李 真 沈 璟

［對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)附屬中學(xué)（北京市第九十四中學(xué)） 北京 100102］

高中生物學(xué)教學(xué)要求在真實(shí)情境中解決問(wèn)題，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和科學(xué)探究能力，這要求教師在課程中向?qū)W生提供豐富的素材，包括實(shí)驗(yàn)素材和科研素材，以及生產(chǎn)實(shí)踐中的具體應(yīng)用，使學(xué)生既能運(yùn)用知識(shí)解決問(wèn)題，又能體會(huì)生物學(xué)科的價(jià)值?！镀胀ǜ咧猩飳W(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》，更強(qiáng)調(diào)學(xué)生的獲得，課堂的活動(dòng)要有互動(dòng)性、趣味性，凸顯學(xué)生的主體地位，有效提升課堂質(zhì)量。

1 教材及學(xué)情分析

本節(jié)是拓展課程，內(nèi)容涉及選修1 專(zhuān)題3 課題3 及專(zhuān)題5 課題2，具體包括：纖維素酶分解纖維素的原理、纖維素分解菌的初步篩選、PCR 的原理及應(yīng)用。本節(jié)課以課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、課題2微生物的分離與計(jì)數(shù)、PCR 為技術(shù)基礎(chǔ)，以必修1的酶的作用和特點(diǎn)及必修2 的DNA 復(fù)制為理解的前提，又與選修3 現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題緊密聯(lián)系。

學(xué)生具備酶的作用及特點(diǎn)的基礎(chǔ)知識(shí)，了解纖維素酶分解纖維素和PCR 的原理，但知識(shí)不夠系統(tǒng)化，尚不能前后聯(lián)系；通過(guò)親身的實(shí)驗(yàn)操作，初步掌握PCR 技術(shù)，但對(duì)于如何設(shè)計(jì)PCR 引物獲得目的基因仍有一定困難，尤其是如何設(shè)計(jì)引物、改造DNA 片段；觀察到了日常生活中的現(xiàn)象，例如，落葉的分解、植食性動(dòng)物對(duì)植物的消化，但不能將其與所學(xué)知識(shí)相聯(lián)系，并應(yīng)用于生活、生產(chǎn)中。

2 教學(xué)目標(biāo)

1）通過(guò)制備臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀察并比較破壁機(jī)、土壤中初步分離鑒定的纖維素分解菌、纖維素酶的破壁效果，從定性的角度明確纖維素酶的破壁效果最好，形成初步的實(shí)驗(yàn)設(shè)想：利用生物技術(shù)對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行改造。

2）通過(guò)資料分析，了解原核生物和真核生物在表達(dá)纖維素酶方面的優(yōu)、缺點(diǎn)，討論得出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR 引物設(shè)計(jì)構(gòu)建重組纖維素酶基因片段在原核生物中表達(dá)，培養(yǎng)與他人合作的意識(shí)及運(yùn)用生物學(xué)術(shù)語(yǔ)敘述實(shí)驗(yàn)方案的能力，培養(yǎng)科學(xué)思維。

3）通過(guò)分析真實(shí)的工業(yè)生產(chǎn)中纖維素酶轉(zhuǎn)化酵母菌的實(shí)例，體會(huì)生物學(xué)研究在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，感悟生物科學(xué)研究的價(jià)值。

3 重、難點(diǎn)及突破方法

1）重點(diǎn)：①明確實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般思路和原則，單一變量、設(shè)置對(duì)照組；②描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果、概述實(shí)驗(yàn)結(jié)論；③搭橋PCR 的引物設(shè)計(jì)。

2）難點(diǎn)：設(shè)計(jì)PCR 的引物獲得重組基因片段（搭橋PCR）。

3）突破方法：以實(shí)驗(yàn)引入，激發(fā)學(xué)生興趣，通過(guò)展示不同處理后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果引起學(xué)生思考，分析實(shí)驗(yàn)采用的單一變量（自變量）是處理的方式不同，因變量是破壁的效果，請(qǐng)學(xué)生描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。為了高效獲得纖維素，最佳方法是酶解法，纖維素酶的制備選用什么方式更合理？出示大量的已有研究資料后，學(xué)生能提出采用細(xì)菌生產(chǎn)高效、經(jīng)濟(jì)，需要解決的問(wèn)題是要加入一段序列才能使纖維素酶向胞外分泌，從而引出本節(jié)課的難點(diǎn)，將2段序列拼接，需要通過(guò)PCR 的引物設(shè)計(jì)，人為創(chuàng)造重疊區(qū)域體外擴(kuò)增。通過(guò)小組討論的形式，逐步引導(dǎo)學(xué)生加深思維力度；通過(guò)展示、糾錯(cuò)、改正的過(guò)程，更高效地落實(shí)重點(diǎn)、突破難點(diǎn)。

4 教學(xué)過(guò)程

4.1 纖維素的重要性 纖維素 （C6H10O5）n是由葡萄糖組成的大分子多糖，是地球上最豐富的可再生資源。纖維素主要來(lái)源于植物界，包括棉花、木材、種植業(yè)廢棄物和禾草類(lèi)植物，除了植物界，細(xì)菌和動(dòng)物也可制造纖維素。據(jù)報(bào)道，每年全球大概會(huì)產(chǎn)生干重為1.3×1017t 的陸生植物，其中，纖維素占所有植物干重的50%。植物材料的主要成分除了半纖維素和木質(zhì)素以外，就是纖維素，纖維素物質(zhì)占地球總生物量的40%。若能將這些纖維素水解轉(zhuǎn)化為具有經(jīng)濟(jì)潛力的生物多糖，不僅有利于環(huán)境保護(hù)，還可解決能源、糧食、環(huán)境等一些列問(wèn)題［1］。提問(wèn)：如何獲取植物細(xì)胞壁中的纖維素？

4.2 纖維素的獲取和結(jié)果分析 在教師引導(dǎo)下，結(jié)合生活經(jīng)驗(yàn)和前期篩選纖維素分解菌的經(jīng)歷，學(xué)生提出可用物理（破壁機(jī)）、生物（纖維素分解菌、纖維素酶）方法破除細(xì)胞壁，獲得纖維素或?qū)⑵渌?。隨后，以小組為單位制備臨時(shí)裝片（圖1），觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，學(xué)生能得出結(jié)論：采用纖維素酶處理，水解最徹底、效果最佳，而用纖維素分解菌處理在相同時(shí)間內(nèi)效果不佳，所以，利用植物中的纖維素需要提純獲得纖維酶。

圖1 不同處理后植物細(xì)胞情況

4.3 通過(guò)PCR 改造纖維素基因

資料1：纖維素是一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，Reese 等（1950年）曾提出了C1-Cx 假說(shuō)，該假說(shuō)認(rèn)為組成纖維素的不同酶需要協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。一般情況下，C1酶首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個(gè)葡萄糖［2］。

纖維素酶的來(lái)源非常廣泛，植物、昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、細(xì)菌、放線菌、真菌等都能產(chǎn)生纖維素酶，但是植物中的纖維素酶含量極低且難以提取，故目前纖維素酶的主要來(lái)源是微生物。

細(xì)菌培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)，成本相對(duì)低，但其產(chǎn)生纖維素酶的量相對(duì)較低，且大多不能分泌至細(xì)菌細(xì)胞外；主要產(chǎn)生的是C1酶，只有極少數(shù)細(xì)菌能分泌Cx 酶。真菌能產(chǎn)生3 類(lèi)纖維素酶，但是分泌至菌體外的比例也較少,且會(huì)相互發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用，酶的糖基化程度過(guò)高,還會(huì)影響酶的效率［3］。

任務(wù)：列舉細(xì)菌、真菌生產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)、缺點(diǎn)（表1）。

表1 細(xì)菌、真菌生產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)、缺點(diǎn)

為了提高產(chǎn)量、節(jié)約成本，應(yīng)同時(shí)生產(chǎn)出3 種酶使其能協(xié)同發(fā)揮作用，學(xué)生提出設(shè)想將真菌編碼纖維素酶的基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)，可提高產(chǎn)量節(jié)約成本、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，但這樣操作仍存在問(wèn)題，即細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶不向胞外分泌。

資料2：酵母表達(dá)系統(tǒng)具有將纖維素的最終產(chǎn)物——葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的能力，如果能將纖維素酶的基因克隆至酵母中，可實(shí)現(xiàn)從纖維素到葡萄糖再到酒精的完整發(fā)酵過(guò)程?？蒲腥藛T將瑞氏木霉纖維素基因（C1酶和Cx 酶）轉(zhuǎn)入釀酒酵母中表達(dá)，離心后取上清液，檢測(cè)重組酵母相對(duì)濾紙的酶活性，結(jié)果如圖2所示［4］。

圖2 重組酵母的相對(duì)濾紙酶活性

通過(guò)對(duì)資料2 的分析，學(xué)生能說(shuō)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果：2組的相對(duì)濾紙酶活性高于對(duì)照組（1 組），3、4 組的相對(duì)濾紙酶活性顯著低于對(duì)照組，而3 組的相對(duì)濾紙酶活性又高于4 組。歸納實(shí)驗(yàn)結(jié)論：C1酶和Cx 酶共轉(zhuǎn)化能提高相對(duì)濾紙酶活，3 組菌株中表達(dá)的Cx 酶很可能并未分泌至細(xì)胞外。

資料3：科研人員發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌也可產(chǎn)生纖維素C1酶。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌具有以下優(yōu)勢(shì)：①在培養(yǎng)基中直接分泌蛋白并具有很強(qiáng)的分泌能力；②擁有一套高效分泌的信號(hào)肽系統(tǒng)，可高效地分泌目的蛋白；③是非致病性菌，無(wú)內(nèi)毒素，具有臨床和環(huán)境方面的安全性。

枯草芽孢桿菌的強(qiáng)分泌能力與信號(hào)肽序列相關(guān)，位于信號(hào)肽序列下游的基因片段，表達(dá)的蛋白質(zhì)可分泌至細(xì)胞外［3］（圖3）。

圖3 枯草芽孢桿菌信號(hào)肽序列［3］

任務(wù)：①利用PCR 技術(shù)應(yīng)選擇引物________擴(kuò)增枯草芽孢桿菌信號(hào)肽序列（表2）。

表2 引物名稱(chēng)及序列

②根據(jù)資料2 和資料3 提供的信息，請(qǐng)你提出提高原料利用率且降低成本釀酒的方法。

通過(guò)上述活動(dòng)，學(xué)生能選擇正確引物擴(kuò)增目的基因片段，同時(shí)能提出需要將2 個(gè)片段相連接，人為設(shè)計(jì)一段中間重疊的區(qū)域，通過(guò)搭橋PCR 將信號(hào)肽片段和纖維素酶基因片段相連接。選擇2個(gè)小組進(jìn)行展示匯報(bào)，將最終結(jié)果（圖4）呈現(xiàn)在黑板上，完善過(guò)程中其他小組提出質(zhì)疑或答疑。

圖4 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增過(guò)程

4.4 板書(shū)設(shè)計(jì)（圖5）

圖5 板書(shū)設(shè)計(jì)

5 教學(xué)反思

本節(jié)課的設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)和教學(xué)掛鉤，引導(dǎo)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、解決思路，形成良好的科學(xué)思維，將前期的纖維素分解菌的分離和鑒定實(shí)驗(yàn)與后續(xù)的PCR 實(shí)驗(yàn)相串聯(lián)，巧妙銜接前、后知識(shí)。資料充分，既有學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也有科研的數(shù)據(jù)，提高學(xué)生的參與感，充分落實(shí)了對(duì)學(xué)生生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的培養(yǎng)，在基本知識(shí)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)學(xué)生的能力。整個(gè)課堂的呈現(xiàn)，學(xué)生參與度較高，教學(xué)設(shè)計(jì)對(duì)學(xué)生的思維訓(xùn)練由淺入深，能滿足高階思維的要求。課堂反饋環(huán)節(jié)，教師指出本節(jié)課是針對(duì)現(xiàn)有問(wèn)題提出的設(shè)想，在真實(shí)場(chǎng)景中能否實(shí)現(xiàn)還有待進(jìn)一步的研究和科學(xué)的論證，這些都是學(xué)生在未來(lái)科研中可研究的方面。