李秋瑩，徐瑾秀，張婧陽，孫 彤，勵建榮

（渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是化能異養(yǎng)型的革蘭氏陰性菌，呈桿狀，無菌毛，有數(shù)根極端鞭毛，能分泌黃綠色熒光色素發(fā)出熒光，廣泛存在于土壤、水生環(huán)境和高蛋白高脂肪食品中[1]。其在4 ℃仍能生長繁殖，是引起低溫條件下水產品腐敗變質的一種優(yōu)勢腐敗菌[2]。熒光假單胞菌具有較強的水解蛋白質和脂肪的能力，可以產生吲哚、苯酚、腐胺、尸胺、硫化氫等有毒物質，并導致水產品感官不可接受性的黏液、異味[2]。熒光假單胞菌可在水產品生產設備表面形成生物膜，增強了其對水產品加工過程中各種環(huán)境壓力的耐受性，使其難以抑制[3]。此外，作為一種條件致病菌，熒光假單胞菌能夠導致諸如敗血癥、感染性休克及血管內凝血等危害人體健康[4]。這嚴重降低了水產品的品質和安全性。因此，控制熒光假單胞菌的生長對延長水產品貨架期、提高水產品的安全性具有重要意義。

細菌的雙組分信號轉導系統(tǒng)（two-component signal transduction system，TCS）能夠感應環(huán)境變化，應對環(huán)境變化引起的負面效應[5]，參與調控細菌的趨化性、滲透壓、形態(tài)分化、營養(yǎng)物質代謝、耐藥性等諸多生理過程[6]。通常TCS由組氨酸激酶（histidine kinase，HK）和對應的應答調節(jié)蛋白（response regulator，RR）組成[7]。當感受到胞外信號時，HK C端的組氨酸殘基（His）發(fā)生自磷酸化反應，并將磷酸基團轉移到對應RR位于N端的天冬氨酸殘基（Asp）上，磷酸化的RR可與靶基因結合并調控其轉錄表達[8]。鑒于這種能識別和應對多種環(huán)境刺激的信號轉導機制在細菌生存適應中的重要作用，研究其在水產品熒光假單胞菌的作用機制，可為該腐敗菌的靶向控制提供新思路。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多微生物的基因組序列被公布。為進一步探究熒光假單胞菌對水產品腐敗的致腐機理，本實驗室前期對分離自冷藏大菱鲆的熒光假單胞菌PF08菌株進行全基因組測序和功能基因注釋。然而，TCS蛋白一般包括幾個互不相關的功能域，基因組注釋常常會因為整個編碼區(qū)相似度不高而導致注釋不準確[9]。目前，關于假單胞菌屬TCS的研究多集中在某個基因上，而缺少對于基因組中所有TCS的全面分析。因此，本研究采用生物信息學方法從全基因組范圍預測PF08菌株的TCS基因，將預測到的TCS與假單胞菌屬其他模式菌進行比較，并對其結構、功能和進化關系進行分析，以期為進一步探究水產品熒光假單胞菌PF08菌株中TCS對環(huán)境適應的調控機制及其致腐機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌PF08菌株分離自腐敗大菱鲆，是其優(yōu)勢腐敗菌，已完成全基因組測序，其序列（CP032618.1）可從美國國立生物技術信息中心網站（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載。熒光假單胞菌F113、銅綠假單胞菌PA01和惡臭假單胞菌KT2440的基因組信息來自NCBI，其相應的TCS信息由微生物信號傳導數(shù)據(jù)庫MiST（http://mistdb.com/）檢索獲得[10]。

1.2 方法

1.2.1 TCS的鑒定

參照師舷等[11]的方法，利用TCS中HK和RR蛋白的保守結構域篩選熒光假單胞菌PF08中可能存在的HK和RR。HK的保守結構域HATPase_c（Pfam02518）和RR的保守結構域Response_reg（Pfam00072）下載自Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/），并用HMMER軟件（下載自http://hmmer.org/download.html）構建該保守結構域的隱馬爾科夫模型（hmmbuild），然后在熒光假單胞菌PF08全基因組序列中用上述的隱馬爾科夫模型分別搜尋可能的HK和RR（hmmsearch）。通過NCBI的BLASTp程序確認搜到的HK和RR，確認標準如下：1）催化結構域HATPase_c必須位于HK的C末端，且其上游具有二聚化或磷酸化結構域HisKA；2）RR的N-末端具有磷酸受體結構域REC[11]?；蜷g距小于300 bp的HK和RR為成對TCS；同時擁有HisKA和REC結構域的蛋白為融合HK；單個的HK或RR定義為孤兒HK或RR[12]。

1.2.2 生物信息學分析

蛋白保守結構域的分析利用SMART（Simple Modular Architecture Research Tool，http://smart.embl-heidelberg.de）完成；蛋白跨膜結構域采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行預測；采用Clustal X分別對HK和RR進行多重序列比，并利用MEGA7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）建立系統(tǒng)發(fā)育樹；從京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫中獲取TCS的功能信息，同時參考已研究細菌TCS的功能對熒光假單胞菌PF08中各TCS的功能進行預測。

2 結果與分析

2.1 熒光假單胞菌PF08基因組中TCS的鑒定

利用保守結構域HATPase_c（Pfam02518）和Response_reg（Pfam00072）對熒光假單胞菌PF08菌株全基因組中的TCS進行了搜索。結果表明，熒光假單胞菌PF08共有147 個TCS基因，63 個基因編碼HK蛋白（38 個經典HK和25 個融合HK），其中32 個經典HK和7 個融合HK與相應RR組成了39 個成對TCS（表1）。另外84 個基因編碼RR蛋白，包括39 個HK-RR對和45 個孤兒RR。其中，AYG05564.1、AYG05979.1、AYG05997.1、AYG06213.1、AYG07392.1、AYG08306.1、AYG09608.1、AYG010767.1等基因所編碼的蛋白質只有HATPase_c結構域而缺少HisKA結構域，本研究沒有將它們歸為TCS基因；AYG06573.1和AYG07073.1僅有HATPase_c結構域和REC結構域而缺少HisKA結構域，因此本研究將其歸為RR而非融合HK[11-12]。

表1 熒光假單胞菌PF08全基因組中TCSTable 1 TCSs in the whole genome of P.fluorescens PF08

MiST數(shù)據(jù)庫檢索到假單胞菌屬其他菌株TCS信息，并與熒光假單胞菌PF08菌株在基因組大小、TCS基因數(shù)量、HK和RR組成情況進行比較分析（表2）。有研究表明TCS總蛋白數(shù)目與基因組大小呈正比[13]。熒光假單胞菌PF08菌株的基因組大小、基因組中蛋白數(shù)目均小于熒光假單胞菌F113、銅綠假單胞菌PA01和惡臭假單胞菌KT2440，然而其TCS基因數(shù)目卻更接近于基因組最大的熒光假單胞菌模式菌株F113，分別多于銅綠假單胞菌PA01和惡臭假單胞菌KT2440 27 個和20 個，這可能是因為熒光假單胞菌PF08和F113親緣關系更近，此外TCS基因數(shù)目差異也與菌株的生存環(huán)境及進化的不同有關[14]。

表2 熒光假單胞菌PF08菌株與假單胞菌屬其他模式菌的基因組信息和TCS基因比較Table 2 Genome information and TCS genes of P.fluorescens PF08 and other members of Pseudomonas genus

2.2 熒光假單胞菌PF08中HK結構域組成及分類

大部分HK是具有多個結構域且能夠形成同型二聚體的跨膜蛋白[15]。HK的跨膜區(qū)與胞外信號感受有關。TMHMM Server v.2.0對HK蛋白跨膜區(qū)的預測結果顯示，39 個成對TCS中32 個HK具有至少1 個跨膜區(qū)，6 個孤兒HK中有3 個具有跨膜區(qū)，25 個融合HK中有13 個具有跨膜區(qū)，表明以跨膜區(qū)來看成對TCS的HK蛋白是監(jiān)測胞外環(huán)境變化的主要蛋白。根據(jù)結構域的不同，熒光假單胞菌PF08菌株中的HK可以分為25 種。38 個經典HK分為10 種（圖1a），其中17 個HK蛋白含有HAMP、HATPase_c和HisKA 3 個結構域，9 個HK蛋白僅含有HATPase_c和HisKA 2 個結構域，4 個HK蛋白含PAS、HATPase_c和HisKA 3 個結構域，2 個HK蛋白同時含有HAMP、PAS和HATPase_c和HisKA 4 個結構域，其余6 個HK蛋白含有各異的結構域組合。25 個融合HK分為15 種（圖1b）。這表明與經典HK相比，融合HK的數(shù)目雖少，但其結構域組成及功能更為復雜。該菌株中所有的HK的C端均具有HK的典型結構域HATPase_c和HisKA（部分HK的HATPase_c和HisKA位于N端），其中AYG07090.1、AYG10324.1中H-kinase_dim結構域是HisKA形成二聚體的區(qū)域。HATPase_c結構域是位于胞內的HK的催化結構域，負責將ATP的磷酸基團轉移到組氨酸上，HisKA是接受磷酸的受體結構域，它們是磷酸基團傳遞的重要基礎。在HK的N端，除跨膜區(qū)外，大部分HK還存在不同結構域，使HK的結構和功能具有多樣性[11]，如HAMP、PAS、HPT、PBPb、PAC、CHASE2、CheW、GAF。

圖1 PF08菌株中部分HK的結構域組成Fig.1 Structural domains of part of histidine kinases in P.fluorescens PF08

HAMP結構域是一個約50 個氨基酸的α-螺旋區(qū)，存在于HK、腺嘌呤環(huán)化酶、甲基接受蛋白和磷酸酶中，主要功能可能是感應與細菌細胞滲透相關的信號。PAS結構域作為一種信號傳感器結構域可通過相關輔助因子感應外界氧、氧化還原電位和光的變化，參與調控細菌氧化還原反應；此外，AYG10156.1、AYG06111.1、AYG08460.1、AYG08660.1中除PAS結構域外還含有PAC結構域，PAC結構域常與PAS結構域結合形成保守的三維PAS折疊。HPT結構域主要參與磷酸基團的轉移反應。PBPb是細菌周質底物結合蛋白，通常與溶質結合的性質有關。PAC結構域有助于三維PAS折疊形成。CHASE2結構域是一個胞外信號感應區(qū)域，存在于細菌信號轉導通路上游的各種跨膜受體中，但由其識別的環(huán)境因素目前尚不清楚。CheW結構域存在于參與細菌趨化性調控的TCS中，參與調控細菌趨化性。GAF結構域主要對環(huán)核苷酸結合發(fā)揮作用。除N端的功能結構域外，部分HK的C端也存在結構域，如HPT結構域、CheW結構域及所有融合HK均存在的REC結構域（部分融合HK的REC結構域位于N端），其中融合HK AYG10324.1中CheW結構域和REC結構域相鄰，該結構域組成與有些細菌含有的一種雙結構域融合蛋白CheV相似[16]，因此推測其可能具有相似的功能，都是通過與趨化受體蛋白的相互作用來調節(jié)細菌趨化性。

2.3 熒光假單胞菌PF08中RR結構域組成及分類

RR可以通過與下游基因結合調控基因的表達[17]。利用SMART預測熒光假單胞菌PF08菌株中RR的結構域組成，并對其進行功能預測。根據(jù)結構域的差異，PF08菌株中的RR蛋白可以分為15 類（圖2），其中含有REC和Trans reg_C結構域的RR蛋白最多，共24 個；其次為含REC和HTH LUXR的蛋白，共19 個，只含REC的蛋白16 個，這3 種蛋白占總RR的70%以上。

圖2 PF08菌株中部分RR的結構域組成Fig.2 Structural domains of part of response regulators in P.fluorescens PF08

位于N端的磷酸受體結構域REC是所有RR蛋白所必需的（AYG07785.1、AYG09151.1、AYG06573.1的磷酸受體結構域位于C端），此結構域中含有一個保守的天冬氨酸殘基，可接收由對應HK傳遞的磷酸基團。此外，RR蛋白的C端一般還具有一個輸出結構域（AYG07785.1、AYG09151.1、AYG06573.1的輸出結構域位于N端）。PF08菌株的輸出結構域主要包括DNA結合輸出域（AAA、HTH LUXR、Trans reg_C、LytTR）、RNA結合輸出域（ANTAR）、蛋白質結合輸出域（CheW）和酶功能域（EAL、GGDEF、PP2C_SIG），不同輸出結構域具有不同的生物學功能。如AAA輸出結構域參與細胞膜融合、蛋白質水解和DNA復制等多種細胞活動。ANTAR發(fā)揮轉錄抗中止作用。CheW調控細菌趨化性。EAL輸出結構域可以刺激第2信使環(huán)鳥苷二磷酸的降解，并且是二鳥苷磷酸二酯酶功能的一個很好的候補者，其與GGDEF結構域共存時可能與細菌細胞表面黏附性有關。GGDEF參與信號轉導，并可能催化環(huán)二鳥苷二磷酸的合成或水解。HTH LUXR可以作為群體感應調控發(fā)光的轉錄激活因子；Trans reg_C可能在DNA結合中發(fā)揮作用。PP2C_SIG作為一個模塊存在于不同的結構環(huán)境中，并通過靶向和調節(jié)亞基進行調控。LytTR常存在于GC含量較少的革蘭氏陰性菌中，參與細胞的自溶調控。此外，CheY亞家族的RR蛋白無輸出結構域，其可能通過其他方式發(fā)揮作用。

2.4 熒光假單胞菌PF08的HK和RR蛋白進化分析

利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法對熒光假單胞菌PF08菌株的HK和RR構建系統(tǒng)發(fā)生樹。從進化關系看，HK共分為3 個聚簇（圖3a）。融合HK中除AYG07832.1、AYG07961.1、AYG08460.1、AYG08488.1、AYG09609.1和AYG10324.1外，其余19 個融合HK皆位于同一聚簇；除AYG05642.1外，其余經典HK皆位于其余2 個聚簇。這表明典型HK和融合HK的親緣關系較遠，其行使不同的功能。與HK相比，RR在長度和組成上都相對保守[18]。熒光假單胞菌PF08菌株的RR的系統(tǒng)發(fā)生樹共分為6 個聚簇，含有REC和Trans reg_C結構域的RR白皆位于同一聚簇；除AYG06114.1外，含REC和HTH LUXR的RR蛋白皆位于相鄰的2 個聚簇；其他具有相同結構域的蛋白也多位于同一聚簇（圖3b）?；蚬餐鄞仫@示了高度同源性，表明這些位于同一聚簇且結構域相同的蛋白可能具有相近的功能。

圖3 HK（a）和RR（b）的蛋白進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of histidine kinases (a) and response regulators (b) in P.fluorescens PF08

2.5 熒光假單胞菌PF08的TCS功能預測

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對熒光假單胞菌PF08菌株的39 對TCS進行的同源性分析，并結合相關文獻報道對其功能作出預測。目前，KEGG數(shù)據(jù)庫中TCS可分為OmpR、NarL、Spo、CitB、LytTR、NtrC、CheA、Cell cycle、Lux、LuxR和其他家族11 個亞家族。熒光假單胞菌PF08中25 對TCS分別來自于NtrC（KinB-AlgB、GlnL-GlnG、DctB-DctD）、OmpR（EnvZ-OmpR、CusS-CusR、TctE-TctD、KdpD-KdpE、QseC-QseB、PfeS-PfeR、ParS-ParR、PhoQ-PhoP、RstB-RstA、CreC-CreB、PhoR-PhoB）、CheA（CheA-CheYBV、RstB-RstA）、NarL（EvgS-EvgA）和其他家族（FlrBFlrC、AauS-AauR、RegB-RegA），此外，還有14 對TCS未在KEGG數(shù)據(jù)庫中搜索到相關信息。

由表3可知，熒光假單胞菌PF08中TCS的功能主要包括參與營養(yǎng)元素代謝，如調控海藻酸合成、酸性氨基酸的利用、氮調控、氧化還原反應、磷酸鹽調控；參與生物體內物質運輸，如檸檬酸轉運、C4二羧酸轉運、鉀鎂離子運輸；調節(jié)細胞形態(tài)分化及應對不利環(huán)境，如極性鞭毛合成、趨化性、群體感應、滲透壓脅迫響應、缺磷響應；與細胞抗性和毒力相關，如銅離子抗性、耐酸和耐藥性、多黏菌素抗藥性、腸桿菌素依賴性鐵獲取。其中，由經典HK與相應RR組成的32 對TCS中有23 對的功能作出了預測，而7 對由融合HK組成的TCS只有2 對發(fā)現(xiàn)了生物學功能，這可能是因為融合HK同時具有HK的信號傳導結構域和RR的信號接收結構域，在感應外界信號、傳導及接受信號過程中具有更加靈活的調控功能[38]。熒光假單胞菌之所以能成為冷藏水產品的優(yōu)勢腐敗菌，不僅得益于其超強的水解蛋白質和脂肪能力，還來源于其應對逆境時的多種生理機能。預測分析結果表明TCS可以調控熒光假單胞菌PF08的多種生理生化過程。存在參與熒光假單胞菌PF08營養(yǎng)元素代謝和生物體內物質運輸?shù)腡CS，這對熒光假單胞菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質攝取及能量利用十分重要。此外，部分TCS還可以調控熒光假單胞菌PF08的細胞抗性和毒力及環(huán)境適應性，這些調控通路對研究熒光假單胞菌的靶向控制十分重要。當前對熒光假單胞菌腐敗機理研究最為廣泛的是群體感應，這是細菌之間信息交換的一種機制，依賴菌群密度調節(jié)細菌的許多生理功能，影響熒光假單胞菌的腐敗能力[39]。而本研究也發(fā)現(xiàn)了2 對與群體感應有關的TCS，AYG07414.1/AYG07413.1和AYG08957.1/AYG08956.1。對TCS的功能預測有利于這些與熒光假單胞菌PF08腐敗機理有關的基因的進一步的研究，同時為該腐敗菌的靶向控制提供新思路。

表3 熒光假單胞菌PF08的TCS功能預測Table 3 Functional prediction of TCSs of P.fluorescens PF08

3 結 論

本研究利用生物信息學方法在全基因組范圍內系統(tǒng)分析了水產品熒光假單胞菌PF08菌株中TCS的數(shù)量、類型及功能。熒光假單胞菌PF08菌株中共存在39 對TCS。雖然系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些TCS在進化上存在較近的親緣關系，但它們的結構域組成呈現(xiàn)多樣化，是其功能多樣化的基礎。25 對TCS預測到生物學功能，主要為參與調控營養(yǎng)元素代謝、生物體內物質運輸、細胞形態(tài)分化、應對不利環(huán)境及細胞抗性和毒力等，表明TCS在熒光假單胞菌的生存適應過程中起到至關重要的作用。對于這些TCS在熒光假單胞菌中的調控機制仍需要通過實驗進一步驗證，特別是尚未獲得功能預測的TCS。本研究分析結果為進一步探究熒光假單胞菌生存適應及致腐機制提供了一定的參考，并且TCS可以作為一種有潛力的熒光假單胞菌的新抑制靶點。