李明 馮軍 郝濤波

（1，扎蘭屯職業(yè)學(xué)院 162650；2，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗畜牧工作站 162750；3，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗那吉鎮(zhèn)綜合行政執(zhí)法局 162750）

目前，人工授精技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牛、羊、豬、禽及特種動物繁育中，已顯示出其巨大的、無可比擬的優(yōu)越性，并已成為其他家畜繁殖技術(shù)的配套技術(shù)。牛冷凍精液的半永久性保存、世界范圍內(nèi)的精液貿(mào)易和冷凍精液配種技術(shù)的普及，使世界優(yōu)秀種公牛優(yōu)質(zhì)精液的利用突破了受母牛配種時間、國界、種牛壽命的限制。支撐家畜人工授精這項技術(shù)背后的是一系列跨學(xué)科、跨專業(yè)關(guān)鍵設(shè)備和技術(shù)的推廣和應(yīng)用。精液中精子密度檢查方法的發(fā)展及演變就是一個很好的例證。

精液中精子密度檢查方法主要有估測法、血細胞計數(shù)法和光電比色法。

1 估測法和血細胞計數(shù)法檢查精子密度的方法及弊端

1.1 估測法

估測法是在顯微鏡下檢查精子活力的同時，依據(jù)視野中精子間的距離，將精子密度粗略劃分為“濃密”“中等”“稀薄”“無”4 個等級。這種方法受人為因素影響大，分級粗略，不能準確量化與評價精子密度。

1.2 血細胞計數(shù)法

血細胞計數(shù)法是借用醫(yī)學(xué)上檢查人體血液中紅細胞數(shù)和白細胞數(shù)的方法進行精子密度檢查。只是把人的血液換成了動物精液，把檢查對象由血細胞變成精細胞。動物種類不同，精子密度也有較大差異。密度較高的動物精液中精子數(shù)相當于人體血液中的紅細胞數(shù)，密度較低動物精液中的精子數(shù)相當于人體血液中的白細胞數(shù)。因此，檢查密度高的動物的精子密度類似于檢查血液中的紅細胞數(shù)；檢查密度低的動物的精子密度類似于檢查人體血液中的白細胞數(shù)。

用血細胞數(shù)法檢查精子密度需要了解計數(shù)板上計數(shù)室的結(jié)構(gòu)與規(guī)格，用3%鹽水在專用稀釋管中進行稀釋、滴入計數(shù)室、顯微鏡下計數(shù)及原精液精子密度的換算。從上述描述中不難看出，用血細胞計數(shù)法檢查精子密度，其結(jié)果較為準確，但方法原始、操作煩瑣、勞動強度大。

2 光電比色法檢查精子密度的原理

光電比色儀的研制遵循朗波—比耳（Lawb-Beer）定律，最初被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)，用以測定化學(xué)物質(zhì)的濃度，又稱分光光度計法[1]。許多化學(xué)溶液是有顏色的，溶液顏色與溶液濃度呈正比，顏色越深，濃度越高。因此，可以通過測定溶液顏色深淺來間接測定溶液的濃度。當一束光線照射裝有一定顏色溶液時，部分光線將被有色溶液吸收，顏色越濃，光吸收比例越大，透光率越小。這種基于比較溶液顏色深淺測定溶液濃度的分析方法稱為比色分析，又稱分光光度法。

動物精液同樣具有吸收光的特性，精子密度越高，吸收光越大。因此，利用分析化學(xué)中的光電比色法也可以測定精液中精子密度。

3 光電比色法在測定精子密度的方法

光電比色法測定精子密度是指利用光電比色儀通過測定已知精子密度的精液的透光率，建立透光率和精子密度的回歸方程或標準曲線，再通過測定未知密度精液的透光率，對照標準曲線或查透光率與精子密度對照表而獲知被測精液中的精子密度[2]。

3.1 分光光度計使用方法

打開儀器預(yù)熱20min。用“波長設(shè)置”旋鈕將波長設(shè)置在550nm。取一支比色杯，加入3/4 量的已配制好的精液稀釋液作為空白對照液，然后進行“調(diào)100%”或“調(diào)零”操作。

3.2 采集家畜的精液并取樣

利用假陰道法采取種公牛精液作為被測樣品。

3.3 測定精子密度

用血細胞計數(shù)法準確測定被測樣品的精子密度。為了計數(shù)準確，將每個樣本進行兩次檢查計數(shù)，且相對誤差不得超過10%，若誤差超過此標準，需要進行第3 次重復(fù)計數(shù)，取2 個數(shù)值相近的結(jié)果作為最終結(jié)果。

3.4 稀釋被檢精液

對已知精子密度的原精液用0.9%氯化鈉溶液作1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 的稀釋。稀釋后各濃度的精子密度可換算得知。

3.5 用光電比色法檢查不同密度梯度的精液的透光率

經(jīng)過儀器預(yù)熱、選定波長、空白液“調(diào)零”等操作后，測定出不同密度梯度精液的透光率，記錄測定結(jié)果。

3.6 建立透光率和精子密度的線性模型，繪制反映透光率和精子密度間關(guān)系的標準曲線

在標準坐標紙上以透光率為橫坐標，以精子密度為縱坐標建立標準曲線。根據(jù)透光率與精子密度的變化規(guī)律，對照坐標圖中形成的標準曲線的每個點所對應(yīng)的透光率與精子密度的數(shù)值，形成透光率與精子密度對照表[3]。

值得一提的是，在不同型號的光電比色儀顯示器上有兩組讀數(shù)，除了顯示透光率外還標有光密度，兩組數(shù)據(jù)可通過數(shù)學(xué)運算進行換算，在生產(chǎn)實踐中，測定結(jié)果可選擇不同的名稱（透光率或光密度）去表示。即形成的標準曲線或?qū)φ毡矸从车囊部墒枪饷芏扰c精子密度間的對應(yīng)關(guān)系。另外，在建立標準曲線時，透光率（或光密度）與精子密度也可對調(diào)坐標，其變化規(guī)律和對應(yīng)的數(shù)值關(guān)系是一致的。

3.7 透光率（或光密度）與精子密度標準曲線圖或?qū)φ毡淼膽?yīng)用及精液中精子密度的測定

建立標準曲線或?qū)φ毡砗?，對生產(chǎn)實踐中未知精子密度的精液只需用光電比色儀測定出其透光率（或光密度），即可根據(jù)透光率（或光密度）與精子密度標準曲線圖或?qū)φ毡?，推算出或查出不同透光率（或光密度）下的精子密度。根?jù)經(jīng)驗，在測定精液樣品時，將牛的原精液先稀釋80～100 倍，再測其透光值效果較好。

比色分析具有簡單、快速、靈敏度高等特點，廣泛應(yīng)用于微量組分的測定，通常測定含量在10-1～10-4mg 轅L 的痕量組分。在用比色法檢查精子密度時，若在建立標準曲線時能選擇20個以上的稀釋濃度，利用Eviews 或Excil 軟件操作系統(tǒng)進行處理，可得到線性回歸方程，將測得的透光率（或光密度）值代入回歸方程，即可準確計算出被測精液中精子的密度。如能用計算機進行程序化計算并連接打印系統(tǒng)，其結(jié)果的計算、顯示和存貯將更為準確、便捷、清晰。