鄧 姣，劉 鑫，鄭 敏,2，周 軍,3，李湘洲,3,*

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南第一師范學(xué)院教育科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410215；3.中南林業(yè)科技大學(xué)天然產(chǎn)物加工利用研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種非黃酮類天然多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、菝葜、桑葚等多種植物組織器官中[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，Res具有保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性[2-4]。但與其他許多天然產(chǎn)物類似，Res是脂溶性成分，其存在穩(wěn)定性差、口服后在人體的生物利用度低等問題，這限制了Res在食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前，國(guó)內(nèi)外利用制劑學(xué)方法將難溶性成分溶解、吸附或包裹于特定材料中而制成口服脂質(zhì)體、固體分散體、聚合物納米粒及微乳等食品或藥品輸送體系，以有效提高其穩(wěn)定性、改善吸收以及增強(qiáng)靶向性等[5-8]。固體分散體是一種以固體形式存在的藥物-載體固體分散系統(tǒng)，能將藥物高度分散于固體載體中。制備固體分散體的常用方法主要有溶劑法、熔融法、噴霧干燥法、靜電紡絲法等[9-10]。近年來靜電紡絲技術(shù)作為一種新興的制備技術(shù)，其制備的固體分散體具有比表面積大、結(jié)構(gòu)可控和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，已在藥物載體、組織工程支架等方面得到較好的應(yīng)用[11]。基材的選擇是影響靜電紡絲制備產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的重要因素之一，天然高分子材料如多糖、環(huán)糊精及其衍生物、蛋白和紫膠等常被用作固體分散體的基材[12-14]。其中，紫膠是紫膠蟲分泌的一種天然低分子聚合物，具有良好的成膜性，兼具熱塑性和熱固性，且天然無毒，是一種極好的固體分散體基材，且近年來紫膠樹脂及其衍生物作為壁材在食品和制藥工業(yè)中受到越來越多的關(guān)注[15]。

本實(shí)驗(yàn)以氨水改性的紫膠樹脂銨鹽（shellac resin ammonium salt，SRAS）為單一基材用于包埋Res，通過靜電紡絲技術(shù)制備白藜蘆醇/紫膠樹脂銨鹽（Res/SRAS）固體分散體，以提高Res的熱穩(wěn)定性和生物活性，促進(jìn)其在模擬腸液中的釋放，為Res功能產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Res（純度98%） 湖南健源生物有限公司；紫膠市售；乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵以及無水乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；MD34透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 Da）美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-1集熱式磁力攪拌器 常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠；SCIENTZ-18N冷凍干燥儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；NANON-01A靜電紡絲機(jī) 日本MECC公司；Alpha紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；sigma 300場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司公司；Ultimate IV型X射線衍射儀 日本Rigaku公司；DSC-TA Q200差示掃描量熱儀 美國(guó)PerkinElmer公司；RC-3溶出度測(cè)試儀天津市光學(xué)儀器廠；UV23II紫外分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS醫(yī)用離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司；AUY120分析天平 日本島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī) 昆山美美超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SRAS的制備

利用氨水對(duì)紫膠進(jìn)行改性制備SRAS[16]。精確稱取10 g粉碎并過40 目篩的紫膠，加入至200 mL 0.1 mol/L NH3·H2O溶液中，于40 ℃下恒溫磁力攪拌反應(yīng)1 h，所得反應(yīng)溶液靜置，取上層清液裝入表面皿，凍干得SRAS，經(jīng)稱質(zhì)量并計(jì)算得到SRAS的得率為97.73%。

1.3.2 靜電紡絲制備Res固體分散體

在前期研究[17]的基礎(chǔ)上制備Res/SRAS固體分散體，稱取0.222 g Res分散于含2.0 g SRAS的10 mL無水乙醇溶液中。45 ℃恒溫水浴磁力攪拌1 h，冷卻至室溫，得到Res/SRAS前驅(qū)液，靜電紡絲前將前驅(qū)液超聲處理60 s，排出氣泡。靜電紡絲參數(shù)為電壓29 kV、泵送流速0.2 mL/h、鋼針尖端到收集器的距離15.5 cm、針頭清洗頻率50 s/次，固體分散體通過鋁箔錫紙收集，得到粉末狀Res/SRAS固體分散體。

1.3.3 Res標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.3.1 Res-乙酸乙酯溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取Res標(biāo)準(zhǔn)品30 mg于50 mL棕色容量瓶，用乙酸乙酯溶解并定容。吸取上述Res-乙酸乙酯溶液1 mL于100 mL棕色容量瓶并用乙酸乙酯定容。分別量取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL上述Res-乙酸乙酯溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容。以乙酸乙酯溶液作參比，在305 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各質(zhì)量濃度（1.2～6.0 μg/mL）溶液的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝141.5x+0.004 7，R2＝0.999 6。

1.3.3.2 Res-磷酸鹽緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

精確稱取Res標(biāo)準(zhǔn)品8.5 mg，用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）定容至500 mL得到Res標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL Res標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用PBS定容。以PBS作參比，在305 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各質(zhì)量濃度（0.085～17 μg/mL）溶液的吸光度。分別得到pH 1.0條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝100.72x+0.025，R2＝0.999 3；pH 6.8條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝103.01x+0.018 9，R2＝0.999 1。

1.3.4 Res/SRAS中Res包埋率、負(fù)載率的測(cè)定

精確稱取一定量的固體分散體，用乙酸乙酯反復(fù)淋洗3 遍，過濾，濾液定容，用紫外分光光度計(jì)在305 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)1.3.3.1節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算表面未包裹的Res的質(zhì)量，并分別按公式（1）和（2）計(jì)算Res的包埋率和負(fù)載率。

式中：m為固體分散體的質(zhì)量/mg；m0為Res的加入量/mg；m1為未包裹的Res的質(zhì)量/mg。

1.3.5 Res/SRAS的微觀形貌觀察

分別取適量的Res標(biāo)準(zhǔn)品、空白SRAS固體分散體和Res/SRAS固體分散體，黏在有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，利用真空鍍膜機(jī)噴金，再用掃描電子顯微鏡（電壓10 kV）觀察固體分散體表觀形貌，分析制備前后樣品微觀形貌的變化。

1.3.6 Res/SRAS的復(fù)溶性分析

稱取一定量的Res/SRAS固體分散體于樣品瓶中，分別加入50 倍和100 倍質(zhì)量的水，超聲60 s，靜置后觀察樣品的復(fù)溶效果。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將Res、空白SRAS固體分散體、Res/SRAS及其物理混合物分別與干燥的KBr進(jìn)行混合，研磨、壓片。用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描頻率64 Hz，掃描32 次，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.3.8 差示掃描量熱分析

分別取10 mg的Res、空白SRAS固體分散體、Res/SRAS及二者物理混合物至鋁制小坩堝中，封壓后放入差示掃描量熱儀。測(cè)定溫度范圍25～350 ℃，升溫速率為10 ℃/min。以液氮為降溫介質(zhì)，加熱過程中均以高純N2為吹掃和保護(hù)氣體。

1.3.9 X射線衍射分析

分別將純Res、空白SRAS固體分散體、Res/SRAS及其物理混合物（Res與SRAS質(zhì)量比1∶10）進(jìn)行X射線衍射分析。分析條件：銅靶、石墨單色器、工作電流40 mA、電壓40 kV、波長(zhǎng)1.541 8 ?、掃描范圍（2θ）5°～90°、掃描速率10（°）/min。

1.3.10 體外釋放實(shí)驗(yàn)

分別稱取5 mg純Res和50 mg Res/SRAS置于已預(yù)處理的MD34透析袋中，加入少量釋放介質(zhì)（pH 1的模擬胃液和pH 6.8的模擬腸液）后封閉，置于溶出儀中，轉(zhuǎn)速為（50±2）r/min，溫度為（37.0±0.5）℃，分別以400 mL pH 1的模擬胃液和pH 6.8的模擬腸液為釋放介質(zhì)，釋放10 h。在預(yù)定的時(shí)間間隔（2 h）內(nèi)取釋放介質(zhì)5 mL，并立即補(bǔ)充等量新鮮釋放介質(zhì)。用紫外分光光度計(jì)在305 nm波長(zhǎng)處測(cè)定所取樣液的吸光度，根據(jù)1.3.3.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和公式（3）分別計(jì)算釋放量和累積釋放率。

式中：Xt為第t次累積釋放率/%；V0為每次取樣的體積（5 mL）；Ve為釋放介質(zhì)的總體積（400 mL）；ρt和ρt-1分別為第t次和第t-1次取出的緩釋介質(zhì)中Res的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；m為固體分散體中Res的質(zhì)量/g。

1.3.11 體外抗氧化活性分析

1.3.11.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

配制79 mg/L的DPPH-乙醇溶液，低溫下避光保存?zhèn)溆?。分別取Res和Res/SRAS溶于乙醇中，使兩者的Res質(zhì)量濃度均為80、160、240、320、400 μg/mL。分別取0.5 mL不同質(zhì)量濃度的Res和Res/SRAS乙醇溶液，加入5.0 mL的DPPH-乙醇溶液混合均勻，37 ℃下反應(yīng)1 h，以無水乙醇為空白，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按公式（4）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.11.2 還原力的測(cè)定

取樣品10 mg溶于水，分別配成質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的溶液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.5 mL，加入pH 6.6、0.2 mol/L PBS 2.5 mL和1 g/100 mL K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，混勻后于50 ℃水浴20 min，迅速冷卻，然后加入10 g/100 mL三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液混合，常溫下繼續(xù)反應(yīng)10 min，以相應(yīng)蒸餾水為空白，在波長(zhǎng)為700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度表示還原能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡觀察與物理性能分析結(jié)果

對(duì)純Res、空白SRAS固體分散體、Res/SRAS的形貌進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，并用Nano measure軟件對(duì)其粒徑分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖1。Res的形貌大多為細(xì)長(zhǎng)的無規(guī)則晶體結(jié)構(gòu)，其平均粒徑為（3 034.06±584.71）nm?？瞻譙RAS固體分散體的形狀為凹陷的球狀，且表面有許多突起，其平均粒徑為（1 547.09±129.01）nm。研究表明，SRAS表面存在許多不平滑凸起，這與紫膠本身的性質(zhì)有關(guān)[18]。Res/SRAS為表面較光滑的球狀結(jié)構(gòu)，顆粒大小較均一，其平均粒徑為（843.75±162.99）nm，達(dá)到納米級(jí)。

圖1 掃描電子顯微鏡分析結(jié)果Fig. 1 Results of SEM analysis

靜電紡絲技術(shù)制備的Res/SRAS固體分散體中Res包埋率為79.06%，負(fù)載率為7.91%，與前期研究中利用噴霧干燥技術(shù)制備的Res/SRAS微膠囊[17]的包埋效果類似，但Res/SRAS固體分散體形貌更易于控制，且粒徑明顯減小。SRAS本身具有較好的成膜性[19]，能有效包裹Res，形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的Res固體分散體。

2.2 復(fù)溶性分析結(jié)果

固體分散體復(fù)溶后的穩(wěn)定性是衡量載藥性能的重要指標(biāo)之一[20]。根據(jù)1.3.6節(jié)所述方法對(duì)Res/SRAS進(jìn)行50 倍和100 倍質(zhì)量水的復(fù)溶，結(jié)果見圖2。利用靜電紡絲技術(shù)制備的Res/SRAS固體分散體為均勻的棕色粉末。Res/SRAS在水中以不同質(zhì)量比復(fù)溶后均能形成穩(wěn)定的混懸液，未出現(xiàn)沉淀或分層現(xiàn)象，表明SRAS對(duì)Res具有較好的包埋效果。

圖2 Res/SRAS及在水中的復(fù)溶效果Fig. 2 Res/SRAS and its dilutions in water

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)可以對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。由圖3可知，Res在1 585、1 515、1 453 cm-1處為苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰，在962 cm-1處為反式—C＝C—振動(dòng)吸收峰，在675、614、515 cm-1處為＝C—H反式雙振動(dòng)吸收峰[21]?？瞻譙RAS固體分散體中，在1 559 cm-1附近出現(xiàn)了中等強(qiáng)度的吸收峰，是R—COOH—離子鍵與溶液中游離的NH4+形成SRAS所引起，1 383 cm-1為酰胺基振動(dòng)吸收峰，表明氨水對(duì)紫膠樹脂改性成功[16]。與空白SRAS相比，Res/SRAS不僅具有空白SRAS固體分散體的特征吸收峰，還出現(xiàn)了Res的苯環(huán)特征吸收峰以及指紋圖譜區(qū)962、614、515 cm-1處特征吸收峰，且未出現(xiàn)新的特征吸收峰，表明靜電紡絲制備Res/SRAS過程是物理包埋。而物理混合物的紅外吸收峰是由SRAS與Res各自吸收峰的疊加形成的。綜上可知，靜電紡絲處理使SRAS對(duì)Res進(jìn)行了有效的物理包埋，形成了穩(wěn)定的Res/SRAS固體分散體。

圖3 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果Fig. 3 Results of FT-IR analysis

2.4 差示掃描量熱分析結(jié)果

利用差示掃描量熱法可以測(cè)定藥物在載體中的分散狀態(tài)以及載體的熱穩(wěn)定性。由圖4可知，純Res在269.8 ℃附近呈現(xiàn)出尖銳的吸熱峰，這與Res本身的熱分解溫度相對(duì)應(yīng)[22]?？瞻譙RAS固體分散體在50～200 ℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出較寬的弱吸熱峰，呈現(xiàn)一個(gè)平緩的狀態(tài)，沒有明顯的強(qiáng)吸熱峰存在，這與陳奇[16]、李凱[23]等的研究結(jié)果相似，而Res/SRAS則沒有出現(xiàn)明顯的吸熱峰，表明基材SRAS包裹Res后，Res在固體分散體中以非晶體形式存在，同時(shí)形成的Res/SRAS固體分散體的熱力學(xué)穩(wěn)定性明顯提高。

圖4 差示掃描量熱分析結(jié)果Fig. 4 Results of DSC analysis

2.5 X射線衍射分析結(jié)果

X射線衍射可用于對(duì)化合物的物相和結(jié)晶度進(jìn)行定性分析。由圖5可知，純Res在6.5°、13.1°、16.2°、19.1°、22.2°、23.6、25.3°和28.4°處呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的衍射特征峰，表明Res以結(jié)晶態(tài)的形式存在。空白SRAS固體分散體在21.1°處有較較強(qiáng)的衍射峰，此為SRAS的特征衍射峰；在18°處有較平緩的衍射峰，表現(xiàn)出明顯的非晶體彌散衍射特征，表明空白SRAS固體分散體為非晶體、無定形結(jié)構(gòu)[24]。Res/SRAS在18°處的平緩衍射峰也表現(xiàn)出較為明顯的非晶體彌散衍射特征，而Res結(jié)晶型的衍射峰消失，表明形成的Res/SRAS固體分散體中Res以無定形的結(jié)構(gòu)存在。與Res/SRAS相比，物理混合物中Res和SRAS的特征衍射峰均有出現(xiàn)。綜上，X射線衍射結(jié)果表明Res有效包埋于SRAS中。

圖5 X射線衍射分析結(jié)果Fig. 5 Results of XRD analysis

2.6 體外釋放分析結(jié)果

功能食品或藥物輸送體系被人體攝入后主要經(jīng)過口腔、胃，再到小腸，經(jīng)吸收后進(jìn)入人體的血液循環(huán)中，整個(gè)過程大約需要3～16 h[18]。理想的功能食品或藥物輸送體系應(yīng)能夠在胃部強(qiáng)酸性環(huán)境下保持相對(duì)穩(wěn)定，而進(jìn)入腸道環(huán)境后能在較短時(shí)間內(nèi)充分釋放出功能因子，以達(dá)到提高功能因子在腸道內(nèi)吸收的目的[25]。

由圖6可知，在模擬胃液環(huán)境下，純Res與Res/SRAS的釋放規(guī)律基本一致，但Res/SRAS的釋放量少于純Res，10 h內(nèi)Res、Res/SRAS累積釋放率分別為54.95%和51.10%，表明Res/SRAS在模擬胃液環(huán)境下具有一定的緩釋作用。

圖6 Res和Res/SRAS在模擬胃液條件下的累積釋放效果Fig. 6 Cumulative release of Res and Res/SRAS under simulated gastric fluid conditions

由圖7可知，在模擬腸液環(huán)境下，Res/SRAS的釋放量明顯高于純Res，10 h內(nèi)Res、Res/SRAS的累積釋放率分別為53.24%、65.79%。表明純Res在模擬胃液和模擬腸液中不敏感，而Res/SRAS具有一定的腸溶特性，這可能是常用于腸溶藥物包衣材料的紫膠及其銨鹽本身具有一定的腸溶特性所致[15]；另一方面，靜電紡絲技術(shù)制備的Res/SRAS的粒徑較小，表面積的增大進(jìn)一步促進(jìn)了Res的釋放[26]。

圖7 Res和Res/SRAS在模擬腸液條件下的累積釋放效果Fig. 7 Cumulative release of Res and Res/SRAS under simulated intestinal fluid conditions

2.7 體外抗氧化活性分析結(jié)果

由圖8可知，純Res和Res/SRAS對(duì)DPPH自由基的清除率均隨質(zhì)量濃度的增加而增大，呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)計(jì)算可得純Res清除DPPH自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為165.71 μg/mL，而Res/SRAS清除DPPH自由基的IC50為180.88 μg/mL，表明純Res與Res/SRAS的體外抗氧化能力基本一致。

圖8 Res和Res/SRAS對(duì)DPPH自由基清除效果Fig. 8 DPPH radical scavenging effect of Res and Res/SRAS

由圖9可知，純Res和Res/SRAS的吸光度隨質(zhì)量濃度的增加而增大，呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。相同Res質(zhì)量濃度下，Res/SRAS對(duì)Fe3+的還原能力高于純Res。

圖9 Res和Res/SRAS的還原能力Fig. 9 Reducing power of Res and Res/SRAS

相對(duì)于游離態(tài)的Res，經(jīng)靜電紡絲制備的Res/SRAS對(duì)DPPH自由基清除能力沒有明顯減弱，而對(duì)Fe3+還原能力增強(qiáng)，表明抗氧化能力更強(qiáng)，這可能是反應(yīng)介質(zhì)中的Res在固體分散體具有較大的表面積所致[27]。表明利用靜電紡絲法制備的Res/SRAS固體分散體具有良好的體外抗氧化活性。與之前研究的利用噴霧干燥法制備的Res/SRAS微膠囊相比，以SRAS為單一基材，利用靜電紡絲制備的Res/SRAS固體分散體包埋效果相當(dāng)，而粒徑更小、性質(zhì)更穩(wěn)定、體外累積釋放率更高，且抗氧化效果更好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以SRAS為壁材，用靜電紡絲制備了Res/SRAS固體分散體，Res的包埋率、負(fù)載率分別為79.06%、7.91%。Res/SRAS固體分散體的粒徑為（843.75±162.99）nm，微觀形貌呈現(xiàn)為表面較光滑的球體結(jié)構(gòu)。傅里葉變換紅外光譜、差示掃描量熱和X射線衍射分析結(jié)果表明Res成功地包裹于SRAS中，并以非晶形式存在，熱力學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定。體外抗氧化研究表明Res/SRAS固體分散體的抗氧化能力高于未包埋前的Res。Res/SRAS固體分散體在模擬胃液環(huán)境下保持緩釋，而在模擬腸液中可持續(xù)快速度釋放，兩種環(huán)境下10 h內(nèi)Res的累積釋放率分別為51.10%、65.79%，表現(xiàn)出一定的腸溶特性。

利用靜電紡絲技術(shù)制備的Res/SRAS固體分散體由于其表面微觀形貌可控、粒徑分布均勻，在實(shí)現(xiàn)對(duì)Res等功能因子負(fù)載、緩釋、增溶等目標(biāo)的同時(shí)，還有望實(shí)現(xiàn)因其表觀形貌變化帶來的抗氧化等生物活性增強(qiáng)的效果。