王 濤，翟 晨，王 亮,*，李夢(mèng)瑤,，王書(shū)雅，謝云峰

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年的果蔬產(chǎn)量都遠(yuǎn)超其他國(guó)家，而番茄正是我國(guó)眾多果蔬品種中產(chǎn)量較高的一種，其富含大量的番茄紅素、VC以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[1-2]，但同時(shí)也容易發(fā)生劣變。SOD是一種廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物體內(nèi)的金屬抗氧化酶，它與過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶等的活性是評(píng)判果蔬副產(chǎn)品品質(zhì)劣變程度的重要指標(biāo)，SOD可以清除細(xì)胞代謝有害物質(zhì)，抑制果蔬腐敗變質(zhì)[3-5]。

功能化離子液體是根據(jù)離子液體的可設(shè)計(jì)性，在離子液體的陰、陽(yáng)離子中引入氨基、羧基和羥基等單個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，從而使離子液體具有某些特異性功能或性質(zhì)，是離子液體應(yīng)用的一個(gè)重要分支[6-8]。功能化離子液體是近幾年發(fā)展的一種新型綠色化學(xué)功能溶劑，因具有蒸汽壓低、不易揮發(fā)、化學(xué)穩(wěn)定性好、熱穩(wěn)定性好、溶解性?xún)?yōu)異，易與無(wú)機(jī)鹽類(lèi)形成雙水相以及可循環(huán)使用，且不會(huì)造成環(huán)境污染和不會(huì)危及操作者健康等多種優(yōu)勢(shì)，引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[9-15]。功能化離子液體在具有普通離子液體特性的同時(shí)，又由于其結(jié)構(gòu)的變化，在黏度、熔點(diǎn)、配位能力、親水性等方面有極大的優(yōu)越性。功能化離子液體可以直接從水相中萃取重金屬離子、有機(jī)物，且其相對(duì)于易揮發(fā)有機(jī)溶劑而言，萃取率大幅提高[16]。目前，功能化離子液體已經(jīng)在電化學(xué)、有機(jī)合成、分離萃取等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[17-20]，而氨基功能化離子液體正是當(dāng)前研究比較多的一種功能化離子液體。雙水相體系因萃取條件高效溫和而被廣泛應(yīng)用于生物大分子物質(zhì)的萃取分離。功能化離子液體-雙水相體系是由親水性功能化離子液體和無(wú)機(jī)鹽組成的兩相[11]?；诠δ芑x子液體-雙水相體系，Chen Jing等[21]合成了羥基功能化離子液體，該體系對(duì)牛血清白蛋白的萃取得率高達(dá)99.6%。施婭楠等[11]采用[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相抽提技術(shù)從辣木葉蛋白中分離凝乳酶，其酶活性回收率達(dá)到85.5%。

目前，番茄等植物性農(nóng)產(chǎn)品抗氧化酶的萃取多依賴(lài)于傳統(tǒng)的緩沖溶液法[1-3]，利用緩沖溶液法提取的酶活性一般較低，而且提取一般需要40 min，耗時(shí)較長(zhǎng)；近些年也有利用普通離子液體法對(duì)抗氧化酶進(jìn)行萃取的研究，但大多數(shù)關(guān)于離子液體的研究都集中于二氧化碳、二氧化硫等氣體的分離以及催化反應(yīng)，針對(duì)萃取蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的研究很少。離子液體萃取SOD是由于其具有較強(qiáng)的溶劑作用，且與蛋白質(zhì)之間有多種分子作用力，尤其是氫鍵作用力、極性作用力、離子電荷作用力，均會(huì)極大提高SOD在離子液體中的溶解度。功能化氨基官能團(tuán)比普通離子液體更容易與SOD形成氫鍵，而氫鍵作用力是離子液體與蛋白質(zhì)的多種作用力之一[16]。而氨基功能化離子液體在生物大分子方面的萃取研究還相對(duì)較少。

因此本研究擬選用1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[C4Mim]Cl）、1-丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[C3Mim]Cl）、1-胺丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[(H2NC3)Mim]Cl）和1-胺乙基-3-甲基咪唑溴鹽（[(H2NC2)Mim]Br）4 種離子液體與無(wú)機(jī)鹽形成的雙水相體系，對(duì)番茄中的SOD進(jìn)行萃取研究。以SOD活力為指標(biāo)，考察離子液體的種類(lèi)及質(zhì)量濃度、無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度、萃取時(shí)間和萃取溫度等參數(shù)對(duì)SOD活力的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行再次優(yōu)化，以期為果蔬中蛋白酶類(lèi)物質(zhì)的高活性萃取提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SOD（1 500 U/mg） 上海士鋒生物科技有限公司；磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、30% H2O2、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（均為分析純） 北京化工廠(chǎng)；[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC3)Mim]Cl、[(H2NC2)Mim]Br 上海默尼化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Reference超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；11-102-49SH渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司；U-3900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；THZ-103B恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10型pH計(jì)德國(guó)Sartorius公司；Thermo ST16R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Multi-mode Synergy Mx酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 相圖的繪制

采用濁度滴定法[22-23]進(jìn)行相圖的繪制。首先分別稱(chēng)取1 g的離子液體（[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC2)Mim]Br和[(H2NC3)Mim]Cl）置于10 mL的離心管中，加入一定量的蒸餾水使離子液體完全溶解之后，向含有離子液體溶液的離心管中加入一定量的K2HPO4直至溶液變渾濁，再加蒸餾水至雙水相消失，同時(shí)記錄下所添加的無(wú)機(jī)鹽和蒸餾水的用量，并進(jìn)行多次如此反復(fù)操作以繪制相圖，其中橫坐標(biāo)為K2HPO4的質(zhì)量摩爾濃度，縱坐標(biāo)為離子液體的質(zhì)量摩爾濃度。

1.3.2 氨基功能化離子液體雙水相萃取SOD

稱(chēng)取一定質(zhì)量的氨基功能化修飾的離子液體（終質(zhì)量濃度為0.4 g/mL）和K2HPO4（終質(zhì)量濃度為0.6 g/mL）加入到帶有刻度的離心管中，并加入1.5 mL蒸餾水溶解，待其溶解完全后可觀(guān)察到體系分為上相（富集離子液體）、下相（富集K2HPO4）的雙水相體系，再向雙水相體系中加入0.5 g研磨成漿的番茄泥振蕩混合均勻。將離心管放置于35 ℃、300 r/min恒溫培養(yǎng)搖床中，振蕩萃取25 min后取出離心管，靜置使兩相完全分開(kāi)，取上清液（粗酶液）進(jìn)行SOD活力測(cè)定。

1.3.3 緩沖液法萃取SOD

根據(jù)文獻(xiàn)[18]方法，配制0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.8）用于萃取番茄中的SOD。具體操作步驟：取新鮮的番茄，放入勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，再將其倒入研缽中在冰浴狀態(tài)下研磨至泥狀，稱(chēng)取0.5 g研磨成漿的番茄泥加入到含有4.5 mL PBS的離心管中混合均勻，將其放入高速離心機(jī)中，在4 ℃條件下以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心40 min，離心結(jié)束后取上清液于4 ℃環(huán)境中待用。

1.3.4 氨基功能化離子液體雙水相萃取SOD工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g研磨成漿的番茄泥，采用氨基功能化離子液體雙水相萃取法提取粗酶液，考察不同離子液體、氨基功能化離子液體質(zhì)量濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/mL）、K2HPO4質(zhì)量濃度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 g/mL）、萃取溫度（20、25、30、35、40 ℃）以及萃取時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）對(duì)SOD活力的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取氨基功能化離子液體質(zhì)量濃度（A）、K2HPO4質(zhì)量濃度（B）、萃取溫度（C）以及萃取時(shí)間（D），利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以SOD活力為響應(yīng)值，建立響應(yīng)回歸模型，優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇獲得SOD活力最大的萃取工藝，因素水平如表1所示[24-26]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Level and code of independent variables used for response surface design

1.3.6 SOD活力測(cè)定

SOD活力測(cè)定采用鄰苯三酚法[27]。在25 ℃恒溫條件下，以每克番茄樣品每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達(dá)50%所需的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。SOD活力單位為U/g，結(jié)果以番茄濕質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值，響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系的相圖

大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽（K3PO4、K2HPO4和Na2CO3）都能與離子液體形成雙水相，且具有較好的成相能力，其中K2HPO4與離子液體形成的雙水相體系條件相對(duì)溫和，因此本實(shí)驗(yàn)擬選用K2HPO4作為成相鹽[22]。從[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC2)Mim]Br和[(H2NC3)Mim]Cl與K2HPO4體系的相圖（圖1）可知，各離子液體的成相能力大小依次為[(H2NC2)Mim]Br＞[C4Mim]Cl＞[C3Mim]Cl＞[(H2NC3)Mim]Cl；而離子液體的成相能力與其親水能力相反，故其親水性由高到低依次為[(H2NC3)Mim]Cl＞[C3Mim]Cl＞[C4Mim]Cl＞[(H2NC2)Mim]Br。

圖1 雙水相體系的相圖Fig. 1 Phase diagrams of aqueous two-phase systems

2.2 SOD萃取參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

由于不同類(lèi)型的離子液體對(duì)SOD萃取效果有很大的影響。因此，實(shí)驗(yàn)考察了[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC3)Mim]Cl和[(H2NC2)Mim]Br 4 種不同類(lèi)型的離子液體對(duì)SOD活力的影響。如圖2A所示，氨基功能化離子液體比普通離子液體更容易與SOD形成氫鍵，而氫鍵作用力是離子液體與蛋白質(zhì)的多種作用力之一[16]，和其他離子液體相比，[(H2NC2)Mim]Br形成的雙水相體系對(duì)SOD具有最好的萃取效果，因此選擇[(H2NC2)Mim]Br制備雙水相體系對(duì)酶進(jìn)行提取。

[(H2NC2)Mim]Br質(zhì)量濃度對(duì)SOD萃取效果的影響如圖2B所示，離子液體質(zhì)量濃度為0.3 g/mL時(shí)，對(duì)SOD的萃取效果較差，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 g/mL時(shí)，萃取效果最好，之后隨著離子液體質(zhì)量濃度升高，SOD部分二級(jí)結(jié)構(gòu)被改變，并且離子液體膠束的形成也會(huì)使部分酶失活，導(dǎo)致活力降低[28]，因此最佳離子液體質(zhì)量濃度應(yīng)控制在0.4 g/mL。

無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度對(duì)SOD萃取效果的影響如圖2C所示，當(dāng)K2HPO4的質(zhì)量濃度為0.6 g/mL時(shí)，SOD能夠保持最高的活力。隨著K2HPO4質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，可能會(huì)使已經(jīng)萃取到離子液體相中的酶再轉(zhuǎn)移到水相中，同時(shí)過(guò)多的鹽也可能導(dǎo)致酶活力的下降，因此，K2HPO4的最優(yōu)質(zhì)量濃度為0.6 g/mL。

萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)SOD萃取效果的影響分別如圖2D、E所示，隨溫度升高，SOD活力先快速升高再略下降，其中35 ℃下萃取得到的SOD活力最高，因此最優(yōu)萃取溫度為35℃；隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)，SOD活力逐漸增加，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到25 min后，SOD活力逐漸穩(wěn)定，因此，萃取時(shí)間選擇為25 min。

圖2 不同因素對(duì)所萃取的SOD活力的影響Fig. 2 Effects of different extraction parameters on SOD activity

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次回歸擬合方程Y＝344.94+2.51A+3.21B+1.89C+0.58D+0.47AB-1.57AC+2.68AD+1.83BC-0.25BD-0.39CD-26.18A2-26.08B2-22.08C2-22.16D2。

表2 不同因素對(duì)SOD活力影響的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design with experimental values of SOD activity for response surface analysis

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，模型P＜0.000 1，說(shuō)明數(shù)據(jù)模型方程達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)是模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項(xiàng)P＝0.476 7＞0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)變異不顯著；即回歸方程與實(shí)際結(jié)果擬合良好，能充分反映實(shí)際情況，誤差小，模型合適?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，回歸模型一次項(xiàng)A、B、C為模型顯著因素，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2為模型極顯著因素，其余各項(xiàng)對(duì)SOD活力影響均不顯著。因此，可用此模型SOD的提取工藝和條件進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)方差分析中F檢驗(yàn)可以判斷自變量對(duì)因變量的影響，由此得到各因素對(duì)SOD活力影響由大到小依次為B＞A＞C＞D，即K2HPO4質(zhì)量濃度對(duì)SOD影響最顯著，[(H2NC2)Mim]Br質(zhì)量濃度與萃取溫度影響次之，萃取時(shí)間影響最小。

表3 不同因素對(duì)SOD活力影響的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the effects of different extraction parameters on SOD activity

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

響應(yīng)曲面圖可以反映各因素之間相互作用的強(qiáng)弱，采用Box-Behnken軟件對(duì)響應(yīng)曲面圖進(jìn)行分析，可以得到各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

三維響應(yīng)面曲線(xiàn)圖可以更直觀(guān)地觀(guān)察到兩個(gè)變量對(duì)因變量的影響，等高線(xiàn)圖即為響應(yīng)面圖的投影，可從等高線(xiàn)圖中得到最佳范圍。由圖3可知，[(H2NC2)Mim]Br質(zhì)量濃度和K2HPO4質(zhì)量濃度交互作用的響應(yīng)曲面最陡峭，說(shuō)明對(duì)SOD活力影響最顯著；[(H2NC2)Mim]Br質(zhì)量濃度與萃取時(shí)間、萃取溫度之間以及K2HPO4質(zhì)量濃度與萃取時(shí)間、萃取溫度的交互作用的響應(yīng)曲面相對(duì)陡峭，說(shuō)明對(duì)SOD活力影響顯著程度次之；萃取時(shí)間與萃取溫度的交互作用對(duì)提取率的影響顯著程度較小，表現(xiàn)為曲面較平滑，說(shuō)明對(duì)SOD活力無(wú)顯著性影響。通過(guò)模型優(yōu)化，得到SOD的最佳提取條件為[(H2NC2)Mim]Br質(zhì)量濃度0.40 g/mL、K2HPO4質(zhì)量濃度0.61 g/mL、萃取溫度35.22 ℃、萃取時(shí)間25.08 min；并得到該條件下的SOD活力預(yù)測(cè)值為345.15 U/g。

圖3 各因素交互作用對(duì)SOD活力影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig. 3 Response surface and contour plots for the interactive effects of various factors on SOD activity

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考慮到實(shí)際操作因素，將各因素最佳條件設(shè)定為氨基功能化離子液體質(zhì)量濃度0.40 g/mL、K2HPO4質(zhì)量濃度0.60 g/mL、萃取溫度35℃、萃取時(shí)間25 min，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，得到萃取的SOD活力平均值為345.68 U/g，與2.3.2節(jié)的預(yù)測(cè)值345.15 U/g接近，驗(yàn)證了此模型的有效性，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型與實(shí)際情況擬合較好。

2.4 不同方法萃取SOD效果比較結(jié)果

在該優(yōu)化的條件下，實(shí)驗(yàn)以0.4 g/mL [(H2NC2)Mim]Br和0.6 g/mL K2HPO4制備雙水相體系，于35 ℃條件下對(duì)番茄中的SOD萃取25 min，對(duì)萃取后的SOD活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。[(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相萃取得到的SOD活力高于傳統(tǒng)的緩沖液萃取法及[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相法，且標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的原因主要是氨基功能化離子液體-雙水相是基于目標(biāo)物與萃取劑之間的相互作用力（如范德華力、氫鍵作用、鹽析效應(yīng)和疏水作用）導(dǎo)致分配系數(shù)的改變，從而達(dá)到萃取分離的目的[29-30]?？傮w來(lái)說(shuō)，氨基功能化離子液體雙水相萃取法優(yōu)于傳統(tǒng)的萃取方法，該方法受到的外界干擾更小。

表4 [(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相法與緩沖液法、[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相法萃取SOD效果比較結(jié)果Table 4 Comparison of SOD activity values determined by [(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4-based two aqueous phase extraction, buffer solution extraction and[C4Mim]Br/K2HPO4-based two aqueous phase extraction

3 結(jié) 論

本研究基于[(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相體系，建立了萃取分離番茄中SOD的新方法。以SOD活力為指標(biāo)，對(duì)離子液體的種類(lèi)及質(zhì)量濃度、萃取時(shí)間、無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度、萃取溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，最后對(duì)傳統(tǒng)緩沖液法及[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相法進(jìn)行萃取效果的比較。結(jié)果表明[(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相法萃取番茄中SOD的最佳條件為[(H2NC2)Mim]Br離子液體質(zhì)量濃度0.40 g/mL、K2HPO4質(zhì)量濃度0.60 g/mL、萃取溫度35 ℃、萃取時(shí)間25 min。通過(guò)本研究建立的萃取方法成功萃取了番茄中的SOD，得到的SOD活力比傳統(tǒng)緩沖液萃取方法高，且萃取時(shí)間縮短了15 min。