楊光勇，薛 光，郭金喜，沙麗娜

(1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830054)

偶氮染料(ADs)是石油、建材等行業(yè)常用的工業(yè)染色劑，具有染色效果好、不易脫色、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，其代謝產(chǎn)物芳香胺具有強(qiáng)烈的致癌性[1-2]。ADs進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)可在動(dòng)物肝臟中被還原成芳香胺，芳香胺分子上的氨基具有代謝活性，可進(jìn)一步形成羥胺，從而破壞蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞發(fā)生變異[3]，因此，ADs被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)明令禁止用于食物染色。相關(guān)研究[4-5]顯示，我國(guó)ADs的污染狀況不容樂(lè)觀，一些不法之徒為使產(chǎn)品更加美觀，將工業(yè)染色劑非法添加至中藥材中，甚至將藥渣表面噴涂ADs后再次出售，嚴(yán)重?cái)_亂了正常的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)秩序。隨著國(guó)內(nèi)消費(fèi)者對(duì)健康、養(yǎng)生的日益重視，購(gòu)買安全、放心的中藥材及中藥飲片已成為人們提高自身免疫力、加強(qiáng)身體素質(zhì)的需求。同時(shí)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治非典型肺炎、新冠肺炎等重大傳染疾病時(shí)發(fā)揮了重要作用，未來(lái)將會(huì)服務(wù)國(guó)內(nèi)外更多人群。因此，建立中藥材中多種ADs的測(cè)定方法，對(duì)于從源頭控制產(chǎn)品質(zhì)量、保障消費(fèi)者食藥安全、保護(hù)中國(guó)特色醫(yī)藥等具有重要意義。

ADs的檢測(cè)方法有薄層色譜法[6]、分光光度法[7]、電化學(xué)分析法[8]、液相色譜法[9-10]等，這些方法存在定量能力有限、靈敏度低、選擇性差等問(wèn)題。近年來(lái)，研究者采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-14]、毛細(xì)管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜法(CE-MS/MS)[15]等檢測(cè)ADs。其中，GC-MS法需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，操作繁冗復(fù)雜，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)高通量分析；CE-MS/MS法在方法精密度、再現(xiàn)性等方面存在不足，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。還有研究采用核磁共振波譜法[16]、紅外光譜法[17]、高分辨質(zhì)譜直接測(cè)定法[18]等快速篩查樣品中的ADs，但這些方法均無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

超高效合相色譜(ultra performance convergence chromatography, UPC2)是以超臨界CO2為主要流動(dòng)相的色譜系統(tǒng)，兼具超臨界流體色譜的優(yōu)勢(shì)和傳統(tǒng)高效液相色譜的易用性，已成功應(yīng)用于雙酚A[19]、對(duì)羥基苯甲酸酯[20]等脂溶性化合物的分析。本實(shí)驗(yàn)擬采用固相萃取法(SPE)凈化、濃縮，超高效合相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(UPC2-MS/MS)測(cè)定中藥材中10種ADs，旨在為測(cè)定中藥材中脂溶性工業(yè)染料提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

UPC2-TQS超高效合相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離源(ESI)和MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理軟件；GCMS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品，配有電子轟擊源(EI)、GCMS Solution V4.2數(shù)據(jù)處理軟件及NIST 2014數(shù)據(jù)庫(kù)；Syncore Analyst平行蒸發(fā)定量濃縮儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；2-16P離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；S50R超聲波清洗器：德國(guó)Elma公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

蘇丹紅專用SPE柱、中性氧化鋁SPE柱：規(guī)格均為500 mg/6 mL，北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品；蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅G、蘇丹紅7B、蘇丹橙G、蘇丹黃、對(duì)位紅、蘇丹紅B標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥97.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；甲酸、甲酸銨、正己烷、甲醇、丙酮：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

成品藥材紅棗、枸杞、紅花、朱砂、紅藤、丹參：購(gòu)自本地市場(chǎng)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量的各標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷制成0.1 g/L單標(biāo)儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確移取適量的各儲(chǔ)備液，用正己烷稀釋成100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 樣品前處理

將紅棗、枸杞樣品置于-80 ℃冰箱中冷凍30 min，取出后立即放入粉碎機(jī)中，并加入適量的干冰中和摩擦熱，粉碎后過(guò)50目篩；其他種類藥材樣品直接粉碎后過(guò)50目篩。稱取2.00 g樣品于15 mL具塞玻璃離心管中，加入10 mL正己烷，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心5 min，移取正己烷層，殘?jiān)谜和橹貜?fù)提取2次，每次10 mL；合并提取液，轉(zhuǎn)移至經(jīng)5 mL正己烷活化后的中性氧化鋁SPE柱，以5 mL正己烷淋洗，棄去全部流出液，以6 mL含30%丙酮的正己烷溶液洗脫，收集洗脫液并定量濃縮至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1GC-MS條件 色譜柱：DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：100 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣(He)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；電子轟擊能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～800；溶劑延遲3 min。

1.5.2UPC2-MS/MS條件 色譜柱：Viridis HSS C18 SB柱(150 mm×2.1 mm×1.8 μm)，柱溫40 ℃；流動(dòng)相：超臨界CO2-10 mmol/L甲酸銨甲醇溶液(88∶12，V/V)；流動(dòng)相流速1.5 mL/min；系統(tǒng)背壓13.79 MPa；補(bǔ)償液：97%甲醇水溶液(含0.2%甲酸)，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL；電噴霧電離源正離子模式；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓2.5 kV；去溶劑氣流速750 L/h；去溶劑氣溫度400 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)采集。10種ADs的基本信息列于表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取及凈化條件的優(yōu)化

偶氮染料極性較弱，可使用丙酮、正己烷、乙醚等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。為減少樣品提取液中的極性干擾物并使提取更充分，實(shí)驗(yàn)選用30 mL正己烷分3次提取。通過(guò)比較振蕩、超聲兩種提取方式，以及在5、10、15 min不同超聲時(shí)間下加標(biāo)樣品(25 μg/kg)的回收率可知，超聲提取更加快速高效，最佳提取時(shí)間為10 min，結(jié)果示于圖1。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)提取后，加標(biāo)樣品的回收率即可滿足一般化學(xué)分析的要求。

表1 10種ADs的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量、母離子和子離子Table 1 Retention time, relative molecular mass (Mr), parent ions, daughter ions of ten kinds of ADs

圖1 加標(biāo)水平為25 μg/kg的紅花樣品在不同提取方式(a)、不同超聲時(shí)間(b)下10種ADs回收率Fig.1 Recoveries of ten kinds of ADs spiked in safflower at 25 μg/kg with different extraction ways (a) and different ultrasonic extraction time (b)

樣品提取液中含有較多雜質(zhì)，可能對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，并造成儀器污染。通過(guò)采用GC-MS掃描各樣品提取液，再利用NIST 2014數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)掃描所得的總離子流圖中各色譜峰進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)提取液中存在大量的長(zhǎng)鏈脂肪烴、萜類及其含氧衍生物、游離脂肪酸，這些化合物的峰面積之和約占色譜峰總面積的82%～95%，部分化合物的響應(yīng)高達(dá)108。因此，實(shí)驗(yàn)采用SPE法對(duì)加標(biāo)樣品(25 μg/kg)的提取液進(jìn)行凈化，并比較了不同SPE柱的凈化效果。按1.4節(jié)方法，分別用中性氧化鋁SPE柱和蘇丹紅專用SPE柱凈化提取液，并分析回收率數(shù)據(jù)及待測(cè)溶液的GC-MS圖譜。結(jié)果表明，經(jīng)凈化后，提取液GC-MS圖譜中雜質(zhì)峰簇明顯減少，各ADs回收率均有所提高，示于圖2。這可能是因?yàn)閮艋^(guò)程有效去除了提取液中大部分易引起離子化抑制效應(yīng)的樣品基質(zhì)；使用2種SPE柱時(shí)，各ADs的回收率沒(méi)有明顯差別，但中性

圖2 凈化前、后紅花樣品(加標(biāo)水平為25 μg/kg)提取液的GC-MS總離子流色譜圖(a)和回收率(b)Fig.2 TIC (a) and recoveries (b) of the extract of safflower (the spiked level of 25 μg/kg) before and after purification

氧化鋁SPE柱價(jià)格低廉，且可通過(guò)自行填裝進(jìn)一步降低成本。因此，實(shí)驗(yàn)選用中性氧化鋁SPE柱作為前處理凈化柱。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇 由于各ADs的結(jié)構(gòu)和極性極為相似，部分ADs的母離子及子離子的質(zhì)荷比均相同，不容易實(shí)現(xiàn)基線分離，進(jìn)而影響定性和定量的準(zhǔn)確性，這為選擇色譜柱帶來(lái)一定難度。本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相為超臨界CO2-甲醇(95∶5，V/V)、流速1.0 mL/min、柱溫45 ℃、背壓13.79 MPa的色譜條件下，考察了采用Viridis HSS C18 SB(150 mm×2.1 mm×1.8 μm)、Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm×1.8 μm)2種UPC2色譜柱測(cè)定ADs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，選用1-AA色譜柱無(wú)法有效分離蘇丹紅Ⅰ/蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅B/蘇丹紅Ⅳ這2組化合物，這可能是該色譜柱中以π-π、偶極-偶極為主要作用力的色譜填料無(wú)法識(shí)別ADs分子苯環(huán)上甲基的微小變化；選用HSS C18 SB色譜柱時(shí)，各ADs分離效果良好(分離度≥3.64)，但蘇丹紅G色譜峰略有拖尾，峰形不佳。綜上，實(shí)驗(yàn)選擇HSS C18 SB色譜柱作為分析柱繼續(xù)優(yōu)化色譜條件。

2.2.2色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓的選擇 系統(tǒng)背壓和色譜柱溫度的變化會(huì)影響超臨界CO2的密度，從而改變其洗脫能力。當(dāng)背壓增大、柱溫降低時(shí)，流動(dòng)相密度增大，化合物保留時(shí)間縮短。實(shí)驗(yàn)分別考察了不同柱溫(20、30、40、50 ℃)、不同背壓(12.07、13.10、13.79、14.48 MPa)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，各ADs分離效果并未隨背壓的改變而發(fā)生明顯變化；柱溫升高時(shí)，各ADs保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離趨勢(shì)增加；當(dāng)柱溫超過(guò)40 ℃時(shí)，保留時(shí)間反而縮短，可能因?yàn)榇藭r(shí)柱溫對(duì)分子能量的影響超過(guò)了其對(duì)流動(dòng)相洗脫能力的影響。綜合考慮分離度、系統(tǒng)壓力極限等因素，選取柱溫40 ℃、背壓13.79 MPa為測(cè)定條件。

2.2.3共溶劑的選擇 在UPC2中引入適量共溶劑可有效改善超臨界CO2的選擇性和洗脫能力。甲醇、乙腈、異丙醇等均是UPC2常用的共溶劑，通常選用洗脫強(qiáng)度值較高的共溶劑可獲得更優(yōu)異的色譜峰形。為獲得更尖銳、對(duì)稱的色譜峰形，實(shí)驗(yàn)選用含10 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液作為共溶劑。結(jié)果表明，在共溶劑中加入適量甲酸銨，可降低ADs分子上各官能團(tuán)與未鍵合硅醇羥基的相互作用，有效改善了拖尾峰的色譜峰形。在上述優(yōu)化的色譜條件下，進(jìn)一步調(diào)整流動(dòng)相組成及流速，以縮短分析時(shí)間，測(cè)定的10種ADs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的提取離子流色譜圖示于圖3。

2.2.4補(bǔ)償液組成及流速的優(yōu)化 柱塞泵通過(guò)三通組件將補(bǔ)償液輸送至色譜柱后端，補(bǔ)償液再通過(guò)另一個(gè)三通組件將流出色譜柱的化合物攜帶至質(zhì)譜儀。補(bǔ)償液不參與色譜分離，但其流速和組成對(duì)化合物色譜峰形、離子化效率等均有較大影響。ADs分子結(jié)構(gòu)中含N=N鍵，有利于氫加合物離子的形成。因此，實(shí)驗(yàn)選用含0.2%甲酸的甲醇溶液作為補(bǔ)償液，并進(jìn)一步考察了補(bǔ)償液在不同流速(0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min)下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，補(bǔ)償液流速較低時(shí)，各化合物質(zhì)譜響應(yīng)較弱，色譜峰半峰寬較大；當(dāng)流速為0.3 mL/min時(shí)，各ADs色譜峰形和響應(yīng)即可達(dá)到最佳狀態(tài)，繼續(xù)增大流速反而會(huì)使質(zhì)譜響應(yīng)減弱，可能因?yàn)榇藭r(shí)系統(tǒng)壓力過(guò)大，迫使背壓閥開啟排放功能，分流了部分目標(biāo)化合物。

注：峰序號(hào)與表1各化合物序號(hào)一致圖3 10種ADs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的提取離子流色譜圖Fig.3 Extractedion current chromatogram of ten kinds of ADs mixed standard solution

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)償液中加入適量純水可進(jìn)一步提高ADs的質(zhì)譜響應(yīng)。通過(guò)比較加入不同純水含量 (2%、3%、4%、5%、6%)的補(bǔ)償液時(shí)ADs的響應(yīng)強(qiáng)度可知，純水的最佳含量為3%。當(dāng)純水含量超過(guò)5%后，系統(tǒng)壓力波動(dòng)超過(guò)儀器警告閾值，設(shè)備始終無(wú)法就緒，可能因?yàn)榧兯母弑葻崛菔瓜到y(tǒng)排放閥無(wú)法正常控溫，從而影響了超臨界狀態(tài)的穩(wěn)定性。

2.2.5質(zhì)譜采集參數(shù)的優(yōu)化 將各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋后，依次注入三重四極桿質(zhì)譜儀，開啟IntelliStart自動(dòng)調(diào)諧功能，采用儀器自動(dòng)優(yōu)化所得的錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間等參數(shù)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1基質(zhì)效應(yīng) 分別配制系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和系列空白溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按基質(zhì)效應(yīng)(ME)=|(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/空白溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)|×100%進(jìn)行考察。ME值≤20%為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME值處于20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；ME值>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，各樣品的ME值≤13.4%，基質(zhì)效應(yīng)較弱。

2.3.2線性范圍、檢出限和定量限 用正己烷配制各組分質(zhì)量濃度均為1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，10種ADs在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.998 8，列于表2。

在陰性紅花樣品中加入適量各標(biāo)準(zhǔn)品，分別以信噪比(S/N)為3和10計(jì)算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果列于表2。10種ADs的LOD和LOQ分別為0.2～1.0 μg/kg、0.5～2.5 μg/kg。

2.3.3回收率與精密度 在陰性紅花樣品中加入適量各標(biāo)準(zhǔn)品，制成各ADs含量均為2.5、5、25 μg/kg的加標(biāo)樣品，每個(gè)加標(biāo)水平制備3份，按1.4節(jié)方法處理后測(cè)定，得到樣品的平均回收率為92.0%～106.2%(n=9)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～4.2%(n=9)，結(jié)果列于表2。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照建立的方法對(duì)紅棗、枸杞、紅花、朱砂、紅藤、丹參等6種共25份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中1份紅花樣品中檢出蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅳ，含量合計(jì)7.2 mg/kg，其他樣品均未檢出這10種偶氮染料。為進(jìn)一步確證測(cè)定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜掃描，示于圖4。保留時(shí)間為1.017 min的化合物其主要子離子分別為m/z93.1、156.2、231.2，推測(cè)其母離子裂解機(jī)理示于圖4a，其中子離子m/z231.2是由母離子脫去H2O后形成的，該子離子活性較高，可通過(guò)重排、開環(huán)等反應(yīng)進(jìn)一步碎裂成m/z142.1、193.1、217.1碎片離子。保留時(shí)間為4.230 min的化合物，其主要子離子為m/z90.9、156.3、224.4、260.5、276.2、363.3、366.1，推測(cè)其母離子裂解機(jī)理示于圖4b，母離子脫去H2O后形成m/z363.3碎片離子，可在反應(yīng)池中進(jìn)一步碎裂成m/z142.8、213.9、196.0等碎片離子。根據(jù)以上二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)，可排除樣品假陽(yáng)性的可能性。

表2 10種ADs的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear range, correlation coefficient (r2), LOD, LOQ, recovery and RSD of ten kinds of ADs

圖4 紅花樣品中蘇丹紅Ⅰ(a)、蘇丹紅Ⅳ(b)的子離子掃描圖Fig.4 Product ion scan spectra of Sudan Ⅰ(a) and Sudan Ⅳ(b) in the safflower

3 結(jié)論

本文建立了UPC2-MS/MS法測(cè)定中藥材中多種偶氮染料含量，采用優(yōu)化的樣品前處理方式，有效減小了基質(zhì)干擾，提高了檢測(cè)靈敏度。該方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性好、綠色環(huán)保，可在4.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)10種偶氮染料的分離和測(cè)定，適用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。