黃雪薇，雷嗣超，涂 芬，謝辰陽(yáng)，李 杰，楊 芳,2,3,*

（1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢工程大學(xué) 綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205；3.武漢工程大學(xué) 新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205）

肥胖和超重會(huì)引發(fā)各種慢性疾病[1]，其中最常見(jiàn)的慢性疾病包括高血壓、心血管疾病以及糖尿病[2]，嚴(yán)重影響人體的健康。胰脂肪酶（pancreatic lipase，PL）作為人體腸道內(nèi)的關(guān)鍵酶，可催化食物中攝入的大部分脂肪水解成甘油和脂肪酸[3]，利用胰脂肪酶抑制劑抑制其活力可有效減少人體對(duì)脂肪的吸收[4]，達(dá)到控制和預(yù)防肥胖及超重引發(fā)慢性疾病的目的。目前，臨床上使用最廣泛的胰脂肪酶抑制劑為奧利司他[5]，但患者服用后會(huì)產(chǎn)生腹瀉、脹氣、脂肪性大便等副作用[6]。因此，從低毒性、來(lái)源廣泛的植物中提取胰脂肪酶抑制劑成為目前的研究熱點(diǎn)[7]。黃酮類化合物具有抗氧化[8]、抗病毒[9]、抗炎[10]、抗血管舒張等活性[11-12]，研究表明，板栗殼中含有大量的黃酮類化合物[13]，其降脂減肥的機(jī)理鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以野生板栗殼為原料，提取板栗殼黃酮，并結(jié)合超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（quadrupole/electrostatic field orbitrap mass spectrometry，Q-Orbitrap MS）[14]對(duì)提取得到的板栗殼黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和組成分析，并且研究其在不同條件下對(duì)胰脂肪酶活力的影響及其對(duì)胰脂肪酶的抑制特性，為進(jìn)一步將板栗殼黃酮開(kāi)發(fā)為預(yù)防和抑制肥胖的功能因子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生板栗采摘于山東省沂蒙山，采摘時(shí)間為2020年9月；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙醇（色譜純）、對(duì)硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，PNPP）（分析純）、Triton X-100（分析純）、硝酸鋁九水合物（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、0.22 μm濾膜 上海麥克林生化科技有限公司；對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）（分析純）、牛胰腺胰脂肪酶、N,N-二甲基甲酰胺（生物技術(shù)級(jí)）、二甲基亞砜（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鈉（分析純） 鄭州派尼化學(xué)試劑廠；AB-8型大孔吸附樹脂 北京索萊寶科技有限公司；奧利司他膠囊 山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；THZ-100型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 武漢志?？萍加邢薰荆粚游鲋é?.6 cm×50 cm）、HL-2型恒流泵、HD-3型紫外檢測(cè)儀、BSZ-100型自動(dòng)部份收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-1800PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海翱藝儀器有限公司；LGJ-10普通實(shí)驗(yàn)型真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Q-Exactive型Q-Orbitrap MS儀、Hypersil GOLD C18型色譜柱 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Ultimate 3000型UPLC儀 美國(guó)Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗殼黃酮的提取與純化

醇提取法：按照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的板栗殼黃酮提取工藝，將板栗殼去雜、洗凈、烘干并粉碎，過(guò)20 目篩，按料液比1∶15（板栗殼粉末與70%的乙醇溶液），置于恒溫培養(yǎng)搖床中，55 ℃恒溫振蕩提取90 min，冷卻后真空抽濾并于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再冷凍干燥即得板栗殼黃酮粗提物凍干粉。

純化：取0.5 g板栗殼黃酮凍干粉，用蒸餾水溶解配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL，真空抽濾后過(guò)AB-8大孔樹脂層析柱[15]，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，將洗脫液收集后再次旋蒸、凍干，得到純化后的板栗殼黃酮粉末，低溫保存，備用。

1.3.2 板栗殼黃酮含量和提取得率的測(cè)定

采用分光光度計(jì)法[16]測(cè)定提取物中的總黃酮含量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的母液。分別吸取母液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL及3.5 mL于10 mL具塞比色管中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液補(bǔ)充至5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉溶液0.30 mL并放置6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液0.30 mL，并搖勻靜置6 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氫氧化鈉溶液4.00 mL，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液補(bǔ)充至10 mL，靜置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y＝11.54x-0.093 1，R2＝0.999 4。

板栗殼黃酮中總黃酮含量的測(cè)定：稱取0.01 g板栗殼黃酮凍干粉，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的板栗殼黃酮溶液，吸取2.00 mL于10 mL具塞比色管中，按上述方法測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處吸光度，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線即得板栗殼黃酮溶液中總黃酮質(zhì)量濃度。按式（1）計(jì)算黃酮含量，按式（2）計(jì)算板栗殼黃酮提取得率。

式中：ρ為代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的板栗殼黃酮溶液總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為待測(cè)樣品溶液的體積/mL；m為稱取的板栗殼黃酮凍干粉的質(zhì)量/g；n1為板栗殼黃酮凍干粉到測(cè)定樣品的稀釋倍數(shù)。

式中：ρ為代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的板栗殼黃酮溶液中總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為待測(cè)樣品溶液的體積/mL；m為板栗殼的質(zhì)量/g；n2為1.3.1節(jié)總板栗殼質(zhì)量到測(cè)定樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 板栗殼黃酮結(jié)構(gòu)分析

樣品溶液制備：稱取1.3.1節(jié)中純化后的板栗殼黃酮凍干粉末0.10 g，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液溶解并定容至100 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用。

色譜條件：使用Ultimate 3000型UPLC（配有Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm））對(duì)板栗殼黃酮類化合物進(jìn)行分離[17]，色譜柱溫度35 ℃，樣品盤溫度5 ℃，在進(jìn)樣前后，用200 μL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液洗滌自動(dòng)進(jìn)樣器，洗滌2 次；液相流動(dòng)相：A相乙腈，B相體積分?jǐn)?shù)0.1%甲醇溶液，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.4 mL/min；梯度洗脫：0～5 min，A：15%～50%，B：85%～50%；5～25 min，A：50%～95%，B：50%～5%；25～30 min，A：95%～5%，B：5%～95%；30～50 min，A：5%～95%，B：95%～5%。

質(zhì)譜條件：使用Q-Orbitrap MS儀對(duì)板栗殼黃酮進(jìn)行分析。質(zhì)譜分析條件[18-19]：離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子掃描，電壓-3 kV；一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)置為RP＝70 000、m/z200；二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)置為35 000，m/z200；電探頭蒸發(fā)器溫度350 ℃；掃描質(zhì)量為m/z100～1 000；MS1阱填充時(shí)間為250 ms，自動(dòng)增益控制設(shè)置為1 000 000；MS2阱填充時(shí)間設(shè)置為120 ms，自動(dòng)增益控制設(shè)置為200 000；標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量25 eV，階梯能量設(shè)置為40%；根據(jù)MS1的離子強(qiáng)度，進(jìn)行MS1-MS2的切換。

1.3.4 胰脂肪酶活力的測(cè)定

參考王遠(yuǎn)等[20]的方法繪制PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取0.07 g PNP用磷酸緩沖液（0.20 mol/L、pH 7.4，下同）溶解并定容至100 mL，配制成濃度為5 mmol/L的母液，分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mL于10 mL具塞比色管中，補(bǔ)加磷酸緩沖液稀釋成0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mmol/L的PNP溶液，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以PNP濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y＝11.268x+0.006 4，R2＝0.999 7。

胰脂肪酶活力的測(cè)定參照Mcdougall等[21]報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。稱取0.10 g胰脂肪酶，用磷酸緩沖液定容至50 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清液，得到2 mg/mL的胰脂肪酶液母液；吸取131.09 μL PNPP溶解于0.25 mLN,N-二甲基甲酰胺，用磷酸緩沖液定容至100 mL，加Triton X-100 25 滴，即得11.2 mmol/L的PNPP溶液（底物溶液）；取胰脂肪酶液2 mL于10 mL具塞比色管中，加入4 mL磷酸緩沖液，37 ℃保溫10 min后，加入2 mL底物溶液，于水浴鍋中37 ℃避光反應(yīng)20 min后，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。代入PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線即得胰脂肪酶催化底物產(chǎn)生的PNP濃度。胰脂肪酶活力的計(jì)算如公式（3）所示，37 ℃下保溫10 min，以每分鐘內(nèi)催化底物產(chǎn)生1 μmol PNP定義為1 個(gè)胰脂肪酶活力單位（U）。

式中：n為稀釋倍數(shù)；V為待測(cè)樣品溶液的體積/mL；c為代入PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的PNP濃度/（mmol/L）；t為反應(yīng)時(shí)間/min；0.004為反應(yīng)體系中胰脂肪酶的質(zhì)量/g。

1.3.5 不同反應(yīng)條件下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力影響的測(cè)定

1.3.5.1 不同濃度的板栗殼黃酮下胰脂肪酶活力的測(cè)定

稱取0.02 g板栗殼黃酮凍干粉，用磷酸緩沖液定容至20 mL，即得1.00 mg/mL板栗殼黃酮溶液；稱取奧利司他粉末，用少量二甲基亞砜溶解，加磷酸緩沖液水浴加熱配制成20 mL 1.00 mg/mL奧利司他溶液。將板栗殼黃酮溶液、奧利司他用磷酸緩沖液分別稀釋為0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/mL得到不同質(zhì)量濃度的抑制劑溶液。按照1.3.4節(jié)方法，在各反應(yīng)體系中加入0.50 mL抑制劑溶液，在pH 7.4、37 ℃下避光反應(yīng)20 min后，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按式（4）計(jì)算胰脂肪酶活力抑制率。

式中：A1為不加抑制劑反應(yīng)體系的吸光度；A2為加入抑制劑反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.5.2 不同pH值下胰脂肪酶活力的測(cè)定

按1.3.5.1節(jié)方法，在各反應(yīng)體系中加入1.00 mg/mL板栗殼黃酮溶液0.50 mL即為實(shí)驗(yàn)組；在各反應(yīng)體系中加入0.50 mL磷酸緩沖液即為空白組。將空白組和實(shí)驗(yàn)組各體系在溫度為37 ℃，pH值分別為6.8、7.1、7.4、7.7、8.0條件下反應(yīng)20 min，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算胰脂肪酶活力抑制率。

1.3.5.3 不同反應(yīng)溫度下胰脂肪酶活力的測(cè)定

按1.3.5.1節(jié)方法，在各反應(yīng)體系中加入1.00 mg/mL 0.50 mL板栗殼黃酮溶液即為實(shí)驗(yàn)組；在各反應(yīng)體系中加入0.50 mL磷酸緩沖液即為空白組。將空白組和實(shí)驗(yàn)組各體系在pH值為7.4，溫度分別為30、33、37、40、43 ℃條件下反應(yīng)20 min，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算胰脂肪酶活力抑制率。

1.3.5.4 不同反應(yīng)時(shí)間下胰脂肪酶活力的測(cè)定

按1.3.5.1節(jié)方法，在各反應(yīng)體系中加入0.50 mL 1.00 mg/mL板栗殼黃酮溶液即為實(shí)驗(yàn)組；在各反應(yīng)體系中加入0.50 mL磷酸緩沖液即為空白組。將空白組和實(shí)驗(yàn)組各體系在pH 7.4、37 ℃條件下分別反應(yīng)10、15、20、25 min及30 min，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算抑制率。

1.3.6 抑制作用類型的測(cè)定

固定酶質(zhì)量濃度為0.67 mg/mL，測(cè)定不同質(zhì)量濃度板栗殼黃酮（0、0.5、1 mg/mL）在不同底物濃度（0.93、1.87、2.80、3.73 mmol/L）條件下的反應(yīng)速率。取胰脂肪酶液2 mL于10 mL具塞比色管中，加入0.50 mL抑制劑溶液，補(bǔ)加磷酸緩沖液至6 mL，37 ℃保溫10 min后，加入2 mL底物溶液，每分鐘測(cè)量一次405 nm波長(zhǎng)處的吸光度，測(cè)量總時(shí)長(zhǎng)20 min，按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[22]，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，繪制雙倒數(shù)曲線圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均為3 組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值得到；采用Origin Pro 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗殼黃酮的提取得率和含量

采用醇提法，將提取得到的樣品經(jīng)AB-8樹脂純化得到板栗殼黃酮提取物，經(jīng)計(jì)算，板栗殼黃酮提取得率為（5.66±0.05）%，其含量為（107.50±1.00）mg/g。可用于后續(xù)結(jié)構(gòu)分析及胰脂肪酶抑制活性研究。

2.2 板栗殼黃酮結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

板栗殼黃酮總離子流圖如圖1所示。結(jié)合高分辨質(zhì)譜信息和相關(guān)研究結(jié)果[23-28]，本研究共鑒定出9 種酚類化合物，其中8 種屬于黃酮類化合物，具體分析如下。

圖1 板栗殼黃酮的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of flavonoids from chestnut shells

由圖1、表1可知，當(dāng)保留時(shí)間為17.7、26.8 min時(shí)，1、7號(hào)峰分子離子峰m/z577，可確定化合物1、7的相對(duì)分子質(zhì)量為678，二級(jí)質(zhì)譜峰為m/z425、289、451、407[23]。B型原花青素二聚體是2 個(gè)原花青素單體通過(guò)C4—C8或C4—C6相連并在C2和C7或者C2和C5之間形成C—O—C鍵的化合物，在ESI-模式下失去一個(gè)氫原子得到m/z578，以m/z578為母體離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)分離，主要的裂解碎片離子為m/z289、407、425、451，可鑒定該物質(zhì)為B型原花青素二聚體[24]。m/z289為QM cleavage分子間斷裂失去1 個(gè)聚合單元（兒茶素或表兒茶素）得到；m/z407是分子離子先發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)，再失去一分子H2O得到；m/z425則由分子離子發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)得到；m/z451是由分子離子發(fā)生雜環(huán)裂變反應(yīng)失去間苯三酚得到；m/z578分子離子失去一分子水得到m/z560。

表1 板栗殼黃酮結(jié)構(gòu)分析鑒定結(jié)果Table 1 Structural identification and analysis of flavonoids from chestnut shells

當(dāng)保留時(shí)間為19.2 min時(shí)，3號(hào)峰分子離子峰m/z865可確定化合物3的相對(duì)分子質(zhì)量為866，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰m/z695、577、575、289、287，可知為B型兒茶素三聚物[25]。

當(dāng)保留時(shí)間為21.1 min時(shí)，4號(hào)峰分子離子峰m/z289，可確定化合物4的相對(duì)分子質(zhì)量為290，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰為m/z245、205、179，與參考文獻(xiàn)[25]中m/z245.14、205.22、179.26的結(jié)果一致，因此可鑒定此化合物為表兒茶素。

當(dāng)保留時(shí)間為21.6 min時(shí)，5號(hào)峰分子離子峰m/z635可確定化合物5的相對(duì)分子質(zhì)量為636，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰m/z465，章麗等[26]的報(bào)道，可進(jìn)一步推斷此化合物為三沒(méi)食子酰葡萄糖。

當(dāng)保留時(shí)間為28.5、31.6、37.9 min時(shí)，8、10、13號(hào)峰分子離子峰m/z575，可確定化合物8、10、13的相對(duì)分子質(zhì)量為576，A型原花青素二聚體是2 個(gè)原花青素單體通過(guò)C4—C8或C4—C6相連并在C2和C7或者C2和C5之間形成C—O—C鍵的化合物，在ESI-模式下失去一個(gè)氫得到m/z576，以m/z576為母體離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)分離，主要的裂解碎片離子為m/z289、407、423、449、539、557。且因?yàn)锳型原花青素二聚體比相應(yīng)的B型原花青素二聚體在結(jié)構(gòu)上多1 個(gè)C—O—C連接鍵，分子離子少兩個(gè)質(zhì)子，相較于1號(hào)化合物，此化合物為A型原花青素二聚體。

當(dāng)保留時(shí)間為32.3 min時(shí)，11號(hào)峰分子離子峰m/z863，可確定化合物11的相對(duì)分子質(zhì)量為864，與董麗紅[25]報(bào)道的結(jié)果一致，可判斷此化合物為A型原花青素三聚體。

當(dāng)保留時(shí)間為38.6 min時(shí)，14號(hào)峰分子離子峰m/z463，可確定化合物14的相對(duì)分子質(zhì)量為464，與文獻(xiàn)[27]中異槲皮苷的相對(duì)分子質(zhì)量一致，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰m/z301，推測(cè)該化合物為異槲皮苷（槲皮素-3-O-葡萄糖苷），分子離子碎片m/z463失去m/z162的葡萄糖基生成槲皮素苷元（m/z301），由此可知，14號(hào)峰化合物中存在葡萄糖基，且裂解規(guī)律符合異槲皮苷的特點(diǎn)。

當(dāng)保留時(shí)間為41 min時(shí)，15號(hào)峰分子離子峰m/z477可確定化合物15的相對(duì)分子質(zhì)量為478，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰m/z459、357、315、314符合甲基鞣花酸己糖的裂解規(guī)律。

當(dāng)保留時(shí)間為42.6 min時(shí)，17號(hào)峰分子離子峰m/z609，可確定化合物17的相對(duì)分子質(zhì)量為610，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰m/z301、271、179、151，與文獻(xiàn)[28]中報(bào)道蘆丁相對(duì)分子質(zhì)量一致，在二級(jí)質(zhì)譜圖中，分子離子碎片m/z609失去質(zhì)量數(shù)為308的葡萄糖基碎片生成苷元槲皮素碎片m/z301，m/z301分子離子碎片1、2處斷裂轉(zhuǎn)移兩個(gè)氫，失去質(zhì)量數(shù)為122的中性碎片生成m/z179的離子；m/z301分子離子碎片發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)生成m/z151的離子，故可判斷化合物17為蘆丁。

2.3 不同反應(yīng)條件下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的影響

2.3.1 不同質(zhì)量濃度的板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力抑制率的影響

采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定胰脂肪酶活力，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)得待測(cè)樣品吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得胰脂肪酶催化PNPP產(chǎn)生的PNP濃度為48.46 mmol/mL，經(jīng)計(jì)算得胰脂肪酶活力為0.019 4 U。

以?shī)W利司他為陽(yáng)性對(duì)照，研究板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用。由圖2可知，在0～0.062 5 mg/mL范圍內(nèi)，板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制效果明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照奧利司他對(duì)胰脂肪酶的抑制效果，而在較高質(zhì)量濃度0.062 5～0.125 mg/mL范圍內(nèi)，板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制效果逐漸接近奧利司他對(duì)胰脂肪酶的抑制效果，當(dāng)板栗殼黃酮質(zhì)量濃度高于0.062 5 mg/mL時(shí)，抑制效果趨于平緩，說(shuō)明在此質(zhì)量濃度時(shí)，板栗殼黃酮與胰脂肪酶的結(jié)合達(dá)到飽和。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到板栗殼黃酮及奧利司他對(duì)胰脂肪酶的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.074 mg/mL和0.064 mg/mL。由此可知，在0.012 5～0.125 0 mg/mL范圍內(nèi)，板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制率與抑制劑濃度存在劑量效應(yīng)關(guān)系，與相同劑量的陽(yáng)性對(duì)照奧利司他對(duì)胰脂肪酶的抑制率接近。

圖2 抑制劑質(zhì)量濃度對(duì)胰脂肪酶活力抑制率的影響Fig. 2 Effect of inhibitor concentration on pancreatic lipase activity

2.3.2 不同pH值下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

酶的活力與pH值密切相關(guān)，酶在催化反應(yīng)中都有其最適pH值，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)改變酶的結(jié)構(gòu)，使酶喪失活力，因此pH值的改變會(huì)影響酶對(duì)底物的催化作用[29]。由圖3A可知，胰脂肪酶的最適pH值在7.4，這是因?yàn)橐戎久傅牡入婞c(diǎn)為5.0，在PNPP、磷酸緩沖液、N,N-二甲基甲酰胺及Triton X-100形成的pH 7.4的體系中的油-水界面發(fā)生反應(yīng)時(shí)帶負(fù)電荷，與Triton X-100帶負(fù)電的羥基形成的親水端發(fā)生互斥作用，更易與底物接觸發(fā)揮更大活性。加入板栗殼黃酮后胰脂肪酶的最適pH值向堿性條件發(fā)生偏移，變更為7.7，初步推斷板栗殼黃酮的加入使胰脂肪酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化，因而產(chǎn)生最適pH值的微小偏移；在pH 7.4時(shí)，空白組與樣品組的酶活力有顯著性差異（P＜0.05）。由圖3B可知，板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制率最大，為62.23%，與人體小腸部位的pH值（約6.8）相近[30]，說(shuō)明板栗殼黃酮在小腸部位能對(duì)胰脂肪酶發(fā)揮較理想的抑制效果。

圖3 不同pH值下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effect of chestnut shell flavonoids on pancreatic lipase activity at different pHs

2.3.3 不同反應(yīng)溫度下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

溫度對(duì)酶有雙重影響，既可能在最適溫度使酶活力達(dá)到最大，也能在高溫時(shí)使酶失去活力。由圖4可知，未加抑制劑時(shí)，胰脂肪酶活力在30～37 ℃溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐漸升高的狀態(tài)，到達(dá)臨界溫度37 ℃時(shí)，胰脂肪酶活力達(dá)到最高，隨即在37～43 ℃胰脂肪酶活力逐漸降低，因此判斷胰脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，這與人體內(nèi)溫度一致。人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適反應(yīng)溫度在35～40 ℃[31]，如果繼續(xù)升高溫度可能破壞了胰脂肪酶的共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變失去活性；而加入板栗殼黃酮，胰脂肪酶活力在30～43 ℃溫度范圍內(nèi)差異較小，最大差異為0.003 U/g，胰脂肪酶的最適反應(yīng)溫度發(fā)生改變，在高于37 ℃時(shí)更耐受，說(shuō)明板栗殼黃酮的加入影響了胰脂肪酶的空間構(gòu)象，改變了胰脂肪酶的熱穩(wěn)定性。板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制在33 ℃即開(kāi)始發(fā)揮較好的作用，在37 ℃時(shí)，空白組與樣品組的酶活力有顯著性差異（P＜0.05），抑制效果最佳，抑制率為65.20%；抑制效果在37～43 ℃范圍內(nèi)抑制效果逐漸減弱，這與升高溫度破壞胰脂肪酶的共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)有關(guān)。由結(jié)果進(jìn)一步推測(cè)板栗殼黃酮可在體內(nèi)對(duì)胰脂肪酶發(fā)揮理想的抑制效果。

圖4 不同反應(yīng)溫度下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of chestnut shell flavonoids on pancreatic lipase activity at different reaction temperatures

2.3.4 不同反應(yīng)時(shí)間下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

不同反應(yīng)時(shí)間下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用結(jié)果如圖5所示，在10～20 min時(shí)，胰脂肪酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加，在20 min之后活力變化較不明顯，呈現(xiàn)略微下降趨勢(shì)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，PNP的生成趨于穩(wěn)定；加入板栗殼黃酮，胰脂肪酶活力在20 min時(shí)最大，為0.022 U/g，而20 min之后的抑制效果強(qiáng)于20 min之前，證明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，板栗殼黃酮與胰脂肪酶的結(jié)合逐漸增強(qiáng)。反應(yīng)時(shí)間大于20 min時(shí)，樣品組的酶活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），表明板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制效果隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間下板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of chestnut shell flavonoids on pancreatic lipase activity at different reaction times

2.4 板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用類型

如圖6所示，以1/[S]和1/V進(jìn)行雙倒數(shù)作圖，當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量濃度為0.93～3.73 mmol/L時(shí)，改變抑制劑的濃度，直線的斜率發(fā)生改變，在x軸上的截距不變，即加入抑制劑，最大反應(yīng)速率（Vmax）降低，米氏常數(shù)（Km）不變，這是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特性，由此可以看出，板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，根據(jù)圖6計(jì)算可得抑制常數(shù)（Ki）為53.19 mg/mL，0 mg/mL板栗殼黃酮的Vmax為5.19 μmol/（L·min），0.5 mg/mL板栗殼黃酮的Vmax為3.55 μmol/（L·min），1 mg/mL板栗殼黃酮的Vmax為2.03 μmol/（L·min）。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的程度僅取決于抑制劑的濃度，板栗殼黃酮與胰脂肪酶活性中心外的必需基團(tuán)產(chǎn)生結(jié)合，與底物之間不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。因此，底物濃度的增加并不影響抑制劑的抑制效果，這為有效地將板栗殼黃酮開(kāi)發(fā)為胰脂肪酶抑制劑提供了理論依據(jù)。

圖6 板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶作用的雙倒數(shù)曲線圖Fig. 6 Lineweaver-Burk plots of flavonoids from chestnut shells against pancreatic lipase

3 結(jié) 論

用醇提法提取板栗殼黃酮，提取物經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，得到的黃酮含量為（107.50±1.00）mg/g，提取得率為（5.66±0.05）%。通過(guò)UPLC-Q-Orbitrap MS對(duì)提取得到的板栗殼黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，鑒定出9 種酚類化合物，分別為B型原花青素二聚體、B型兒茶素三聚體、兒茶素/表兒茶素、三沒(méi)食子酰葡萄糖、A型原花青素二聚體、A型原花青素三聚體、異槲皮苷、甲基鞣花酸己糖及蘆丁，其中8 種為黃酮類化合物。板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶具有較好的抑制作用，IC50為0.074 mg/mL，在37 ℃、pH 7.4條件下具有較好抑制效果（抑制率為65.20%），證明板栗殼黃酮在小腸部位能對(duì)胰脂肪酶發(fā)揮較理想的抑制作用。板栗殼黃酮改變胰脂肪酶活性部位的基團(tuán)，使其最適pH值向堿性偏移。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法證明板栗殼黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即板栗殼黃酮是與胰脂肪酶活性中心外的必需基團(tuán)產(chǎn)生結(jié)合，與底物之間不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。胰脂肪酶是腸道內(nèi)脂肪水解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，抑制胰脂肪酶活力可減少食物中攝入脂肪的水解和吸收，降低肥胖和超重引發(fā)各種慢性病的風(fēng)險(xiǎn)。