楊智超，曹 陽(yáng)，沈超怡，孫崇德，吳 迪,*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，浙江 杭州 310058）

番茄（Solanum lycopersicumL.）又稱西紅柿，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、酸類和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)常食用能提高人體免疫力[1-3]。櫻桃番茄是番茄大家族的重要成員，在我國(guó)的種植面積不斷擴(kuò)大[4]。櫻桃番茄皮薄多汁，成熟后會(huì)迅速軟化，貯運(yùn)過(guò)程容易腐爛，造成品質(zhì)下降[5]；同時(shí)由于櫻桃番茄常被鮮食，其表面的食源性致病菌過(guò)多容易引發(fā)食源性疾病[6-7]。因此，減少櫻桃番茄果實(shí)采后腐爛和降低果實(shí)表面微生物數(shù)量非常重要。

高壓靜電場(chǎng)（high voltage electrostatic field，HVEF）是指在單位距離上通過(guò)穩(wěn)定的高壓作用而形成的一種靜電場(chǎng)[8]。HVEF處理可以通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)果蔬保鮮[9-10]，主要包括：1）改變果實(shí)的電場(chǎng)能；2）電離空氣中的氧氣形成臭氧；3）影響果實(shí)細(xì)胞膜的離子通透性；4）改變果蔬酶活性；5）破壞乙烯和有關(guān)揮發(fā)性物質(zhì)；6）去除空氣傳播的真菌孢子；7）在貯存環(huán)境中產(chǎn)生和釋放空氣負(fù)離子和其他活性物質(zhì)。由于HVEF處理只涉及物理過(guò)程，無(wú)化學(xué)藥物殘留，因此是一種綠色的殺菌保鮮方法[11]。并且與傳統(tǒng)高溫殺菌相比，HVEF處理不產(chǎn)生高溫，能更好地保留果蔬中的營(yíng)養(yǎng)成分，并且具有耗能低的優(yōu)勢(shì)。因此，HVEF在果蔬等食品殺菌中有著廣闊的應(yīng)用前景[12]。

此前研究發(fā)現(xiàn)，HVEF處理會(huì)引起生物體內(nèi)的酶活性變化，從而影響一系列代謝功能[9]。已有學(xué)者研究了不同果蔬經(jīng)HVEF處理后的品質(zhì)變化，包括蘋果[13]、芒果[14]、柿子[15]、柑橘[16]、梨[17]等。代謝組學(xué)是研究生物系統(tǒng)對(duì)生物刺激或遺傳信息改變的整體動(dòng)態(tài)代謝反應(yīng)，理解復(fù)雜多細(xì)胞系統(tǒng)中隨時(shí)間的系統(tǒng)變化，尋求對(duì)復(fù)雜生物樣本代謝進(jìn)行分析描述的一門學(xué)科[18]。由于代謝物能將基因和蛋白表達(dá)的微小變化進(jìn)行體現(xiàn)與放大，因此，通過(guò)代謝組學(xué)分析既可發(fā)現(xiàn)生物體在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)后的不同應(yīng)答，也可以區(qū)分同種不同個(gè)體之間的表型差異[19]。

本實(shí)驗(yàn)以新鮮‘黃妃’櫻桃番茄為材料，以表面腐爛率、大腸桿菌菌落總數(shù)、乙烯釋放量、呼吸速率、質(zhì)量損失率等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了在不同電場(chǎng)強(qiáng)度和不同處理時(shí)間下HVEF處理對(duì)櫻桃番茄采后貯藏保鮮的影響；同時(shí)對(duì)HVEF處理后的櫻桃番茄果實(shí)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，探究其代謝產(chǎn)物在處理后的含量差異和變化趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮‘黃妃’櫻桃番茄購(gòu)于湖州南潯慶豐園農(nóng)場(chǎng)，挑選大小一致、無(wú)病蟲害的櫻桃番茄若干，30 min內(nèi)運(yùn)送至浙江大學(xué)紫金港校區(qū)實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌O157:H7（菌種編號(hào)：ATCC25922） 上海生物保藏中心。

伊紅美藍(lán)（eosin-methylene blue，EMB）培養(yǎng)基浙江格陵設(shè)備科技有限公司；氯化鈉 浙江同力信息科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZJU-GYJD-001型高壓靜電場(chǎng)試驗(yàn)儀器為浙江大學(xué)自主研發(fā)，包括控制臺(tái)、高壓靜電電源（電壓范圍為0～90 kV）和果實(shí)處理裝置（電場(chǎng)強(qiáng)度范圍為0～1 800 kV/m）。其中，果實(shí)處理裝置為帶卡槽的絕緣支架組成的密閉箱體，通過(guò)調(diào)節(jié)高低壓電極板的距離，可形成不同的電場(chǎng)強(qiáng)度。

BSA2202S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；Research plus移液槍 德國(guó)Eppendorf公司；HZ-9210K搖床天津華立達(dá)公司；7980氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；CheckPoint II便攜式O2/CO2測(cè)定儀 美國(guó)MOCON Europe A/S公司；Scientz-100F凍干機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；MM400 Retsch研磨儀 德國(guó)RETSCH公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)1：以櫻桃番茄表面大腸桿菌菌落數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間為因素，設(shè)置10 個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)2：進(jìn)一步以腐爛率、乙烯釋放量、呼吸速率和質(zhì)量損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從表1中選擇CK、處理組1-1（處理組1，電場(chǎng)強(qiáng)度最低、時(shí)間最短）以及處理組3-3（處理組2，電場(chǎng)強(qiáng)度最高、時(shí)間最長(zhǎng)）進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及見(jiàn)表2。

表1 高壓靜電場(chǎng)處理櫻桃番茄試驗(yàn)因素水平Table 1 Electric field intensities and durations of HVEF treatment

表2 高壓靜電處理實(shí)驗(yàn)組別表Table 2 Experimental groups for high voltage electrostatic field treatment

對(duì)實(shí)驗(yàn)2中CK組、處理組1和處理組2的果實(shí)，通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrum，UPLC-MS/MS）檢測(cè)平臺(tái)和自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)出的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝物數(shù)據(jù)處理與分析。每組處理共3 次重復(fù)。

1.3.2 大腸桿菌接種

將大腸桿菌O157:H7在37 ℃ LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度約為5×106CFU/mL備用。在實(shí)驗(yàn)1中，將果實(shí)浸泡在大腸桿菌懸液中5 min，以保證充分接種。每次處理15 個(gè)櫻桃番茄，5 個(gè)一組，共3 組重復(fù)。

1.3.3 HVEF處理

將櫻桃番茄置于高壓靜電場(chǎng)試驗(yàn)儀器的果實(shí)處理裝置中進(jìn)行HVEF處理，其中實(shí)驗(yàn)1為接菌后的果實(shí)，實(shí)驗(yàn)2為未接菌的果實(shí)。實(shí)驗(yàn)2將處理后的果實(shí)置于90%相對(duì)濕度、4 ℃的冷庫(kù)貯藏備用。HVEF處理在室溫下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)使用的高壓靜電場(chǎng)試驗(yàn)儀器可手動(dòng)調(diào)節(jié)電壓和電極板間的距離。因此，本實(shí)驗(yàn)中不同處理組所需要的電場(chǎng)強(qiáng)度是通過(guò)改變電壓和電極板間距離的數(shù)值來(lái)獲得的，具體計(jì)算如公式（1）所示。

1.3.4 菌落形成單位計(jì)數(shù)法計(jì)算大腸桿菌菌落總數(shù)

實(shí)驗(yàn)1中，HVEF處理后，采用菌落形成單位計(jì)數(shù)法計(jì)算櫻桃番茄表面的大腸桿菌數(shù)量。選?。?5±1）g完整櫻桃番茄果實(shí)置于225 mL、質(zhì)量濃度為0.85%的氯化鈉溶液中，櫻桃番茄與氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1∶10，置于搖床上充分搖晃得到樣品原液。取100 μL原液，分別用無(wú)菌蒸餾水稀釋10、100、1 000倍，共3 個(gè)梯度。吸取稀釋后的溶液各100 μL，于無(wú)菌EMB培養(yǎng)基涂布均勻，等待培養(yǎng)基上無(wú)水滴后于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算櫻桃番茄表面大腸桿菌菌落總數(shù)[20]。

1.3.5 腐爛率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)2中，HVEF處理后測(cè)定腐爛率。每隔24 h測(cè)定腐爛率。每次處理120 個(gè)櫻桃番茄，40 個(gè)一組，共3 組重復(fù)。腐爛率按式（2）計(jì)算。

1.3.6 質(zhì)量損失率的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)2中，HVEF處理后測(cè)定質(zhì)量損失率。每隔24 h測(cè)定質(zhì)量，計(jì)算質(zhì)量損失率。每次處理120 個(gè)櫻桃番茄，40 個(gè)一組，共3 組重復(fù)。質(zhì)量損失率按式（3）計(jì)算。

1.3.7 乙烯釋放量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)2中，HVEF處理后測(cè)定乙烯釋放量。將櫻桃番茄置于300 mL樂(lè)扣盒中，每隔24 h蓋上蓋子，1 h后用1 mL針管抽取1 mL氣體，進(jìn)樣口中，加熱器設(shè)定溫度140 ℃，流速33 mL/min，隔墊吹掃流速為3 mL/min；色譜柱流速30 mL/min，壓力18.118 psi；柱箱溫度100 ℃；檢測(cè)器中，加熱器溫度230 ℃，空氣流速400 mL/min，氫氣燃?xì)饬魉?0 mL/min，尾吹氣流速（N2）為10 mL/min。每次處理24 個(gè)櫻桃番茄，8 個(gè)一組，共3 組重復(fù)。

1.3.8 呼吸速率的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)2中，HVEF處理后測(cè)定呼吸速率。將櫻桃番茄置于300 mL樂(lè)扣盒中，每隔24 h蓋上蓋子，1 h后用便攜式O2/CO2測(cè)定儀測(cè)定呼吸速率。每次處理24 個(gè)櫻桃番茄，8 個(gè)一組，共3 組重復(fù)。

1.3.9 代謝組學(xué)分析樣品提取流程

實(shí)驗(yàn)2中，HVEF處理后進(jìn)行代謝組學(xué)分析。櫻桃番茄樣品放置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥，隨后利用研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀。稱取100 mg的粉末，溶解于0.6 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇提取液中，并將溶解后的樣品于4 ℃冰箱過(guò)夜，期間漩渦6 次以提高提取率；將提取液離心（10 000×g、10 min）后吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.10 代謝物定性與定量分析

基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（metware database），根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，分析時(shí)去除了同位素信號(hào)，含K+、Na+、NH4+的重復(fù)信號(hào)，以及本身是其他更大分子質(zhì)量物質(zhì)碎片離子的重復(fù)信號(hào)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）利用前幾個(gè)主要成分揭示各組之間的總體代謝差異以及組內(nèi)樣本之間的變異性。將原始數(shù)據(jù)壓縮成n個(gè)主成分來(lái)描述原始數(shù)據(jù)集的特征，PC1表示能描述多維數(shù)據(jù)矩陣中最明顯的特征，PC2表示除PC1之外所能描述數(shù)據(jù)矩陣中最顯著的特征，PC3…PCn以此類推。PCA用R軟件（www.r-project.org/）的內(nèi)置統(tǒng)計(jì)prcomp函數(shù)，設(shè)置prcomp函數(shù)參數(shù)scale=True，表示對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行unit variance scaling（UV）歸一化。

1.4.2 正交偏最小二乘法判別分析

正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）可以最大程度地提高組間的差異，是一種篩選差異代謝物的有效方法。OPLS-DA在原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行中心化處理，利用R軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)進(jìn)行分析。Q2是評(píng)估OPLS-DA中模型的重要參數(shù)。Q2大于0.5時(shí)可認(rèn)為是有效的模型，Q2大于0.9表示模型出色。

1.4.3 差異代謝物篩選

在對(duì)檢測(cè)到的代謝物進(jìn)行定性和定量分析后，結(jié)合具體樣品的分組情況，比較各分組中代謝物定量的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）變化，并對(duì)各分組間的差異倍數(shù)進(jìn)行l(wèi)og2處理后，將變化排在前面的差異表達(dá)代謝物進(jìn)行結(jié)果展示。篩選標(biāo)準(zhǔn)：選取FC≥2和FC≤0.5的代謝物。代謝物在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中FC≥2和FC≤0.5，則認(rèn)為差異顯著。

1.4.4 差異代謝物KEGG分類和代謝物富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[21]對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋，對(duì)差異顯著代謝物KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類。根據(jù)差異代謝物結(jié)果，進(jìn)行KEGG通路富集，其中富集因子為通路中差異表達(dá)代謝物的個(gè)數(shù)與該通路中所有檢測(cè)到的代謝物總數(shù)之間的比值，該值越大表示富集程度越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分析結(jié)果

采用菌落形成單位計(jì)數(shù)法測(cè)定未經(jīng)HVEF處理（CK組）和HVEF處理后的櫻桃番茄表面大腸桿菌菌落總數(shù)，結(jié)果如圖1所示。與CK組大腸桿菌菌落總數(shù)（4.79（lg（CFU/g）））相比，不同處理水平的果實(shí)表面大腸桿菌菌落總數(shù)均顯著降低（P＜0.05），降低數(shù)量在1.44～2.15（（lg（CFU/g）））之間，說(shuō)明HVEF處理能夠有效殺滅櫻桃番茄果實(shí)表面的食源性致病菌，保障消費(fèi)者健康。

圖1 HVEF處理對(duì)櫻桃番茄果實(shí)表面大腸桿菌菌落總數(shù)的影響Fig. 1 Effect of HVEF treatment on the total number of Escherichia coli colonies on the surface of cherry tomato fruits

2.2 生理指標(biāo)分析結(jié)果

2.2.1 腐爛率

腐爛率是判斷果蔬保鮮效果的重要指標(biāo)。HVEF處理后果實(shí)在18 d貯藏期的腐爛率變化如圖2所示。CK組果實(shí)在第8天開(kāi)始腐爛，腐爛率達(dá)到5.83%；處理組1沒(méi)有發(fā)生腐爛，而處理組2腐爛率僅為0.83%。貯藏8～18 d，各組腐爛率均逐漸增加，但兩個(gè)處理組的腐爛率較CK組始終低5%～10%。此外，兩個(gè)處理組在貯藏8～12 d期間的腐爛率較為接近，但在貯藏14 d后，處理組2的腐爛率與處理組1相比低5%～9%。上述結(jié)果表明，HVEF處理能夠延緩櫻桃番茄采后腐爛，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，且腐爛率的降低與處理強(qiáng)度和時(shí)間有關(guān)。

圖2 HVEF處理對(duì)櫻桃番茄果實(shí)腐爛率的影響Fig. 2 Effect of HVEF treatment on decay rate of cherry tomato fruits

2.2.2 質(zhì)量損失率

質(zhì)量損失率可以反映果實(shí)水分的散失狀況[22]。HVEF處理后櫻桃番茄的質(zhì)量損失率變化如圖3所示。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組和處理組的質(zhì)量損失率都呈增加趨勢(shì)。各組間質(zhì)量損失率差異均不顯著，說(shuō)明HVEF處理對(duì)櫻桃番茄采后質(zhì)量損失并無(wú)影響。

2.2.3 乙烯釋放量

內(nèi)源乙烯的大量合成會(huì)加速果實(shí)的成熟與衰老[23]。由于4 ℃貯藏環(huán)境下，果實(shí)的乙烯釋放量偏低，為了更好地研究HVEF處理后果實(shí)的乙烯釋放量變化，將HVEF處理后的果實(shí)放置于20 ℃下貯藏，并測(cè)定其乙烯釋放量，結(jié)果如圖4所示。HVEF處理后第0天，處理組的乙烯釋放量均低于CK組；處理后1～2 d，兩個(gè)處理組的乙烯釋放量仍低于CK組；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3 組之間乙烯釋放量總體無(wú)顯著性差異，但處理組的乙烯釋放量依然低于CK組。以上結(jié)果表明，HVEF處理對(duì)果實(shí)內(nèi)源乙烯的合成與釋放在貯藏前期有一定的抑制作用，從而有助于延緩櫻桃番茄果實(shí)的衰老進(jìn)程，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。

2.2.4 呼吸速率

呼吸速率是評(píng)價(jià)果實(shí)采后成熟衰老和貯藏性的重要指標(biāo)之一[24-25]。由于4 ℃貯藏環(huán)境下果實(shí)呼吸速率偏低，為了更好地研究HVEF處理后櫻桃番茄的呼吸速率變化，將HVEF處理后的果實(shí)置于20 ℃下貯藏，并測(cè)定其呼吸速率，結(jié)果如圖5所示。在前中期貯藏過(guò)程中果實(shí)的呼吸速率呈下降趨勢(shì)，但在貯藏后期果實(shí)呼吸速率上升。番茄屬于呼吸躍變型果實(shí)[26]，因此后期呼吸速率上升可能是由于內(nèi)源乙烯含量上升，誘導(dǎo)番茄果實(shí)發(fā)生呼吸躍變。但不同的處理組之間總體無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明，HVEF處理在殺菌保鮮的同時(shí)，可以保證櫻桃番茄果實(shí)正常的呼吸速率。

圖5 HVEF處理對(duì)櫻桃番茄果實(shí)呼吸速率的影響Fig. 5 Effect of HVEF treatment on respiration rate of cherry tomato fruits

2.3 代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 代謝物定性分析結(jié)果

利用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中所有離子的強(qiáng)度進(jìn)行加和，然后連續(xù)描繪得到圖譜，進(jìn)而分析獲得混樣質(zhì)控（quality control，QC）樣本的總離子流（total ions current，TIC）重疊圖。通過(guò)對(duì)不同QC樣本TIC圖進(jìn)行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測(cè)的重復(fù)性和可靠性。結(jié)果如圖6所示，代謝物檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高，表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品檢測(cè)不同時(shí)間時(shí)，信號(hào)穩(wěn)定性較好。同時(shí)，以橘皮素和5,6,7,4’-四甲氧基黃酮為例，對(duì)具體代謝物二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行展示（圖7）。二級(jí)質(zhì)譜圖顯示出兩種代謝物在質(zhì)譜分析過(guò)程中的碎片離子信息。將檢測(cè)出的二級(jí)質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中二級(jí)譜圖進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)代謝物定性。

圖6 QC樣本質(zhì)譜檢測(cè)TIC重疊圖Fig. 6 Overlapping total ion current (TIC) chromatographs of QC samples

圖7 代謝物二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 7 Secondary mass spectra of metabolites

2.3.2 代謝物PCA和層次聚類分析結(jié)果

PCA得分圖如圖8所示。前兩個(gè)主成分PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為24.07%和20.93%，兩者的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到45%。在PCA得分圖中3 個(gè)組和QC樣品可以分開(kāi)，并且處理組1、處理組2和QC重復(fù)的樣本緊湊聚集，表明實(shí)驗(yàn)可重復(fù)且可靠。CK組樣本較離散，可能是由于生物差異性導(dǎo)致的。為消除數(shù)量對(duì)模式識(shí)別的影響，對(duì)每種代謝物的峰面積進(jìn)行l(wèi)g變換，隨后進(jìn)行層次聚類分析，以展示CK組分別與處理組1和處理組2的代謝物差異。圖9中CK組含量較高的代謝物集中在聚類分析結(jié)果的中下部，而處理組1和處理組2含量較高的代謝物分別聚集在中上部和上部。PCA和聚類分析共同表明3 個(gè)組的果實(shí)具有不同的代謝產(chǎn)物譜。

圖8 PCA得分圖Fig. 8 PCA score plot of PC1 versus PC2

圖9 層次聚類分析Fig. 9 Hierarchical clustering analysis

2.3.3 代謝物OPLS-DA結(jié)果

OPLS-DA模型成對(duì)比較了不同處理組中樣品的代謝物含量。圖10分別顯示了CK組和處理組1間的差異（R2X＝0.747，R2Y＝1，Q2＝0.988）、CK組和處理組2之間的差異（R2X＝0.727，R2Y＝0.999，Q2＝0.992）以及處理組1和處理組2之間的差異（R2X＝0.722，R2Y＝1，Q2＝0.998）。所有處理組間比較的Q2均超過(guò)0.9，說(shuō)明這些模型穩(wěn)定且可靠，可用于代謝物篩選。

圖10 OPLS-DA模型Q2Fig. 10 Q2 value of OPLS-DA model

2.3.4 差異代謝物篩選

如圖11所示，處理組1與CK組間共有20 種代謝物存在顯著差異（P＜0.05），其中10 種代謝物上調(diào)，10 種代謝物下調(diào)；處理組2與CK組之間共有14 種代謝物存在顯著差異（P＜0.05），其中8 種代謝物含量上調(diào)，6 種代謝物含量下調(diào)。表3顯示，HVEF處理后差異代謝物的變化主要存在上調(diào)和下調(diào)兩種趨勢(shì)。

表3 HVEF處理后櫻桃番茄差異代謝物的主要變化趨勢(shì)Table 3 Major trend of differential metabolites in cherry tomato fruits after HVEF treatment

圖11 處理組1與CK組差異代謝物（A）以及處理組2與CK組差異代謝物（B）Fig. 11 Differential metabolites between treatment group 1 and control group (A), and between treatment group 2 and control group (B)

在上調(diào)趨勢(shì)中，共有3 種上調(diào)形式。第1種上調(diào)方式是相比CK組，處理組1和處理組2的代謝物含量均顯著上升（P＜0.05），但兩個(gè)處理組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。該類代謝物主要包括屬于類黃酮的橘皮素、川陳皮素（5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮）、5,6,7,4’-四甲氧基黃酮，以及生物堿中的打碗花精B2。說(shuō)明在電場(chǎng)強(qiáng)度最低、時(shí)間最短和電場(chǎng)強(qiáng)度最高、時(shí)間最長(zhǎng)的條件下，這些代謝物含量變化程度是一致的。第2種上調(diào)方式是處理組1的代謝物含量與CK組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間在處理組1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加和延長(zhǎng)時(shí)（處理組2），代謝物含量顯著上升（P＜0.05）。這類代謝物主要包括生物堿中的三(二氫咖啡酰)精胺和番茄堿。說(shuō)明只有電場(chǎng)強(qiáng)度較大的時(shí)候，才會(huì)引起這些代謝物的變化。第3種上調(diào)方式是代謝物的含量會(huì)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增大和處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，即處理組1的代謝物含量高于CK組，而處理組2的代謝物含量高于處理組1且較CK組顯著提高（P＜0.05），如生物堿中的番茄次堿酚。說(shuō)明這些代謝物含量的變化與高壓靜電的強(qiáng)度有關(guān)。

在下調(diào)趨勢(shì)中，共有3 種下調(diào)形式。第1種下調(diào)方式是相比于CK組，處理組1和2中代謝物含量均顯著下降（P＜0.05），但兩個(gè)處理組間無(wú)差異（P＞0.05），如類黃酮中的6-羥基-5,7,4’-三甲氧基黃酮。第2種下調(diào)方式是處理組1與CK組的代謝物含量間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但處理組2的代謝物含量較CK組顯著下降（P＜0.05），主要有酚酸類的3,4-二甲氧基肉桂酸、阿魏酰蘋果酸以及脂質(zhì)中的順-10-十七碳烯酸。第3種下調(diào)方式是處理組1的含量低于CK組，而當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間進(jìn)一步增加時(shí)（處理組2），代謝物含量進(jìn)一步下降，且與CK組比顯著下降（P＜0.05），包括酚酸類的呋喃果糖基-α-D-(3-芥子?；?葡萄糖苷和屬于氨基酸及其衍生物的L-谷氨酰胺-O-葡萄糖苷。

總體而言，HVEF處理后的差異代謝物主要為類黃酮、有機(jī)酸、生物堿、脂質(zhì)和萜類等。其中類黃酮作為植物中一類重要的多酚類次生代謝物質(zhì)，不僅能夠影響果實(shí)的色澤和風(fēng)味，還在抗癌、降血脂、抗病毒、抗糖尿病等方面也有重要作用[27-28]；而番茄堿有助于增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，并具有抗腫瘤的潛在功效[29-30]；此外，有機(jī)酸和酚酸類物質(zhì)與果實(shí)甜酸風(fēng)味密切相關(guān)[31]。由于HVEF處理后櫻桃番茄中部分類黃酮和番茄堿物質(zhì)含量上升且一些酚酸類物質(zhì)含量下降，說(shuō)明HVEF處理具有改善櫻桃番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的作用。

2.3.5 差異代謝物KEGG分類和代謝物富集分析結(jié)果

將不同代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，查看有關(guān)途徑的信息。差異顯著代謝物KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類。處理組1與CK組的不同代謝物富集結(jié)果表明，所有代謝產(chǎn)物都映射為“代謝”（圖12）。進(jìn)一步進(jìn)行KEGG途徑富集分析，以確定處理組1與CK組之間代謝途徑的差異。富集分析結(jié)果顯示，“類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）”的代謝物在兩個(gè)組之間具有顯著差異（P＜0.05）（圖13）。然后對(duì)“類黃酮生物合成”途徑上的代謝物進(jìn)行分析，如圖14所示。與CK組相比，處理組1的櫻桃苷（prunin）、查耳酮2’-O-葡萄糖苷（chalcone 2’-O-glucoside）、二氫槲皮素（dihydroquercetin）在類黃酮生物合成通路中代謝旺盛。對(duì)處理組2與CK組進(jìn)行代謝物富集，但不同代謝物無(wú)法富集到代謝通路，這可能是由于差異代謝物沒(méi)有對(duì)應(yīng)的KEGG通路。

圖12 差異代謝物KEGG分類（處理組1與CK組對(duì)比分析）Fig. 12 KEGG classification of differential metabolites (comparison between treatment group 1 and control group)

圖13 差異代謝物富集分析Fig. 13 Enrichment analysis of differential metabolites

圖14 類黃酮生物合成代謝通路（處理組1與CK組對(duì)比分析）Fig. 14 Metabolic pathways of flavonoid biosynthesis (comparison between treatment group 1 and control group)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了HVEF處理技術(shù)對(duì)櫻桃番茄采后腐爛率、大腸桿菌菌落總數(shù)、相關(guān)生理指標(biāo)以及代謝物含量的影響。結(jié)果表明，不同電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間的HVEF處理均能顯著降低果實(shí)表面的大腸桿菌菌落總數(shù)，但各處理組間無(wú)顯著差異。同時(shí)，HVEF處理能降低櫻桃番茄果實(shí)采后貯藏期間的腐爛率，且增大電場(chǎng)強(qiáng)度和延長(zhǎng)處理時(shí)間能夠在貯藏后期進(jìn)一步降低果實(shí)腐爛率。生理生化指標(biāo)分析結(jié)果表明，HVEF處理能夠減少果實(shí)采后貯藏早期的乙烯釋放量，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)該影響會(huì)逐漸減弱；同時(shí)，HVEF處理對(duì)貯藏過(guò)程中果實(shí)的質(zhì)量損失率和呼吸速率影響較小。對(duì)HVEF處理后的果實(shí)樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析、PCA和聚類分析，結(jié)果表明不同HVEF處理的櫻桃番茄存在代謝產(chǎn)物譜差異，篩選結(jié)果顯示差異代謝物主要為黃酮類、有機(jī)酸、生物堿、脂質(zhì)和萜類，其中類黃酮、生物堿等物質(zhì)含量升高，酚酸類含量下降，說(shuō)明HVEF處理能夠有助于改善櫻桃番茄果實(shí)的采后品質(zhì)；類黃酮生物合成代謝通路的分析表明，處理組1與CK組之間部分代謝物具有顯著差異（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為櫻桃番茄采后殺菌保鮮和品質(zhì)改善提供技術(shù)參考。同時(shí)，有關(guān)HVEF處理對(duì)櫻桃番茄果實(shí)的殺菌機(jī)制和代謝通路的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。