同一聚簇且結(jié)構(gòu)域相同的蛋白可能具有相近的功能。

圖3 HK（a）和RR（b）的蛋白進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of histidine kinases (a) and response regulators (b) in P.fluorescens PF08

2.5 熒光假單胞菌PF08的TCS功能預(yù)測

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對熒光假單胞菌PF08菌株的39 對TCS進行的同源性分析，并結(jié)合相關(guān)文獻報道對其功能作出預(yù)測。目前，KEGG數(shù)據(jù)庫中TCS可分為OmpR、NarL、Spo、CitB、LytTR、NtrC、CheA、Cell cycle、Lux、LuxR和其他家族11 個亞家族。熒光假單胞菌PF08中25 對TCS分別來自于NtrC（KinB-AlgB、GlnL-GlnG、DctB-DctD）、OmpR（EnvZ-OmpR、CusS-CusR、TctE-TctD、KdpD-KdpE、QseC-QseB、PfeS-PfeR、ParS-ParR、PhoQ-PhoP、RstB-RstA、CreC-CreB、PhoR-PhoB）、CheA（CheA-CheYBV、RstB-RstA）、NarL（EvgS-EvgA）和其他家族（FlrBFlrC、AauS-AauR、RegB-RegA），此外，還有14 對TCS未在KEGG數(shù)據(jù)庫中搜索到相關(guān)信息。

由表3可知，熒光假單胞菌PF08中TCS的功能主要包括參與營養(yǎng)元素代謝，如調(diào)控海藻酸合成、酸性氨基酸的利用、氮調(diào)控、氧化還原反應(yīng)、磷酸鹽調(diào)控；參與生物體內(nèi)物質(zhì)運輸，如檸檬酸轉(zhuǎn)運、C4二羧酸轉(zhuǎn)運、鉀鎂離子運輸；調(diào)節(jié)細胞形態(tài)分化及應(yīng)對不利環(huán)境，如極性鞭毛合成、趨化性、群體感應(yīng)、滲透壓脅迫響應(yīng)、缺磷響應(yīng)；與細胞抗性和毒力相關(guān)，如銅離子抗性、耐酸和耐藥性、多黏菌素抗藥性、腸桿菌素依賴性鐵獲取。其中，由經(jīng)典HK與相應(yīng)RR組成的32 對TCS中有23 對的功能作出了預(yù)測，而7 對由融合HK組成的TCS只有2 對發(fā)現(xiàn)了生物學(xué)功能，這可能是因為融合HK同時具有HK的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和RR的信號接收結(jié)構(gòu)域，在感應(yīng)外界信號、傳導(dǎo)及接受信號過程中具有更加靈活的調(diào)控功能[38]。熒光假單胞菌之所以能成為冷藏水產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌，不僅得益于其超強的水解蛋白質(zhì)和脂肪能力，還來源于其應(yīng)對逆境時的多種生理機能。預(yù)測分析結(jié)果表明TCS可以調(diào)控熒光假單胞菌PF08的多種生理生化過程。存在參與熒光假單胞菌PF08營養(yǎng)元素代謝和生物體內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)腡CS，這對熒光假單胞菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)攝取及能量利用十分重要。此外，部分TCS還可以調(diào)控熒光假單胞菌PF08的細胞抗性和毒力及環(huán)境適應(yīng)性，這些調(diào)控通路對研究熒光假單胞菌的靶向控制十分重要。當前對熒光假單胞菌腐敗機理研究最為廣泛的是群體感應(yīng)，這是細菌之間信息交換的一種機制，依賴菌群密度調(diào)節(jié)細菌的許多生理功能，影響熒光假單胞菌的腐敗能力[39]。而本研究也發(fā)現(xiàn)了2 對與群體感應(yīng)有關(guān)的TCS，AYG07414.1/AYG07413.1和AYG08957.1/AYG08956.1。對TCS的功能預(yù)測有利于這些與熒光假單胞菌PF08腐敗機理有關(guān)的基因的進一步的研究，同時為該腐敗菌的靶向控制提供新思路。

表3 熒光假單胞菌PF08的TCS功能預(yù)測Table 3 Functional prediction of TCSs of P.fluorescens PF08

3 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)方法在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)分析了水產(chǎn)品熒光假單胞菌PF08菌株中TCS的數(shù)量、類型及功能。熒光假單胞菌PF08菌株中共存在39 對TCS。雖然系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些TCS在進化上存在較近的親緣關(guān)系，但它們的結(jié)構(gòu)域組成呈現(xiàn)多樣化，是其功能多樣化的基礎(chǔ)。25 對TCS預(yù)測到生物學(xué)功能，主要為參與調(diào)控營養(yǎng)元素代謝、生物體內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞形態(tài)分化、應(yīng)對不利環(huán)境及細胞抗性和毒力等，表明TCS在熒光假單胞菌的生存適應(yīng)過程中起到至關(guān)重要的作用。對于這些TCS在熒光假單胞菌中的調(diào)控機制仍需要通過實驗進一步驗證，特別是尚未獲得功能預(yù)測的TCS。本研究分析結(jié)果為進一步探究熒光假單胞菌生存適應(yīng)及致腐機制提供了一定的參考，并且TCS可以作為一種有潛力的熒光假單胞菌的新抑制靶點。