李燕妮，李芬芳，陳 嬌，李奕星，劉石生，洪克前，馮建成，袁德保,*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚?，海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 ?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點實驗室，廣東 湛江 524091；4. 海南大學(xué)理學(xué)院，海南 ?？?570228）

紅毛丹（Nephelium lappaceumL.）果實風(fēng)味好且營養(yǎng)價值高，是一種受歡迎的熱帶水果。紅毛丹被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為優(yōu)先推廣的“四大水果”之一。泰國是全球紅毛丹最大生產(chǎn)國，此外，馬來西亞、越南、緬甸、印度尼西亞、菲律賓、澳大利亞、斯里蘭卡、南非、美國（夏威夷和波多黎各）和中國也都較大量種植紅毛丹。海南是我國唯一適合大面積種植紅毛丹的區(qū)域，目前擁有我國最大的紅毛丹生產(chǎn)基地。紅毛丹果實風(fēng)味獨特且外觀精致，深受消費者歡迎。然而，紅毛丹果實極不耐貯運。一方面，果實表面的軟刺氣孔密布使果實易出現(xiàn)失水褐變，因此貯運銷過程中需保持高濕環(huán)境，而高濕情況下更易發(fā)生腐爛；另一方面，紅毛丹果實軟刺極易受損并加速果皮褐變的發(fā)生，同時傷口會成為病原菌侵染的通道。李芬芳等[1]分離并鑒定出棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）為海南產(chǎn)紅毛丹果實褐斑病的主要致病菌。

芥末精油是從芥菜中提取的天然植物油，其主要成分是異硫氰酸烯丙酯（allyl-isothiocyanate，AITC）。芥末精油或AITC常被用作天然的抑菌劑[2]。10 μL/L芥末精油熏蒸處理能較好抑制冬棗采后病原菌（青霉菌、灰霉菌和鏈格孢菌）[3]；2 μL/L芥末精油熏蒸能完全抑制芒果炭疽病菌和蒂腐病菌，而5～10 μL/L熏蒸處理能明顯抑制上述病原菌在芒果果實上的生長[4]；1 μL/L AITC能有效降低草莓果實的腐爛率[5]。綜上可見芥末精油或AITC對果實采后致腐病原菌有很強的抑制活性。然而，芥末精油或AITC存在揮發(fā)性強、抑菌作用時間短、儲存以及使用不方便等問題，而且在較高濃度下對果實會產(chǎn)生藥害（植物精油存在的共性問題）。因此，研發(fā)既能充分發(fā)揮上述抑菌劑的抑菌作用，同時又能規(guī)避對果實產(chǎn)生藥害的精準(zhǔn)保鮮技術(shù)尤為重要。針對上述抑菌組分開展精準(zhǔn)緩釋控制有望解決上述問題。目前已有一些關(guān)于其緩釋控制的研究，如硅酸鹽凝膠緩釋控制[6]、膜材料緩釋控制[7]。李奕星等采用β-環(huán)糊精對芥末精油進(jìn)行了微膠囊化，能實現(xiàn)芥末精油的緩釋控制[8]并在一定程度上能規(guī)避其對果實產(chǎn)生藥害。

雖然芥末精油或AITC呈現(xiàn)較好的抑菌作用，然而芥末精油或AITC的β-環(huán)糊精包合物的抑菌活性鮮有研究，且其抑菌機制鮮有報道。因此，本研究以海南產(chǎn)紅毛丹果實褐斑病的病原菌棘孢曲霉為研究對象，考察芥末精油包合物對其抑菌活性和抑菌機制；抑菌機制分別從菌絲、分生孢子和孢子頂囊形態(tài)、菌絲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組分析方面開展。研究將為植物精油特別是芥末精油在果蔬采后貯運中的精準(zhǔn)保鮮提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）為本實驗室從腐爛的紅毛丹果皮中分離并鑒定，保藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚静珊笊飳W(xué)與技術(shù)課題組；PDA、PDB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

芥末精油（食品級，AITC質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為99%）河北省平鄉(xiāng)縣天邦調(diào)味食品有限公司；β-環(huán)糊精（分析純，純度98%） 上海麥克林生化科技公司；E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit試劑盒 廣州Omega Bio-Tek公司；MonScriptTMRTIII All-in-One Mix with dsDNase試劑盒、MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix（Low ROX）試劑盒武漢莫納生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2數(shù)顯磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TM 4000Plus掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、120 kV HT7700透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立株式會社；StepOnePlusTM熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Novaseq 6000測序平臺 美國Illumina公司；OSE-260微量分光光度計 北京天根生化科技有限公司；GY-CJ-1F無菌操作臺 上海永歸電子有限公司；1704486瓊脂糖凝膠電泳槽 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 芥末精油包合物制備及對棘孢曲霉的抑制率測定

參考李奕星等[8]方法制備芥末精油包合物。具體方法如下：精確稱取一定量的β-環(huán)糊精加入已預(yù)熱至60 ℃的去離子水中并磁力攪拌，制備成β-環(huán)糊精飽和水溶液（呈透明狀）；向β-環(huán)糊精飽和水溶液中緩慢滴入芥末精油-乙醇混合液（乙醇和芥末精油的體積比為1∶1），磁力攪拌使芥末精油被完全包合（控制β-環(huán)糊精與芥末精油的質(zhì)量比為6∶1）。50 ℃磁力攪拌2.5 h后，溶液體系在4 ℃下靜置24 h，將析出的沉淀過濾并在60 ℃下真空干燥24 h，得到白色的芥末精油包合物。

將10 mL適溫的PDA培養(yǎng)基分別倒入三格無菌培養(yǎng)皿（三格無菌培養(yǎng)皿的總體積為63 mL）中的兩格（每格5 mL），待培養(yǎng)基冷卻凝固備用。無菌條件下，用接種環(huán)從棘孢曲霉菌種斜面挑取孢子接種到PDA平板中央，然后用封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，在霉菌菌落邊緣用打孔器取直徑為0.6 cm的菌碟并置于三格培養(yǎng)皿中的PDA培養(yǎng)基中央；分別將0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g芥末精油包合物和1 mL無菌水放入空格中，對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為0（即對照組）、0.385、0.769、1.155、1.540、1.925 g/L（計算方法為芥末精油包合物的質(zhì)量除以三格培養(yǎng)皿中的剩余空間即52 mL）。三格培養(yǎng)皿蓋上蓋子并用封口膜密封，置于28 ℃培養(yǎng)60 h。采用十字交叉法測量菌落直徑/cm，并按下式計算抑制率。

1.3.2 芥末精油包合物對棘孢曲霉菌絲、分生孢子以及孢子頂囊影響的觀察

參照1.3.1節(jié)接種方法，棘孢曲霉固體培養(yǎng)3 d后，在霉菌菌落邊緣取直徑為0.6 cm的菌碟并置于三格培養(yǎng)皿中PDA固體培養(yǎng)基中央。根據(jù)1.3.1節(jié)結(jié)果計算出半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）并添加該質(zhì)量濃度的芥末精油包合物為處理組，未添加為對照組。生長60 h后取下表面菌絲，參考任亞峰[9]的方法進(jìn)行前處理。使用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛固定液進(jìn)行固定（4 ℃放置24 h），取出菌絲用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液清洗3 次；依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液進(jìn)行脫水，然后再用無水乙醇脫水兩次后浸入乙酸異戊酯，并用臨界干燥儀進(jìn)行干燥；將干燥樣品用導(dǎo)電膠黏貼置入標(biāo)本臺上，進(jìn)行SEM觀察，并采集圖像進(jìn)行分析。

1.3.3 芥末精油包合物對棘孢曲霉菌絲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的觀察

處理組和對照組菌絲培養(yǎng)同1.3.2節(jié)。菌絲用體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛溶液固定，接著用0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖漂洗3 次且每次15 min；然后用鋨酸固定3 h并用0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液沖洗3 次；依次用不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、80%、90%）乙醇溶液脫水，然后用無水乙醇脫水兩次后再用100%丙酮進(jìn)行脫水，切片并固定于銅網(wǎng)上；置于TEM下觀察并采集圖像進(jìn)行分析。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

棘孢曲霉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，接種一環(huán)棘孢曲霉及其孢子至裝于三角瓶中的100 mL PDB培養(yǎng)基。添加體積分?jǐn)?shù)為0.005%的芥末精油為處理組；未添加芥末精油為對照組。培養(yǎng)60 h后，將菌體使用無菌水清洗并冷凍離心，然后用液氮速凍并用干冰封裝，送至上海美吉生物公司采用Illumina Novaseq 6000測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。處理組和對照組分別設(shè)置3 個重復(fù)。

轉(zhuǎn)錄組測序后獲得原始讀段（raw reads），通過數(shù)據(jù)過濾獲得高質(zhì)量讀段（clean reads）。利用BLASTX對獲得的序列進(jìn)行NR注釋（NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）。使用DEGseq對組間的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行分析，并根據(jù)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2和P≤0.05篩選出DEGs。采用基因本體論（gene ontology，GO）（http//www.geneology.org）對DEGs進(jìn)行GO功能富集分析。通過京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）（http://www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行KEGG代謝通路顯著性富集，以確定DEGs參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.3.5 實時熒光定量PCR分析

使用E.Z.N.A. Fungal RNA Kit提取試劑盒進(jìn)行RNA提??；采用微量分光光度計檢測RNA純度（OD260nm/OD280nm比值）以及RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。采用MonScript RTIII All-in-one Mix試劑盒對質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選取β-actin為內(nèi)參基因，采用Primer express 5.0軟件Applied biosystem程序設(shè)計引物（表1）。使用StepOnePlusTMReal-Time PCR System、MonAmp SYBR Green qPCR試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，根據(jù)試劑盒說明步驟進(jìn)行具體實驗及相對定量結(jié)果分析。

表1 轉(zhuǎn)錄組DEGs驗證引物列表Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR in this study

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

實驗設(shè)置3 個重復(fù)，采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Sigmaplot軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，用R語言包和Sigmaplot軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥末精油包合物對棘孢曲霉的抑菌活性

從圖1可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，芥末精油包合物對棘孢曲霉的抑制率急劇升高。芥末精油對應(yīng)的抑制率回歸方程為y＝42.557x+8.362 4，R2＝0.938 9。50%抑制率對應(yīng)的芥末精油包合物質(zhì)量濃度為1.00 g/L，即EC50為1.00 g/L。多項研究表明植物精油對致病菌有顯著抑制作用且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系[10-11]。Lu Hao等[12]研究表明，桉樹油對假單胞菌和銅綠假單胞菌的EC50分別為1.04、1.27 g/L；Jing Changliang等[10]研究表明，丁香酚對鏈格孢菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.15 g/L；Aguilar-González等[13]研究表明丁香精油和芥末精油對灰葡萄孢菌有較好的抗菌活性，丁香精油的MIC為92.56 μL/L，而芥末精油的MIC為15.42 μL/L。本實驗結(jié)果明確了芥末精油包合物依然具有良好的抑菌活性且存在明顯量效關(guān)系。

圖1 芥末精油包合物質(zhì)量濃度對棘孢曲霉菌的抑制率Fig. 1 Inhibitory effect of mustard essential oil inclusion complex at different concentrations against Aspergillus aculeatus

2.2 芥末精油包合物對棘孢曲霉菌絲和分生孢子形態(tài)以及孢子頂囊的影響

SEM結(jié)果顯示，處理組和對照組存在明顯差異（圖2）。對照組孢子頂囊呈現(xiàn)較規(guī)則的球形，分生孢子分布均勻且長勢良好；處理組孢子頂囊不勻稱且呈畸形，孢子分生不規(guī)整（圖2A、D）。對照組菌絲較粗且形態(tài)飽滿，菌絲上布滿分生孢子；處理組菌絲較細(xì)且發(fā)生皺縮（圖2B、E）。對照組孢子頂囊的數(shù)量顯著多于處理組，且處理組孢子頂囊形態(tài)發(fā)生了明顯變化（圖2C、F）。Shao Xingfeng等[14]的SEM觀察結(jié)果表明，0.7 mL/L的茶樹油使灰霉菌菌絲形狀產(chǎn)生畸形或塌陷。張寬朝等[15]發(fā)現(xiàn)肉桂醛、檸檬醛使黑曲霉菌絲體和孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化。Gong Liang等[11]的SEM觀察結(jié)果表明，丁香酚-β-環(huán)糊精包合物能使荔枝霜疫霉菌的孢子囊和孢囊梗呈現(xiàn)異形，包括表面收縮、部分變形和皺縮。李路等[16]的SEM觀察結(jié)果表明，2.24 g/Lp-茴香醛能使柑橘酸腐病菌菌絲體表面出現(xiàn)明顯褶皺、不規(guī)則扭曲和干癟狀。整體來講，本實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。本實驗結(jié)果表明EC50濃度的芥末精油包合物使棘孢曲霉的菌絲、分生孢子以及孢子頂囊的形態(tài)出現(xiàn)異常并使孢子頂囊數(shù)量明顯減少。

圖2 掃描電子顯微鏡觀察不同處理棘孢曲霉的孢子、菌絲以及孢子囊的形態(tài)Fig. 2 SEM observation of morphology of spores, hyphae and sporangia of Aspergillus aculeatus treated with mustard essential oil inclusion complex

2.3 芥末精油包合物對棘孢曲霉菌絲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

TEM結(jié)果顯示，對照組菌絲細(xì)胞飽滿、雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體以及正在進(jìn)行跨膜運輸?shù)哪遗莸燃?xì)胞器（圖3A）；處理組菌絲細(xì)胞不再充盈、細(xì)胞壁變薄、細(xì)胞膜邊界模糊、細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生嚴(yán)重的溶解現(xiàn)象（圖3B）。Shao Xingfeng等[14]通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)，1.5 mL/L茶樹油可以使灰霉菌細(xì)胞的質(zhì)壁分離、質(zhì)膜破裂且從細(xì)胞壁剝離、細(xì)胞內(nèi)成分損傷嚴(yán)重。Li Yonghua等[17]通過TEM觀測到2.0 mL/L茶樹油使灰質(zhì)芽孢桿菌細(xì)胞的線粒體嚴(yán)重受損，主要表現(xiàn)在基質(zhì)丟失和線粒體數(shù)量不規(guī)則性增加。Shao Xingfeng等[18]的TEM觀察結(jié)果表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%殼聚糖中加入12 mL/L丁香精油可使柑橘綠霉菌菌體細(xì)胞質(zhì)膜分離、線粒體等細(xì)胞器消失、液泡增加、細(xì)胞質(zhì)喪失，同時細(xì)胞壁發(fā)生嚴(yán)重皺縮。Lu Hao等[12]通過TEM觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.0 g/L桉樹油可破壞銅綠假單胞菌細(xì)胞，如細(xì)胞出現(xiàn)明顯的孔洞或皺褶。本實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果總體一致，即EC50的芥末精油包合物使棘孢曲霉菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及細(xì)胞器出現(xiàn)異常。

圖3 TEM觀察對照組（A）和處理組（B）棘孢曲霉菌絲細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 TEM observation of ultrastructure of Aspergillus aculeatus hyphal cells not treated (A) and treated (B) with mustard essential oil inclusion complex

2.4 棘孢曲霉差異表達(dá)基因的分析

為進(jìn)一步探究精油的抑菌機制，一些文獻(xiàn)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段研究了精油對真菌DEGs的影響[19-22]。對處理組和對照組樣品的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后對所有基因的表達(dá)量繪制散點圖（圖4A）?；疑糠直硎静町惒伙@著的DEGs；紅色和綠色部分分別表示DEGs中的上調(diào)基因和下調(diào)基因。由圖4B可知，DSGs中上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為528 個和529 個。由圖4C可知，DEGs的GO功能富集主要集中在生物過程（14 條）、細(xì)胞組成（12 條）和分子功能（15 條）3 個方面。1 057 個DEGs中，有743 個基因成功歸類到3 個部分中的41 個組別中（圖4C）。在生物過程方面，DEGs主要參與了“代謝過程”“細(xì)胞過程”“本土化”“生物調(diào)節(jié)”等過程；在細(xì)胞組成方面，DEGs主要參與了“膜部分”“細(xì)胞區(qū)域”“細(xì)胞器”“蛋白復(fù)合物”等；在分子功能方面，DEGs主要參與了“催化活性”“結(jié)合”“轉(zhuǎn)運活性”“翻譯調(diào)節(jié)活性”等。進(jìn)一步分析DEGs的KEGG途徑分類，主要歸于“代謝”“遺傳信息處理”“環(huán)境信息處理”“細(xì)胞轉(zhuǎn)化”“有機體系統(tǒng)”“人類疾病”6 類（圖4D）；共有392 個DEGs歸類到29 條KEGG途徑，主要涉及“碳水化合物代謝”“氨基酸代謝”“能量代謝”“折疊、分類和降解”“翻譯”“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”“運輸和分解代謝”“環(huán)境適應(yīng)”等（圖4D）。前人研究發(fā)現(xiàn)，相比對照，肉桂醛和檸檬醛協(xié)同處理擴展青霉后出現(xiàn)1 713 個DEGs，有793 個基因下調(diào)和920 個基因上調(diào)，大多數(shù)DEGs參與了次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸代謝和氧化還原過程等[21]。

圖4 轉(zhuǎn)錄組DEGs分析結(jié)果Fig. 4 Transcriptomic analysis of differentially expressed genes

2.5 實時熒光定量PCR驗證實驗結(jié)果

基于GO和KEEG富集分析，選取各條目和代謝通路中顯著變化且表達(dá)量較多的8 個差異基因，利用實時熒光定量PCR對選取的基因差異表達(dá)情況進(jìn)行驗證。選取基因主要參與編碼ATP合成酶、NADPH結(jié)合酶以及細(xì)胞色素c氧化酶亞基1等。雖然轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和實時熒光定量PCR分析結(jié)果的log2FC有差異，但差異表達(dá)的變化趨勢基本一致（表2），說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性；表達(dá)倍數(shù)的差異可能是由于儀器、算法等不同造成的。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，本研究中選擇的8 個差異基因分別屬于ABC、HSP、CAT、RP、NADPH、COX、COX、FADH基因家族（表2）。ABC屬于質(zhì)膜轉(zhuǎn)運基因，是一種重要的耐藥基因，與藥物外排誘導(dǎo)機制相關(guān)[23]；熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是重要的應(yīng)激蛋白，在生物體遭受外界脅迫時其表達(dá)將大量上調(diào)[24]；過氧化氫酶（catalase，CAT）是一種重要的抗氧化酶與生物體的應(yīng)激反應(yīng)及活性氧的水平密切相關(guān)[22]；核糖體蛋白（ribosomal protein，RP）是核糖體亞基的重要組成部分，涉及細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡和DNA損傷反應(yīng)[25]；還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)ADH）和細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）是三羧酸循環(huán)的重要組成部分，參與線粒體的能量代謝、功能和呼吸鏈傳遞[26-27]。芥末精油包合物處理棘孢曲霉上調(diào)了ABC、HSP、CAT和RP基因的表達(dá)量，下調(diào)了NADPH、COX和FADH基因的表達(dá)量（表2）。線粒體的主要功能是通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞的能量貨幣ATP[28]。茶樹精油和檸檬醛通過影響灰霉菌或指狀青霉細(xì)胞的線粒體形態(tài)和功能從而實現(xiàn)其抑菌性能[17,28]；茶樹精油組分松油醇能阻斷灰霉菌細(xì)胞線粒體功能和呼吸鏈相關(guān)基因的表達(dá)，而線粒體功能失調(diào)觸發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]；肉桂醛和檸檬醛使擴展青霉中能量代謝相關(guān)的基因出現(xiàn)下調(diào)[21]；檸檬醛能下調(diào)指狀青霉的NADPH和COX基因表達(dá)水平[27]。本實驗研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，即芥末精油包合物加速了線粒體功能失調(diào)和呼吸鏈紊亂，而線粒體功能障礙進(jìn)而引發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)（如CAT表達(dá)上調(diào)）。

表2 轉(zhuǎn)錄組DEGs驗證結(jié)果Table 2 Verification of differentially expressed genes in transcriptome

2.6 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的芥末精油包合物抑制棘孢曲霉機制分析

2.6.1 芥末精油包合物對參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的影響

線粒體膜相關(guān)的基因中出現(xiàn)6 個顯著上調(diào)、13 個顯著下調(diào)；線粒體內(nèi)膜相關(guān)的基因中出現(xiàn)4 個顯著上調(diào)、11 個顯著下調(diào)；細(xì)胞器內(nèi)膜相關(guān)的基因中出現(xiàn)4 個顯著上調(diào)、11 個顯著下調(diào)（表3）?？刂粕锬ば纬傻幕蝻@著下調(diào)，說明膜的完整性遭到破壞[29]。編碼線粒體內(nèi)膜蛋白復(fù)合物的基因中出現(xiàn)2 個上調(diào)，7 個下調(diào)（表3）。生物膜成分的改變可能造成膜流動性和通透性的變化[30]。水芹烯和壬醛會嚴(yán)重破壞青霉菌細(xì)胞膜完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞組分和鉀離子的滲漏[31]。茶樹精油能導(dǎo)致葡萄孢菌胞外電導(dǎo)率的增加，間接反映細(xì)胞膜完整性遭到破壞[32]。6 個調(diào)控細(xì)胞成分運動的基因都顯著下調(diào)，說明細(xì)胞成分改變；細(xì)胞外區(qū)域有關(guān)的基因均發(fā)生顯著變化；細(xì)胞骨架相關(guān)的5 個基因顯著下調(diào)；肌動蛋白絲運動的調(diào)控與細(xì)胞骨架相關(guān)，對應(yīng)的6 個基因全部下調(diào)（表3）。因此，芥末精油包合物處理導(dǎo)致線粒體膜等生物膜受損、細(xì)胞成分改變、細(xì)胞骨架等細(xì)胞器的形成和功能發(fā)生變化。上述研究結(jié)果與2.3節(jié)TEM觀察結(jié)果一致。

2.6.2 芥末精油包合物對參與DNA/RNA合成代謝、運輸能力以及有絲分裂的影響

核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)基因出現(xiàn)39 個上調(diào)、34 個下調(diào)；轉(zhuǎn)錄因子活性（序列特異性DNA結(jié)合）相關(guān)基因出現(xiàn)39 個上調(diào)、34 個下調(diào)；RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性（序列特異性DNA結(jié)合）相關(guān)基因出現(xiàn)38 個上調(diào)、32 個下調(diào)（表4）。上述結(jié)果表明芥末精油包合物處理對棘孢曲霉DNA和RNA的生物合成和代謝造成了顯著影響，進(jìn)而使蛋白質(zhì)合成[33]和功能受限[34]?？缒まD(zhuǎn)運相關(guān)基因出現(xiàn)40 個上調(diào)、31 個下調(diào)；無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因出現(xiàn)10 個上調(diào)、15 個下調(diào)；單價無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因出現(xiàn)7 個上調(diào)、13 個下調(diào)；氫離子跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因出現(xiàn)7 個上調(diào)、12 個下調(diào)（表4）。綜上可知，芥末精油包合物處理顯著影響了棘孢曲霉體內(nèi)跨膜運輸調(diào)節(jié)，跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂進(jìn)一步影響細(xì)胞的正常生理功能。由表4可知，與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的基因整體呈現(xiàn)下調(diào)。與有絲分裂細(xì)胞動力學(xué)過程相關(guān)基因出現(xiàn)4 個下調(diào)；收縮環(huán)收縮相關(guān)基因出現(xiàn)3 個下調(diào)；有絲分裂肌動球蛋白收縮環(huán)收縮相關(guān)基因出現(xiàn)3 個下調(diào)；肌動球蛋白收縮環(huán)收縮相關(guān)基因出現(xiàn)3 個下調(diào)（表4）。此外，鈣離子結(jié)合相關(guān)基因出現(xiàn)11 個下調(diào)（表4）。鈣離子通過與特定鈣受體或者鈣結(jié)合蛋白綁定實現(xiàn)其生物學(xué)功能，調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞生命周期（包括細(xì)胞分裂、分化和凋亡）等過程[35]。因此，芥末精油包合物處理顯著抑制了棘孢曲霉細(xì)胞有絲分裂過程，從而抑制體細(xì)胞產(chǎn)生。上述研究結(jié)果特別是有絲分裂部分與2.2節(jié)SEM觀察結(jié)果部分一致，即處理組菌絲直徑和孢子囊數(shù)量顯著小于對照組。

2.6.3 芥末精油包合物對酶活性相關(guān)基因表達(dá)的影響

糖苷水解酶活性相關(guān)基因出現(xiàn)22 個上調(diào)、17 個下調(diào)（表5）。5 種α-葡萄糖苷酶活性相關(guān)基因都出現(xiàn)顯著下調(diào)，說明顯著抑制了葡萄糖的產(chǎn)生；α-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因出現(xiàn)3 個下調(diào)，β-果糖呋喃糖苷酶相關(guān)基因也出現(xiàn)3 個下調(diào)；絲氨酸型內(nèi)肽酶相關(guān)基因出現(xiàn)2 個上調(diào)、7 個下調(diào)，說明氨基酸的生物合成受到影響；與呼吸電子傳遞鏈相關(guān)的幾種酶（包括ATPase復(fù)合物、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP合酶復(fù)合物和血紅素-銅端氧化酶）相關(guān)基因整體上呈現(xiàn)下調(diào)，說明菌體能量代謝呈現(xiàn)異常；氧化還原酶活性的相關(guān)基因出現(xiàn)3 個顯著上調(diào)、13 個顯著下調(diào)（表5）。綜上可知，芥末精油包合物處理對棘孢曲霉體內(nèi)酶活性相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了顯著影響，酶活性的變化直接或間接影響了生物大分子的功能、代謝反應(yīng)的發(fā)生、細(xì)胞進(jìn)程的改變。

表5 部分與酶活性相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 5 Transcription levels of differentially expressed genes related to enzymatic activities

2.6.4 芥末精油包合物對呼吸電子傳遞鏈相關(guān)基因表達(dá)的影響

黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合相關(guān)基因出現(xiàn)30 個上調(diào)、15 個下調(diào)；呼吸電子傳遞鏈相關(guān)基因出現(xiàn)4 個上調(diào)、9 個下調(diào)；需氧呼吸相關(guān)基因出現(xiàn)2 個上調(diào)、5 個下調(diào)；細(xì)胞呼吸相關(guān)基因出現(xiàn)2 個上調(diào)、5 個下調(diào)；氧化磷酸化相關(guān)基因出現(xiàn)1 個上調(diào)、3 個下調(diào)；細(xì)胞色素復(fù)合物相關(guān)基因出現(xiàn)2 個上調(diào)、6 個下調(diào)；線粒體呼吸鏈復(fù)合物相關(guān)基因出現(xiàn)1 個上調(diào)、3 個下調(diào)；質(zhì)子轉(zhuǎn)運兩扇區(qū)相關(guān)基因出現(xiàn)1 個上調(diào)、3 個下調(diào)（表6）。此外，肌球蛋白是真核細(xì)胞內(nèi)的一類ATP依賴型分子馬達(dá)[36]。肌球蛋白結(jié)合相關(guān)3 個基因全部下調(diào)。上述結(jié)果與2.6.3節(jié)中與呼吸電子傳遞鏈相關(guān)的幾種酶相關(guān)基因出現(xiàn)整體下調(diào)結(jié)果一致。綜上，芥末精油包合物處理顯著抑制了呼吸電子傳遞鏈及能量代謝水平，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。

表6 部分與呼吸電子傳遞鏈相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 6 Transcription levels of differentially expressed genes related to respiratory electron transport chain

3 結(jié) 論

芥末精油包合物具有抑制棘孢曲霉的良好活性且存在明顯量效關(guān)系，其EC50為1.00 g/L；SEM觀察發(fā)現(xiàn)EC50下芥末精油包合物使棘孢曲霉菌絲、分生孢子及孢子形態(tài)發(fā)生明顯變化且孢子頂囊數(shù)量大幅減少；TEM觀察結(jié)果表明EC50的芥末精油包合物使棘孢曲霉菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及細(xì)胞器出現(xiàn)異常。芥末精油包合物處理后，1 057 個DEGs中有528 個上調(diào)基因和529 個下調(diào)基因；采用實時熒光定量PCR對8 個差異基因進(jìn)行驗證，得到與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致的基因表達(dá)量變化趨勢；綜上，芥末精油包合物處理后，棘孢曲霉線粒體膜等生物膜受損、細(xì)胞成分改變、細(xì)胞骨架等細(xì)胞器形成和功能發(fā)生變化；DNA和RNA的生物合成和代謝受到顯著影響；酶活性相關(guān)基因、跨膜運輸調(diào)節(jié)相關(guān)基因受到顯著影響；有絲分裂過程受到嚴(yán)重抑制從而抑制體細(xì)胞產(chǎn)生；呼吸電子傳遞鏈及能量代謝水平受到顯著抑制。