楊 帆，張璐琪，張鴻偉，紀仁春，張曉梅，許 輝，王鳳美，王妍婷，宮小明，徐 杰

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島海關技術中心，山東 青島 266002；3. 西雙版納海關綜合技術中心，云南 景洪 666100；4.濰坊海關技術中心，山東 濰坊 261041)

獸藥被廣泛用于動物疾病的預防和治療、促進動物生長等方面，其種類繁多，抗生素是獸藥殘留分析中最常見的殘留類別[1]。乳粉中含有大量對人體生長發(fā)育有重要作用的營養(yǎng)元素，是生活中常見的食品，嬰幼兒、兒童和老人是乳粉的主要受眾群體。乳粉中抗生素殘留一直是食品安全關注的重點，長期食用含有抗生素殘留的乳粉會使人體內(nèi)產(chǎn)生耐藥菌株[2]，降低機體免疫力[3-4]，給消費者帶來健康隱患。在乳粉抗生素殘留分析中，磺胺類、喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類藥物類屬高頻次檢測項目[5]，建立這些藥物殘留的快速篩查分析方法有利于提高日常篩查分析通量，增進風險監(jiān)測效能，完善乳粉產(chǎn)品質(zhì)量安全控制的技術支持體系。

實時直接分析(direct analysis in real time, DART)是一種新型的敞開式常壓原位電離技術，可在大氣壓和開放式實驗環(huán)境中，不改變被分析物本身性質(zhì)的前提下，直接完成對樣品的離子化以及進樣分析[6-8]。該技術的優(yōu)點在于大幅簡化樣品制備過程，使無樣品制備而直接分析成為可能。DART已經(jīng)被成功應用于藥物研發(fā)與監(jiān)管[9-10]、環(huán)境監(jiān)測[11]、化妝品監(jiān)測[12-13]、食品分析[14-15]、復雜樣品分析及法證科學等領域[16-17]。在食品分析領域，Al-Balaa等[18]利用實時直接分析-飛行時間質(zhì)譜(DART-TOF MS)快速定性和半定量分析干雞蛋和雞蛋面食中膽固醇；Farre等[19]利用實時直接分析-高分辨質(zhì)譜(DART-HRMS)法實現(xiàn)了蘋果、梨、檸檬果皮上的氧化劑、殺菌劑以及糖類物質(zhì)殘留的定性定量分析；李偉麗等[20]利用直接分析質(zhì)譜(DART-MS/MS)法快速檢測辣椒及其制品中的辣椒素類物質(zhì)，并進行了方法學驗證。在化學危害物殘留分析領域，齊春艷等[21]利用實時直接分析-四極桿-離子回旋軌道阱質(zhì)譜(DART-Q-Orbitrap MS)法檢測了南美白對蝦中15種磺胺類藥物；Vaclavik等[22]利用實時直接分析-飛行時間質(zhì)譜法檢測了奶粉、煉乳、乳酪等奶制品中三聚氰胺和氰尿酸；Zhang等[23]利用實時直接分析-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(DART-Q-TOF MS/MS)法實現(xiàn)了對奶粉中雙氰胺的定性定量分析。

本實驗擬將DART離子源與四極桿-離子回旋軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(DART-Q-Orbitrap HRMS)聯(lián)用，快速篩查乳粉中磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類等16種常見抗生素的殘留，并對分析條件進行優(yōu)化，希望建立相關藥物殘留的篩查方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

DART實時直接分析離子源：美國IonSense公司產(chǎn)品；Q-Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品，配有Xcalibur1.2工作站；CR22G Ⅱ高速冷凍離心機：日本日立公司產(chǎn)品；Mettler PL202-L型電子分析天平：瑞士美特勒-托利多公司產(chǎn)品；Turbo Vap?LV型高通量水浴氮吹濃縮儀：美國Caliper公司產(chǎn)品；MMV-1000W站立式振蕩器：日本EYELA公司產(chǎn)品；MS3型渦旋混勻器：美國IKA公司產(chǎn)品；KQ-100E臺式超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Captiva ND lipids固相萃取柱、EMR-Lipid凈化管：美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

乙腈(質(zhì)譜純)：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸(質(zhì)譜純)：美國Fluka公司產(chǎn)品。

磺胺嘧啶、磺胺-5-(對)甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、甲氨芐啶(純度≥99.0%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；磺胺二甲嘧啶(純度≥98.0%)：美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品；丹諾沙星、西諾沙星、雙氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟甲喹、奧比沙星(純度≥98.0%)、替米考星、交沙霉素(純度≥80.0%)：中國First Standard公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1DART離子源條件 正離子模式，載氣為氦氣，選擇QuickStrip (QS)樣品卡模塊進樣，進樣速度1 mm/s，離子化溫度400 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 采集方式：Full MS-ddMS2(正離子模式掃描)，其中Full MS母離子掃描質(zhì)譜分辨率設定為70 000，子離子質(zhì)譜依賴性掃描分辨率設定為17 500(3級碰撞能量分別設定20、40、60 eV)；噴霧電壓3.0 kV；毛細管溫度350 ℃；鞘氣流速30 L/min；輔助氣流速3.3 L/min；反吹氣流量0；質(zhì)量掃描范圍m/z100～500。

1.4 標準儲備液與混合標準工作液的配制

標準儲備液(1 g/L)的配制：分別稱取10 mg(精確到0.1 mg)標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-20 ℃可保存6個月。

混合標準工作溶液(1 mg/L)的配制：分別移取10 μL相應標準儲備液于10 mL容量瓶中，用50%乙腈-水溶液定容，-20 ℃可保存1個月。

1.5 實驗方法

稱取(2.00±0.02) g乳粉于50 mL離心管中，用4 mL水溶解，混勻，加入12 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，以10 000 r/min離心10 min，取4 mL上清液，過Captiva ND lipids固相萃取柱，收集濾出液，40 ℃下氮吹至近干，準確加入2 mL 0.3%甲酸-5%乙腈-水溶液復溶殘渣，渦旋并超聲5 min，過0.22 μm濾膜，作為待測液備用。

吸取4 μL待測液，將其滴至QS樣品卡的金屬篩網(wǎng)進樣點處，放置在通風櫥中使其蒸發(fā)至近干，然后將其固定在DART離子源和Q-Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀之間的滑動軌道上進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 載氣類型和進樣模塊的選擇

高純度的氮氣和氦氣是DART離子源最常用的載氣，氦氣由于其激發(fā)態(tài)離子能量比氮氣高且靈敏度高，因此能電離的化合物較多。由于氦氣可電離大分子質(zhì)量化合物，且副反應較小，可用于相對較大的大分子質(zhì)量抗生素的檢測[24]，因此本實驗選擇氦氣作為載氣。但由于氦氣和氮氣相比價格昂貴，故在樣品分析前后和實驗準備期間選擇氮氣作為輔助氣體。

本實驗嘗試了用Dip-It玻棒模塊進樣，但出現(xiàn)了掛在玻棒上的樣品液滴不穩(wěn)定，導致質(zhì)譜峰響應低且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，因此選用QS樣品卡模塊進樣。

2.2 載氣溫度的選擇

對于DART離子源，溫度對其敏感度的影響很大。本實驗分別考察了300、350、400 ℃下氦氣的離子化效果，并與扣除空氣背景后的質(zhì)譜圖進行對比，結(jié)果示于圖1?？梢?，離子化溫度過低，會減少離子進入質(zhì)譜儀的數(shù)量；離子化溫度越高，離子化效果越好，背景干擾越小，靈敏度越高。實驗還驗證了450 ℃的離子化效果，發(fā)現(xiàn)出峰率和響應較低，離子化效果不理想，這是由于溫度過高容易使殘留藥物分子分解，液體樣品揮發(fā)過快而導致目標物在進樣模塊網(wǎng)格中擴散。因此，本實驗選擇400 ℃作為載氣溫度。

圖1 在300、350、400 ℃溫度下，各目標分析物的離子化效果對比圖Fig.1 Ionization effect of the analytes in DART ion source at the temperature of 300, 350, 400 ℃

2.3 進樣速度的選擇

QS樣品卡的移動速度對DART離子源靈敏度的影響較大，本實驗分別考察進樣速度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mm/s時的離子化效果。經(jīng)分析可知，進樣速度過慢時，質(zhì)譜峰會有峰型拖尾、出現(xiàn)雙峰或三峰的情況；進樣速度過快時，離子進入質(zhì)譜的數(shù)量減少，從而導致響應過低甚至無響應。因此本實驗選擇1.0 mm/s的速度進樣。

需要指出的是，采用DART-Q-Orbitrap HRMS分析時經(jīng)常出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，使用優(yōu)化的進樣速度和載氣溫度，點樣時把握好液滴在樣品卡上的位置和液滴大小，控制液滴干燥程度不要過干，可以有效地避免雙峰、拖尾及影響目標分析物響應等現(xiàn)象。

2.4 方法驗證

2.4.1定性分析指標 本研究以目標分析物的準分子離子峰作為篩查定性離子，采用準分子離子和高分辨碎片離子庫匹配的方式進行準確定性，具體如下：1) 準分子離子峰的質(zhì)量準確度≤5×10-6；2) 具有與準分子離子峰相似的同位素分布；3) 與標準品譜庫相比存在2個質(zhì)量準確度≤5×10-6的特征碎片離子[25-26]。本實驗對空白樣品進行添加(100 μg/kg)，使用DART-Q-Orbitrap HRMS系統(tǒng)進行正離子一級質(zhì)譜全掃描，檢測得到了16種目標分析物的準分子離子峰質(zhì)量數(shù)與理論值，以及主要特征碎片離子，列于表1?？芍鄬φ`差均在5×10-6以下，特征碎片離子與實驗室利用標準溶液自建的數(shù)據(jù)庫匹配較好，可以實現(xiàn)相關殘留物質(zhì)的準確定性分析。

2.4.2篩查限濃度水平和回收率 選取20個空白乳粉樣品，每個樣品各稱取4份，1份作為空白樣品，另3份作為加標樣品，加標水平分別為10、50、100 μg/kg，每個樣品均進行平行測定，各分析目標物前體離子在空白樣品中響應的最大值不小于加標樣品中響應的最小值時為假陰性。在100 μg/kg濃度水平下，除雙氟沙星和替米考星外，其余所有分析物的假陰性率均為零，雙氟沙星和替米考星在20次測定中各有1次出現(xiàn)了提取前體離子窗口無響應的情況，推測這兩種分析物對點樣要求較高，液滴過干會影響其響應，將添加回收樣品重新點樣后響應正常，因此實驗要控制樣滴在樣品卡上的干燥情況，結(jié)果列于表2。根據(jù)歐盟關于篩查方法在篩查限濃度水平下假陰性率的要求[27]，本實驗各目標分析物在100 μg/kg濃度下的假陰性率均≤5%，故將本方法的篩查限濃度水平確定為100 μg/kg。鑒于高分辨質(zhì)譜無法使用信噪比推算分析物的方法檢出限(LOD)，因此，各分析物的檢出限按照加標水平提取離子的響應情況(在相應加標水平的所有樣品中有明顯且穩(wěn)定的響應)進行標示，結(jié)果列于表3。

按1.5節(jié)方法對乳粉空白基質(zhì)進行前處理，獲得基質(zhì)空白提取液，制備相當于樣品分析物水平為20、50、100、150、200 μg/kg的標準溶液，并進行6個重復樣品的添加回收實驗，使用制備的基質(zhì)標準曲線進行定量分析，標準曲線決定系數(shù)r2為0.992 1～0.998 8，各分析目標物的回收率在72.5%～106.7%之間，典型的離子流圖示于圖2。

需要指出的是，回收率不是篩查方法必須考察的指標，回收率的引入可作為后續(xù)確證定量分析濃度范圍的參考。

2.5 實際樣品檢測

使用本方法快速篩查193份市售乳粉產(chǎn)品中16種常見抗生素，結(jié)果篩查出1例甲氧芐啶陽性樣品，其一級全掃描離子流圖和二級質(zhì)譜圖分別示于圖3和圖4。

由圖3可見，在DART-Q-Orbitrap HRMS一級質(zhì)譜正離子全掃描模式下，發(fā)現(xiàn)存在m/z291.145[M+H]+準分子離子峰，其質(zhì)譜依賴性二級質(zhì)譜子離子掃描得到了m/z123.066、261.097特征碎片離子，對照已建立的甲氧芐啶二級高分辨質(zhì)譜信息庫，確定樣品中含有甲氧芐啶。

表2 16種目標分析物殘留篩查測定假陰性率Table 2 False negative rates of 16 analytes with optimized method

表3 16種目標分析物在篩查限濃度水平下的平均回收率及檢出限Table 3 Average recoveries of 16 analytes at the level of screening concentration and limits of detection

圖2 空白加標回收乳粉樣品中16種目標分析物殘留的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 16 analytes residues in the spiked milk powder samples

圖3 市售51號乳粉樣品中目標化合物的檢測結(jié)果Fig.3 Analysis result of No.51 milk powder sample

3 結(jié)論

本研究建立了敞開式常壓離子化技術-實時直接分析離子源結(jié)合四極桿-回旋軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查乳粉樣品中16種常見抗生素殘留。通過優(yōu)化DART離子源參數(shù)，借助Q-Orbitrap質(zhì)譜儀高分辨率及Full MS-ddMS2數(shù)據(jù)采集方法，使用高通量通用性前處理有效地控制乳粉樣品的基質(zhì)影響，實現(xiàn)乳粉中16種常見抗生素殘留的快速有效篩查。

通過驗證實驗確定了方法的篩查限濃度水平、假陰性率等關鍵指標，并使用基質(zhì)標準曲線考察方法在篩查限濃度水平的回收率，方法指標滿足篩查分析要求，實際樣品檢測結(jié)果表明，該方法可有效完成乳粉中相關殘留的風險監(jiān)測分析。雖然該方法存在篩查限濃度水平相對較高的情況，但對于相關抗生素高水平風險殘留有實際的篩查意義和效果，且其前處理簡單、定性分析準確、假陰性率低，可為風險監(jiān)測實驗室和相關行業(yè)機構(gòu)提供一種快速可靠的篩查分析技術。

圖4 51號乳粉樣品(a)和甲氧芐啶標準品(b)的二級質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of No.51 milk powder sample (a) and trimethoprim standard (b)