趙麗華，李 靜，位 嘉，林秋蘭

乳腺癌已成為全球最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥的主要死因，發(fā)病率有逐年增高且呈年輕化趨勢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, LncRNAs)的表達(dá)異?？赡芘c乳腺癌有關(guān)，因此對LncRNA的進(jìn)一步分析可為乳腺癌診療提供新思路[1]。本實(shí)驗(yàn)以既往建立的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)與乳腺癌細(xì)胞MCF7共培養(yǎng)模型為分析對象，在模擬腫瘤微環(huán)境的條件下分析腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化，目的是尋找與促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵LncRNA，探索其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用RNAscope技術(shù)檢測乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中長鏈非編碼RNA-00707(long-chain non-coding RNA-00707, Linc00707)的表達(dá)水平，并結(jié)合乳腺癌分子病理分型，初步探討Linc00707在乳腺癌診斷、預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1 Linc00707的獲取本課題團(tuán)隊(duì)前期試驗(yàn)建立的人源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hAD-MSCs)與人乳腺癌MCF7細(xì)胞系細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系，并誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)，lncRNAs芯片技術(shù)獲得一批差異表達(dá)的lncRNAs，并通過qRT-PCR驗(yàn)證，最終得到差異性表達(dá)的長鏈非編碼RNA，命名為Linc00707[2]。

1.2 乳腺癌標(biāo)本收集2015～2019年民航總醫(yī)院病理科及衡道病理中心存檔的石蠟包埋樣本136例，癌旁正常乳腺組織78例。所有患者均為女性，年齡31～72歲，中位年齡41.2歲。依據(jù)2011年St.Gallen共識，乳腺癌分子病理分型分為4型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和基底樣型[3]。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用羅氏BenchMark GX全自動免疫組化染色系統(tǒng)，一抗ER(SP1)、PR(1E2)、HER-2(4B5)、Ki-67(30-9)均購自羅氏公司，CK14(MAB-0169)和EGFR(RMA-0688)購自福州邁新公司。

1.3.2組織芯片的制作 136例乳腺癌組織及78例癌旁正常乳腺組織由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家選擇組織區(qū)，由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員參照文獻(xiàn)[4]制作組織微陣列。

1.3.3RNAscope技術(shù)[5]采用RNAscope2.5HD檢測試劑盒(美國ACD公司)檢測Linc00707 mRNA的表達(dá)，主要步驟：標(biāo)本制備，蛋白酶加處理，探針雜交，信號放大，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.3.4Linc00707顯微鏡下計(jì)數(shù) 參照HER-2 RNAscope染色分級計(jì)數(shù)方法[6]，于40倍物鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，RNA轉(zhuǎn)錄物在癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成明顯的點(diǎn)狀或團(tuán)簇狀信號，平均每個(gè)細(xì)胞中<1個(gè)信號為0分；1～3個(gè)信號為1分；4～9個(gè)信號及無/少量呈簇狀信號為2分；10～15個(gè)信號為3分(若<10%瘤細(xì)胞中的信號呈簇狀也歸為此類)；>15個(gè)信號為4分(若>10%瘤細(xì)胞中的信號呈簇狀也歸為此類)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫組化和RNAscope結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中Linc00707的表達(dá)136例乳腺癌中121例Linc00707陽性，1分占9.1%(11/121)，2分占30.6%(37/121)，3分占40.4%(49/121)，4分占19.8%(24/121)(圖1)。Linc00707在乳腺癌組織中的陽性率(89%，121/136))高于癌旁正常乳腺組織(3.8%，3/78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=147.40，P<0.05)。

2.2 乳腺癌中Linc00707表達(dá)與分子病理分型的相關(guān)性根據(jù)免疫組化結(jié)果分型，其中Luminal A型19例，Luminal B型52例，基底樣型26例，HER-2過表達(dá)型39例。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Linc00707在乳腺癌病理分子亞型中的陽性率分別為Luminal A型52.6%(10/19)，Luminal B型98.1%(51/52)，基底樣型88.5%(23/26)，HER-2過表達(dá)型94.9%(37/39)，Luminal B型、HER-2過表達(dá)型、基底樣型中的陽性率高于Luminal A型(χ2=20.143、7.207、12.211，P<0.05，圖2)。

3 討論

浸潤性乳腺癌是一組異質(zhì)性極強(qiáng)的腫瘤，有各自不同的分子病理學(xué)特征和臨床生物學(xué)行為，運(yùn)用基因表達(dá)譜將乳腺癌劃分為4種分子亞型，這些乳腺癌亞型具有不同的臨床表現(xiàn)，對新輔助化療的反應(yīng)性和危險(xiǎn)因素也各不相同，乳腺癌患者的臨床治療也變得更加具體和個(gè)性化，越來越多的機(jī)制研究使個(gè)體化治療成為可能，使患者的預(yù)后更好[7]。

LncRNAs是指轉(zhuǎn)錄長度大于200個(gè)核苷酸并且不翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA分子[8]。其最初被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，并無生物學(xué)功能。近年研究表明LncRNA參與基因組印記、X染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的生理過程，LncRNA表達(dá)異?？赡芘c腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，已成為當(dāng)前腫瘤研究的新熱點(diǎn)[9]。目前已鑒定出HOTAIR、NKILA、GAS5等近10種乳腺癌相關(guān)LncRNA，這些LncRNA可通過調(diào)控表觀遺傳修飾和關(guān)鍵細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等重要生物學(xué)作用，參與乳腺癌惡性進(jìn)展。因此深入探究LncRNA有望為乳腺癌診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物[10]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用hAD-MSCs與MCF7細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)生EMT化的MCF7細(xì)胞與正常MCF7細(xì)胞進(jìn)行LncRNAs芯片分析，并通過qRT-PCR驗(yàn)證，最終得到差異性表達(dá)的Linc00707，應(yīng)用RNAscope技術(shù)檢測Linc00707在乳腺癌組織中的表達(dá)及與分子病理分型的相關(guān)性，RNAscope是近年開發(fā)的一種新型RNA原位雜交技術(shù)，基于其獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)與背景抑制技術(shù)，使單個(gè)RNA的轉(zhuǎn)錄變得可視化，是目前最精準(zhǔn)的RNA檢測技術(shù)，該技術(shù)有三個(gè)特點(diǎn)：(1)可以對常規(guī)存檔的石蠟組織、冷凍組織等進(jìn)行檢測，方便進(jìn)行回顧性分析；(2)在保留組織形態(tài)學(xué)信息的基礎(chǔ)上進(jìn)行RNA的精確定量；(3)無需抗體，尤其適合低水平表達(dá)的RNA[11]。

為節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本并提高效率，本實(shí)驗(yàn)把數(shù)十個(gè)至數(shù)百個(gè)患者的組織整齊有序的排列到同一蠟塊上，制成組織芯片。其最大的作用是將基因、蛋白水平的研究與組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合，應(yīng)用同一實(shí)驗(yàn)條件同時(shí)觀察大量不同患者組織樣本(高通量)，減少實(shí)驗(yàn)誤差，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠，并節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本和人力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Linc00707在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常乳腺組織，表明Linc00707在某種程度上可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，與體外實(shí)驗(yàn)研究Linc00707可以促進(jìn)MCF7細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的結(jié)果符合，在Linc00707陽性的分級計(jì)數(shù)中2分(30.6%)、3分(40.4%)和4分(19.8%)表達(dá)高于1分(9.1%)病例，初步顯示Linc00707可提示腫瘤細(xì)胞的生長活性，可以作為判斷乳腺癌的增殖指標(biāo)之一。

病理形態(tài)相同的乳腺癌，由于分子遺傳學(xué)的改變，在分子水平上呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，導(dǎo)致患者預(yù)后及治療的反應(yīng)差異較大，激素受體陽性患者預(yù)后佳，如Luminal A型、Luminal B型，HER-2是一個(gè)預(yù)后差的指標(biāo)，HER-2過表達(dá)型預(yù)后比Luminal A型及Luminal B型差，基底樣型乳腺癌預(yù)后最差[12]。應(yīng)用乳腺癌分子分型分析在某種程度上與患者預(yù)后及生存期有相關(guān)性，有研究顯示，HER-2過表達(dá)型與基底樣型的局部復(fù)發(fā)率分別為33.3%和14.8%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率分別為55.6%和40.7%，均高于其他兩種亞型，HER-2過表達(dá)型與基底樣型的中位無瘤生存期較短，HER-2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌的病理學(xué)特征較差，且預(yù)后不良，而Luminal A型預(yù)后較好。本實(shí)驗(yàn)通過乳腺癌的分子分型分析顯示，Linc00707在Luminal B型、HER-2過表達(dá)型、基底樣型中的表達(dá)明顯高于Luminal A型，結(jié)果表明Linc00707在惡性程度相對高的亞型中表達(dá)明顯增高，初步提示Linc00707可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展，對乳腺癌的惡性程度評估有一定的臨床意義及成為新的乳腺癌標(biāo)志物具有潛在價(jià)值的可能性，對乳腺癌的治療及預(yù)后起到一定的輔助作用，并有利于選擇和研究更具針對性的個(gè)性化治療方法。

(本實(shí)驗(yàn)獲丁華野教授的鼎立支持，特此致謝！)