楊晉青，胡守江，葛 宇

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233)

隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高，消費(fèi)者對護(hù)膚品的要求不斷提高，綠色化及功能性的化妝品越來越受到青睞。植物作為化妝品的主要來源和基礎(chǔ)原料由來久遠(yuǎn)。植物提取物在化妝品中的功效及應(yīng)用日趨廣泛，不僅可作為化妝品重要的香味成分，還能起到抗敏殺菌等作用[1-2]。但是，環(huán)境污染會使植物提取物中存在農(nóng)藥殘留問題。歐盟化妝品法規(guī)和我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》均明令禁止在化妝品中使用激素、抗生素、鄰苯二甲酸酯、農(nóng)藥以及孔雀石綠和結(jié)晶紫等物質(zhì)[3-8]?；瘖y品的安全使用問題逐漸得到國內(nèi)外研究者的高度重視。

國家食品藥品監(jiān)督管理總局《關(guān)于印發(fā)化妝品中可能存在的安全性風(fēng)險物質(zhì)風(fēng)險評估指南的通知》(國食藥監(jiān)許[2010]339號)指出，化妝品中可能存在的安全性風(fēng)險物質(zhì)是指由化妝品原料帶入、生產(chǎn)過程中產(chǎn)生或帶入的，可能對人體健康造成潛在危害的物質(zhì)。同時，對于配方中含有植物來源原料的化妝品，也明確了應(yīng)對農(nóng)藥殘留相關(guān)情況進(jìn)行說明?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》規(guī)定了多種農(nóng)藥成分為化妝品的禁用組分。而且，歐盟于2013年7月11日正式實(shí)施的第一部化妝品法規(guī)EC 1223/2009附錄二中明確指出：艾氏劑、狄氏劑等農(nóng)藥為化妝品中的禁用組分。本研究所選取的20種農(nóng)藥均為《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》規(guī)定的禁用組分，由于日常檢測檢出率高，檢測方法一致，故作為主要內(nèi)容進(jìn)行研究。然而，由于目前國內(nèi)外缺乏相關(guān)化妝品中農(nóng)藥的檢測標(biāo)準(zhǔn)，未能對國內(nèi)市場化妝品中農(nóng)藥的情況進(jìn)行評估。尤其對可能含有農(nóng)藥殘留的含植物提取類化妝品，急需建立一種簡便、快速、高效、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測分析方法。

目前，化妝品中禁用物質(zhì)的測定方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[9-11]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因兼具液相色譜的高分離效能和質(zhì)譜的高靈敏度，已成為近年來化妝品中禁用物質(zhì)檢測的主要方法。為了進(jìn)一步提高目標(biāo)物的檢測回收率，減少雜質(zhì)成分的干擾，降低質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)和提高檢測靈敏度，本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測技術(shù)，在樣品前處理中引入凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)凈化手段，擬建立含植物提取物類化妝品中20種禁用農(nóng)藥殘留量的測定方法，旨為保障化妝品的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290高效液相色譜儀：美國Agilent 公司產(chǎn)品；AB SCIEX 6500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司產(chǎn)品；凝膠滲透色譜分離系統(tǒng)(GPC)：美國J2 Science 公司產(chǎn)品；超聲儀：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；氮?dú)鉂饪s裝置：美國ATR公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、離心機(jī)：德國Heidolph公司產(chǎn)品；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司產(chǎn)品；0.45 μm有機(jī)相濾膜：Dikma公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

乙腈、丙酮、環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲酸、甲醇：均為色譜純，德國 Merck公司產(chǎn)品；氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備，為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

20種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%，均為德國 Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品，于-20 ℃保存，信息列于表1。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液與工作液的配制 分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。根據(jù)需要用乙腈-水(3∶2,V/V)溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，線性范圍列于表2。

1.3.2空白樣品基質(zhì)溶液與基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 稱取1 g空白樣品，按照樣品前處理制得空白樣品基質(zhì)溶液。經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加?.5 mL標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液復(fù)溶，得到基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

稱取1 g試樣(精確至0.001 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈(對于膏霜類等粘稠狀樣品，先加入5 mL水分散混勻后再加入乙腈)，用渦旋振蕩器渦旋混合1 min后，超聲振蕩器超聲10 min，加入5～7 g氯化鈉，渦旋1 min后，以8 000 r/min離心2 min。將上清液移入新的50 mL具塞離心管中，殘渣再用10 mL乙腈重復(fù)提取1次后，上層清液合并于同一離心管中，在(40±2) ℃水浴溫度下，氮?dú)鉂饪s至近干，用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1，V/V)溶解殘渣并定容至10 mL，過有機(jī)濾膜后，經(jīng)凝膠滲透色譜柱分離凈化，收集15.0～30.0 min的流出液，35 ℃水浴中減壓濃縮至近干，加入0.5 mL乙腈溶液溶解殘渣，混勻，經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18高效液相色譜柱(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2.0 min(5%B)，2.0～8.0 min(5%～60%B)，8.0～11.0 min(60%～100%B)，11.0～13.0 min(100%B)，13.0～13.1 min(100%～5%B)，13.1～15 min(5%B)；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 ESI離子源；電噴霧電壓：+5 500 V和-4 500 V；霧化氣壓力：414 kPa；輔助加熱氣壓力：414 kPa；氣簾氣壓力：138 kPa；離子源溫度：400 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。20種農(nóng)藥的定性定量離子對、碰撞能量等質(zhì)譜分析參數(shù)列于表1，MRM色譜圖示于圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器分析條件

2.1.1色譜柱和流動相的選擇 實(shí)驗(yàn)分別考察了Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)和Waters Atlantis T3 C18(2.1 mm×100 mm×3 μm)色譜柱在乙腈-水和甲醇-水兩種流動相洗脫下的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)以乙腈-水溶液作為流動相時，與試樣定容溶劑相匹配，在色譜柱上的溶劑效應(yīng)不明顯，

表1 20種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometry analysis parameters of 20 pesticides

注：化合物濃度(精吡氟禾草靈1 μg/L；多菌靈、久效磷和撲滅津5 μg/L；甲萘威、特樂酚、氟環(huán)唑、丁苯嗎啉、碘苯腈、禾草敵、西瑪津和十三嗎啉10 μg/L；丁變敵、敵草隆、異惡唑草酮、苯氧菊酯和利谷隆50 μg/L；丙炔氟草胺、異菌脲和炔螨特100 μg/L)圖1 20種農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測定量離子色譜圖Fig.1 Multi-reaction monitoring quantitative ion chromatograms of 20 pesticides

色譜峰形對稱；當(dāng)以甲醇-水溶液作為流動相時，易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。此外，由于2根色譜柱的填充粒徑不同，20種農(nóng)藥在Agilent Eclipse Plus C18色譜柱上的保留時間相對較短，峰型相對較窄，分離度更高。考慮到節(jié)約成本和與液相色譜儀匹配的問題，最終選用Agilent Eclipse Plus C18柱作為實(shí)驗(yàn)用柱。同時，實(shí)驗(yàn)還比較了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%氨水溶液-乙腈等4種流動相對目標(biāo)化合物離子化程度的影響。結(jié)果表明，為兼顧質(zhì)譜的正、負(fù)離子模式同時掃描采集數(shù)據(jù)，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相洗脫可以獲得理想的峰形和質(zhì)譜響應(yīng)信號。如果在流動相中添加氨水，會使正離子模式下的化合物響應(yīng)信號明顯降低。

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化 根據(jù)20種化合物的電離性質(zhì)，分別選用ESI+和ESI-離子化模式，采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的目標(biāo)離子作為一級母離子。在負(fù)離子模式下，特樂酚和碘苯腈響應(yīng)的離子峰強(qiáng)度均比正離子模式高，母離子為[M-H]-；其他化合物均在正離子模式下響應(yīng)，母離子為[M+H]+。用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描分析，選擇豐度相對較高、質(zhì)荷比較大的2個特征碎片離子分別作為定量離子和輔助定性離子。通過優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣、碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使20種農(nóng)藥的母離子與特征碎片離子的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

注：1.甲萘威；2.多菌靈；3.丁變敵(燕麥敵)；4.特樂酚(地樂硝酚)；5.敵草??；6.氟環(huán)唑；7.丁苯嗎啉；8.精吡氟禾草靈；9.丙炔氟草胺(氟噁嗪酮)；10.碘苯腈；11.異菌脲(異丙二酮)；12.異惡唑草酮(異惡氟草)；13.苯氧菊酯(亞胺菌)；14.利谷??；15.禾草敵；16.久效磷；17.炔螨特(克螨特)；18.撲滅津(丙唑嗪)；19.西瑪津；20.十三嗎啉(克林菌)圖2 不同提取溶劑的回收率比較Fig.2 Comparison of extraction recoveries with different extraction solvents

2.2.1提取溶劑的選擇 目前，化妝品中各類化合物多以超聲方式提取，但由于各類物質(zhì)的性質(zhì)存在一定差異，采用的提取溶劑也不盡相同，常見的提取溶劑主要有甲醇、乙腈、以及甲醇或乙腈與水的混合溶液等。由于化妝品基質(zhì)的復(fù)雜性，本實(shí)驗(yàn)以水劑、乳膏和油劑樣品作為研究對象，綜合考察了乙腈、丙酮、乙酸乙酯提取溶劑對化合物的提取效率。結(jié)果表明，同一提取溶劑對不同劑型化妝品的提取效率基本一致，以乳膏類為例，提取結(jié)果對比圖示于圖2?？梢?，提取效率由高到低依次為：乙腈>丙酮>乙酸乙酯。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為超聲提取溶劑。如果樣品屬于“油包水”類型，為破乳需要添加適量的飽和氯化鈉溶液，以提高目標(biāo)化合物的回收率。

2.2.2超聲時間的確定 本實(shí)驗(yàn)比較了5、10、15、20、25 min超聲時間對提取效果的影響。結(jié)果表明，以乙腈為提取溶劑，超聲提取10 min的提取效果最好，待測成分提取較完全，結(jié)果示于圖3。

圖3 不同超聲時間的回收率比較Fig.3 Comparison of extraction recoveries with different ultrasound extraction time

2.3 凈化方法和基質(zhì)效應(yīng)

由于化妝品中含有較多的油脂，通過硅酸鎂柱、硅膠柱等SPE柱，以及QuEChERS分散萃取凈化都不能將其與脂肪類干擾物質(zhì)分離。目前，去除脂肪類干擾物最有效的方法是凝膠滲透色譜法，利用化合物中各組分分子質(zhì)量不同，與柱填料之間的作用不同，導(dǎo)致洗脫時間不同，從而達(dá)到分離的目的。通過對收集時間、流速等條件的優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)選用凝膠滲透色譜作為凈化方法。

此外，由于HPLC-MS/MS測定時存在基質(zhì)效應(yīng)，本研究以乳霜類基質(zhì)為例，用陰性樣品經(jīng)過提取、凈化定容后配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和直接配制的同濃度溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，按式(1)計算基質(zhì)效應(yīng)(ME)[12-13]，結(jié)果列于表2。

(1)

式中，Sm和Ss分別表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME>0時，表明為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME<0，表明為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

20種農(nóng)藥的質(zhì)譜信號響應(yīng)值有不同程度下降，均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。為補(bǔ)償由于基質(zhì)抑制效應(yīng)導(dǎo)致的測定數(shù)值偏差問題，最大程度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，所有樣品均采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.4 線性范圍和檢出限

采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按1.5節(jié)所確定的實(shí)驗(yàn)條件對配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以各農(nóng)藥定量離子對的峰面積對被測組分的濃度進(jìn)行回歸分析，得到各農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。在陰性樣品中添加一定濃度的20種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定結(jié)果以3倍信噪比為檢出限(LOD)，10倍信噪比為定量限(LOQ)。以乳霜類基質(zhì)為例，20種化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限等信息列于表2?？梢钥闯?，精吡氟禾草靈在0.5～10 μg/L，多菌靈、久效磷和撲滅津在2.5～50 μg/L，甲萘威、特樂酚、氟環(huán)唑、丁苯嗎啉、碘苯腈、禾草敵、西瑪津和十三嗎啉在5～100 μg/L，丁變敵、敵草隆、異惡唑草酮、亞胺菌和利谷隆在25～500 μg/L，丙炔氟草胺、異菌脲和炔螨特在50～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。20種農(nóng)藥的LOD值在0.000 5～0.05 mg/kg之間，LOQ值在0.001～0.1 mg/kg之間。

2.5 回收率和精密度

本研究選取經(jīng)測定為空白基質(zhì)的化妝水、乳液、膏霜和面膜等4類化妝品作為代表基質(zhì)，進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。在1倍、2倍、10倍LOQ的3個添加水平下，分別進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計算回收率和精密度，結(jié)果列于表3。可見，3個濃度水平下，絕大多數(shù)化合物的平均回收率為81.5%～116.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.52%～9.42%。符合《國食藥監(jiān)許[2010]455號》關(guān)于印發(fā)化妝品中禁用物質(zhì)和限用物質(zhì)檢測方法驗(yàn)證技術(shù)規(guī)范的方法驗(yàn)證要求，能夠滿足實(shí)際檢測需要。

2.6 實(shí)際樣品測試

使用本方法對采集的50批次含植物提取物類化妝品進(jìn)行檢測，均未檢出本研究所涉及的20種農(nóng)藥。

表3 4種化妝品基質(zhì)中20種農(nóng)藥在3個添加水平下的平均回收率及其RSD值(n=6)Table 3 Average recoveries and RSDs of 20 pesticides spiked in four cosmetic matrixesunder three addition levels (n=6)

續(xù)表3

3 結(jié)論

本研究采用乙腈超聲提取，凝膠滲透色譜法凈化，結(jié)合特異性強(qiáng)、靈敏度高的HPLC/MS/MS檢測技術(shù)，通過對不同基質(zhì)化妝品中農(nóng)藥的提取溶劑、凈化方法及色譜分析條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了含植物提取物類化妝品中20種禁用農(nóng)藥的測定方法。結(jié)果表明，20種農(nóng)藥在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990，定量限在0.001～0.1 mg/kg之間，高、中、低3個濃度水平的平均加標(biāo)回收率為81.5%～116.2%，RSD為0.52%～9.42%。該方法具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，簡便快速、可靠性高，能夠滿足實(shí)際檢測要求，可為化妝品質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)支撐。