孫 瑩 孫曉軍 包世俊*

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅省蘭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，蘭州730050

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，俗稱“口瘡”。該病易感動(dòng)物為家養(yǎng)或野生偶蹄動(dòng)物，多達(dá)70 種。發(fā)病動(dòng)物主要臨床表現(xiàn)為唇內(nèi)面、齒齦、舌面、臉頰部黏膜、四肢下端及乳房處等無毛部位形成水皰，水皰破潰后形成紅色潰爛，嚴(yán)重病例蹄殼脫落，引發(fā)動(dòng)物跛行。成年發(fā)病動(dòng)物，生產(chǎn)性能降低，如種畜失去種用價(jià)值，奶畜產(chǎn)奶受到影響。幼齡動(dòng)物感染后可導(dǎo)致出血性腸炎和心肌炎，常因心肌麻痹而猝死，病死率高達(dá)100%[1]。由于該病潛伏期短、發(fā)病率高（50%～100%）、傳播迅速，一旦出現(xiàn)疫情，極易發(fā)生大范圍的流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

FMDV 屬于微RNA 病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），病毒粒子是由單股線狀正鏈RNA和包圍其外的衣殼蛋白兩部分組成，是目前已知?jiǎng)游锊《局凶钚〔《局籟3]?？谔阋咄谎逍偷亩局昕乖砸泊嬖诓町悾總€(gè)型可根據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白VP1 的核苷酸序列差異可分為拓?fù)湫?，進(jìn)一步可將拓?fù)湫头譃椴煌V系。FMDV 易發(fā)生變異，進(jìn)一步增加了疫苗毒株篩選的難度，從而給FMD 的防控帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。隨著生命科學(xué)領(lǐng)域不斷取得新的突破，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展亦突飛猛進(jìn)，并在新型疫苗的研發(fā)中被廣泛應(yīng)用，從而為高效、安全、穩(wěn)定的新型口蹄疫疫苗的研發(fā)提供了技術(shù)保障。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 弱毒疫苗

弱毒疫苗是由豚鼠，乳鼠，雞胚，連續(xù)細(xì)胞傳代或?qū)谔阋咴贾甑娜斯ふT變獲得的人工減毒株和減毒株。大量擴(kuò)增后，加入一定劑量的保護(hù)劑和佐劑。它是一種成本低廉，使用方法簡單的病毒制[4]。1960－1980年，云南省瀾滄江以西地區(qū)面對AsiaⅠ型口蹄疫采用中國保山型（ZB 型）致弱毒株進(jìn)行免疫防治[5]。在3～5日齡乳兔體內(nèi)傳代109代，回歸牛體毒力減弱，致病力和免疫原性均達(dá)到口蹄疫弱毒疫苗標(biāo)準(zhǔn)，免疫保護(hù)效果良好，且免疫持續(xù)期達(dá)半年以上。但是，由于新的毒株不斷出現(xiàn)，毒株的致弱結(jié)果和致弱時(shí)間不能確定，在假定宿主中致弱的毒株，會對其他易感動(dòng)物具有強(qiáng)致病性，甚至存在與流行毒株重組、毒力返祖和回復(fù)突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以及活毒株持續(xù)感染、妨礙疫源凈化等缺點(diǎn)，現(xiàn)兔化弱毒疫苗株ZBatt 已停用，逐漸被其他類型疫苗所取代[6]。

1.2 滅活疫苗

滅活疫苗主要包括口蹄疫O 型滅活苗及口蹄疫O 型、A 型二價(jià)滅活苗兩大類。該類疫苗是通過懸浮培養(yǎng)傳代細(xì)胞、病毒抗原濃縮純化、滅活乳化等生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)。近年來，隨著生產(chǎn)工藝的不斷提高，滅活疫苗質(zhì)量顯著提升[7]?？谔阋邷缁钜呙缟a(chǎn)需要高標(biāo)準(zhǔn)的生物安全設(shè)施和嚴(yán)格的操作規(guī)程，可能存在強(qiáng)毒滅活不徹底的風(fēng)險(xiǎn)和多次免疫接種動(dòng)物后產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體影響感染與免疫鑒別等。因此，研制能區(qū)分感染與免疫的標(biāo)記疫苗、亞單位疫苗等新型基因工程疫苗是目前研究的熱點(diǎn)[8-9]。目前，F(xiàn)MD 免疫接種主要使用口蹄疫滅活疫苗，其安全性高，免疫效果好，在FMD的防控中發(fā)揮了重要作用，A 型顯著減少，O 型零星散發(fā)，社會效益顯著。

2 生物技術(shù)疫苗

2.1 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是以病毒（痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、慢病毒）或細(xì)菌作為載體，將外源基因插入載體基因組的非必需區(qū)內(nèi)，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨載體增殖，使得外源基因得到高效表達(dá)，再將表達(dá)產(chǎn)物純化用于免疫[10]。同時(shí)，載體本身也會起到佐劑作用，刺激動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫。劉新生[11]構(gòu)建乳酸桿菌載體口蹄疫VP1基因DNA 疫苗，使小鼠和豬體內(nèi)均產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫。

2.2 基因工程亞單位疫苗

利用DNA 重組技術(shù)，將編碼FMDV 的保護(hù)性抗原基因?qū)朐嘶蛘婧思?xì)胞，以獲得重組免疫保護(hù)蛋白作為抗原制成的疫苗，免疫動(dòng)物后，動(dòng)物體內(nèi)會產(chǎn)生中和抗體，提高機(jī)體抵抗力。由于免疫原單一，也有效解決了傳統(tǒng)疫苗免疫抑制的問題。FM?DV 基因工程亞單位疫苗主要利用各種表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、枯草桿菌等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP1 蛋白，但該蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中通常會出現(xiàn)無法正確加工和折疊等問題，通過用酵母、桿狀病毒等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP1 蛋白制成疫苗，則提高了疫苗的免疫原性，有效克服以上不足?；蚬こ虂唵挝灰呙绨踩珒r(jià)廉，便于大規(guī)模生產(chǎn)，目前應(yīng)用較多。

2.3 基因缺失/標(biāo)記疫苗

基因缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)去除與病原體毒力有關(guān)的基因，獲得毒力喪失或降低的毒株，但不影響免疫原性，又稱標(biāo)記疫苗，免疫效果好，安全、遺傳性能更穩(wěn)定，毒力不返祖[12]。缺失的基因還可作為一種遺傳標(biāo)志，用于建立鑒別診斷方法，有研究證實(shí)含缺失3A 蛋白aa109～aa115 位（B細(xì)胞表位）編碼區(qū)的FMDV 是可用于鑒別診斷的FMD標(biāo)記疫苗[13]。

2.4 合成肽疫苗

FMDV的主要保護(hù)多肽是通過化學(xué)合成或基因工程人工合成的，并連接到大分子載體上，可以根據(jù)流行株的情況調(diào)整用適當(dāng)佐劑制成的疫苗。由于合成肽疫苗的免疫效力不如常規(guī)滅活疫苗，目前，合成肽疫苗在豬口蹄疫的預(yù)防與防控中較常用。

2.5 基因疫苗

包括DNA 疫苗、RNA 疫苗，是指由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成，將其直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)合成目標(biāo)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主對該抗原蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防和治療疫病的目的?；蛞呙缇哂休^強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，因而便于貯存和運(yùn)輸。

2.6 反向遺傳疫苗

如今，由于反向遺傳技術(shù)不斷發(fā)展，使得通過對FMDV 的靶基因進(jìn)行改造和修飾，如替換、突變、插入或敲除FMDV 部分基因等方法制成的疫苗，免疫動(dòng)物同樣能達(dá)到較好的免疫效果。FMDV反向遺傳疫苗的研制為開發(fā)新型疫苗開辟了新方向，表位互補(bǔ)疊加，拓寬了抗原譜，組合優(yōu)勢毒株，免疫效力大大提高，免疫保護(hù)期延長，提高了生物安全性，在疫苗研發(fā)方面取得了突破。

2.7 轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)MDV 可飼疫苗的研究也取得了重大突破?？娠曇呙缡峭ㄟ^把植物基因工程技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合，將抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞中，形成轉(zhuǎn)基因植物，利用植物作為生物反應(yīng)器大量表達(dá)外源蛋白作為疫苗，或?qū)⑥D(zhuǎn)基因植物直接加工飼喂動(dòng)物使其獲得免疫，是當(dāng)前新型疫苗研究的熱點(diǎn)之一。除此之外，可飼疫苗還常以苜蓿、番茄、馬鈴薯等為表達(dá)體系，使用安全性高，成本較低，免疫方法簡便，為生產(chǎn)動(dòng)物疫苗提供新思路，但由于動(dòng)物個(gè)體的攝入量不同，免疫效果不易保障，仍需進(jìn)行深入研究。

2.8 表位疫苗

表位疫苗是通過基因工程技術(shù)人工合成病原微生物的抗原表位，與T 細(xì)胞表面受體（TCR）、B 細(xì)胞表面受體（BCR）或抗體分子特異性結(jié)合，引起特異性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答[14]。利用不同血清型的抗原表位的組合，制備多價(jià)疫苗，對不同血清型的FMDV 侵襲形成保護(hù)。由于多表位疫苗具有廣譜表位信息，可避免由于病毒變異導(dǎo)致免疫失敗?，F(xiàn)階段，病毒樣顆粒、蛋白分子、脂質(zhì)分子均是理想的表位疫苗載體，乙型肝炎核心病毒抗原（HBcAg）是目前最具潛力的表位疫苗病毒樣粒子載體[15]。HBcAg 有3 個(gè)區(qū)域：N 端、C 端、MIR 區(qū)均可插入外源基因。通過在MIR 區(qū)第75～78 位氨基酸、75～80 位氨基酸和75～82 位氨基酸插入FMDV 的多表位的不同組合，構(gòu)成病毒樣粒子，在體內(nèi)外均能被吞噬細(xì)胞吞噬，并能提高特異性抗體表達(dá)水平，顯著提高淋巴細(xì)胞的增殖能力。由此可見，表位疫苗具有廣闊研究前景。

3 結(jié) 語

自口蹄疫疫苗問世70余年來，免疫接種仍舊是世界上許多國家和地區(qū)預(yù)防控制口蹄疫的主要途徑。本綜述了國內(nèi)外口蹄疫疫苗的研究情況，為未來探索研究口蹄疫新型疫苗提供參考。