全志剛，王維浩,2，趙姝婷，劉德志，王一飛，武云嬌，蘇有韜，魏春紅，曹龍奎,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

小米是華北地區(qū)的重要糧食作物和主糧，其麩皮是一種廉價(jià)且易于獲得的副產(chǎn)品，約占小米籽粒質(zhì)量的6%～8%，其中含有50%～60%的膳食纖維[1-2]，還含有如多酚類、黃酮、木脂素等植物化學(xué)物質(zhì)。谷物類膳食纖維是研究最廣泛的一類膳食纖維，主要來自于各種農(nóng)產(chǎn)品及其加工副產(chǎn)物。谷物麩皮層中富含膳食纖維，同時(shí)還含有膠質(zhì)狀葡聚糖，且不含植酸，是抗氧化膳食纖維的良好來源[3-4]。膳食纖維被認(rèn)為是一類碳水化合物聚合物或低聚物，它們不能被小腸消化吸收，從而能夠進(jìn)入大腸被腸道菌群部分或完全發(fā)酵[5]。

2008年，Sánchez-Alonso等[6]提出抗氧化膳食纖維（antioxidant dietary fiber，ADF）這一概念，即將大量天然抗氧化劑結(jié)合到膳食纖維基質(zhì)中所得產(chǎn)物。ADF按水溶解性的不同分為水溶性抗氧化膳食纖維和水不溶性抗氧化膳食纖維，其中，水溶性抗氧化膳食纖維中富含黃酮類、酚酸以及縮合單寧等天然抗氧化成分[4,7-8]，具有較好的抗氧化和降血脂等活性[9-11]。胡莉等[12]的研究表明花生稈水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）有較好的自由基清除力和還原力，可作為抗氧化劑用于功能性食品的研發(fā)。姜龍波等[13]的研究表明小米糠水溶性非淀粉多糖中多酚和黃酮類物質(zhì)含量豐富，對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力稍低，但對(duì)·OH、O2-·清除能力以及Fe3+還原能力和Fe2+螯合能力均較高。研究表明三價(jià)鉻離子（Cr3+）具有一定提高抗氧化性的能力。Fan Wentao等[14]研究發(fā)現(xiàn)給予雞灌胃一定劑量Cr3+后，Cr3+可以誘導(dǎo)肝臟組織產(chǎn)生大量的抗氧化酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等），從而提高總抗氧化能力。趙文蘋[15]、蘭明慧[16]等在奶?；A(chǔ)日糧中添加酵母鉻（主要含Cr3+），對(duì)受試牛群血液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶活力、超氧化物歧化酶活力和總抗氧化能力均提高，Cr3+的添加增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化功能。作為副產(chǎn)物的小米麩皮價(jià)格低廉，含有豐富的膳食纖維，小米麩皮SDF具有較好的水溶性，結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基、羧基等活性官能團(tuán)，在一定條件下可以去質(zhì)子化形成配體，具有較好的螯合金屬離子的基礎(chǔ)。因此，本實(shí)驗(yàn)以小米麩皮為原料，對(duì)其中SDF進(jìn)行研究，由于膳食纖維與多糖具有相似的結(jié)構(gòu)，所以利用堿性-氯化鉻法對(duì)SDF進(jìn)行修飾，得到鉻螯合小米麩皮水溶性膳食纖維（selenium modified soluble dietary fiber，SDF-Cr(III)），并對(duì)螯合前后小米麩皮SDF采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）、高效液相色譜法分別分析修飾前后分子質(zhì)量、顆粒形態(tài)、官能團(tuán)、粒徑分布和形態(tài)、單糖組成的變化；考察螯合前后SDF的體外抗氧化活性的能力，為今后的工業(yè)生產(chǎn)及功能性食品的研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米麩皮 黑龍江省大慶肇州托古小米廠。

α-耐高溫淀粉酶（4萬 U/mL）、中性蛋白酶（6萬 U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（10萬 U/mg） 美國Sigma公司；三氯化鉻（CrCl3·6H2O）、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Aldpha1-2LD plus真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 Da）；GDE-CSF6膳食纖維測(cè)定儀（含GDE酶培養(yǎng)消化器和CSF6過濾裝置）意大利VELP公司；FTIR儀 美國Thermo Electron公司；SU1510型SEM 日本日立公司；LC-20AD高效液相色譜、GPC-20A GPC儀、SPM-9500J3 AFM 日本島津公司；TSKgel GMPWXL水相凝膠色譜柱 日本TOSOH公司。

1.3 方法

1.3.1 小米麩皮SDF提取

稱取5.0 g脫脂小米麩皮，按照料液比1∶50加入磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.0（使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液，后同），加入100 μL耐高溫α-淀粉酶，于GDE酶培養(yǎng)消化器中水浴培養(yǎng)25 min，樣品溫度保持在95～100 ℃。調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入100 μL中性蛋白酶溶液，于GDE酶培養(yǎng)消化器中60 ℃條件下處理30 min。調(diào)節(jié)pH值至4.5，加入100 μL淀粉葡萄糖苷酶，于GDE酶培養(yǎng)消化器中60 ℃條件下處理30 min，用碘液檢測(cè)直至不體系變藍(lán)為止。滅酶（大于100 ℃、10 min），將酶解后反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至CSF6過濾裝置中，濾液經(jīng)離心（4 000 r/min、20 min）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原液體積的1/4～1/5，然后用4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液醇沉12 h（4 ℃），4 000 r/min離心20 min，-108 ℃冷凍干燥8 h得到SDF[17-18]。得到小米麩皮SDF含量為18.56 g/100 g。

1.3.2 小米麩皮SDF的純化

準(zhǔn)確稱取小米麩皮SDF 0.5 g，加蒸餾水溶解至100 mL，采用Sevag法脫蛋白，按照V（正丁醇）∶V（三氯甲烷）＝1∶5配制Sevag試劑，加入SDF溶解液體積1/4的Sevag試劑，振搖10 min，離心棄去蛋白層，重復(fù)上述操作10 次[19]。用氨水調(diào)節(jié)小米麩皮SDF溶液pH值至8.5左右，加入體積分?jǐn)?shù)30%雙氧水50 mL進(jìn)行脫色，于40 ℃下保溫60 min，脫色后小米麩皮SDF溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)試劑，裝入14 000 Da透析袋，自來水透析48 h后再用蒸餾水透析24 h。透析后，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4 ℃冰箱中醇沉過夜，再離心分離（9 000 r/min、5 min），沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌兩次，冷凍干燥（真空度0.095 MPa）至恒質(zhì)量，即得純化小米麩皮SDF，備用[20]。

1.3.3 SDF-Cr(III)配合物合成

根據(jù)Wang Cong等[21]的方法適當(dāng)修改合成SDF-Cr(III)配合物。取5 g SDF于200 mL蒸餾水中，70 ℃水浴溶解（約20 min），向SDF溶液中滴加一定質(zhì)量濃度的CrCl3溶液（7.2 mg/mL，共6.5 mL），用2 mol/L HCl溶液或2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0～10.0。在70 ℃下繼續(xù)反應(yīng)120 min。冷卻后離心（5 000 r/min 10 min），經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液液為原體積1/4，加入3 倍體積95%乙醇，4 ℃純沉6 h，離心取沉淀加入少量蒸餾水，透析（每6 h取少量透析液，調(diào)節(jié)pH值至9～10，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%過氧化氫檢測(cè)游離CrCl3殘留量，溶液無黃色時(shí)停止透析），冷凍干燥后獲得SDF-Cr(III)配合物。

將上述凍干SDF-Cr(III)配合物1.0 g溶解于50 mL蒸餾水中，利用分光光度法（600 nm）定量Cr(III)[22]。用不同質(zhì)量濃度CrCl3·6H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Cr(III)的質(zhì)量濃度。SDF-Cr(III)配合物的螯合率按式（1）計(jì)算。

式中：初始鉻質(zhì)量為滴加CrCl3的質(zhì)量；非螯合鉻質(zhì)量通過CrCl3·6H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

使用SEM進(jìn)行SDF和SDF-Cr(III)樣品的形貌和微觀結(jié)構(gòu)研究。將凍干的SDF和SDF-Cr(III)樣品放在雙面膠帶上并噴涂薄金層。在50.0 kV的加速電壓下采集圖像，SEM放大倍數(shù)為1 000[23]。

1.3.5 原子力顯微鏡觀察

將SDF和SDF-Cr(III)分別用去離子水配制為質(zhì)量濃度1 μg/mL。然后，將5 μL超聲（100 W、3 min）分散后的上述溶液滴加到干凈的云母片上，并在環(huán)境氣壓下干燥，使用AFM在室溫下以Tapping模式獲得SDF和SDF-Cr(III)的圖像，并使用SPM-offline 2.2軟件生成三維圖像[24]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

使用FTIR儀進(jìn)行分析，將SDF和SDF-Cr(III)（2 mg）分別與200 mg溴化鉀粉末混合并壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜測(cè)定[24]。

1.3.7 分子質(zhì)量及分布的測(cè)定

稱取60 mg樣品于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相（0.1 mol/L NaNO3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06% NaN3-水溶液）溶解并定容。GPC條件：凝膠色譜柱為TSKgel GMPWXL水相凝膠色譜柱，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.8 高效液相色譜分析

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱取適量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解至各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生處理：精確吸取250 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH溶液、500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，70 ℃反應(yīng)1 h。冷水浴冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，再加入1 mL氯仿漩渦振蕩1 min，3 000 r/min離心10 min，小心取上清液，重復(fù)上述步驟萃取3 次。上清液用于高效液相色譜分析。

待測(cè)樣品水解：精密稱取樣品1.5 g至5 mL安瓿瓶中，加入2.0 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，封管，110 ℃酸解3 h，取出后于干燥箱（79 ℃）揮干三氟乙酸，加2.0 mL水復(fù)溶。

樣品溶液衍生處理：精確吸取250 μL樣品水解復(fù)溶液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH溶液、500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇，70 ℃反應(yīng)1 h。冷水浴冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，再加入1 mL氯仿漩渦振蕩1 min，3 000 r/min離心10 min，小心取上清液，重復(fù)上述步驟萃取3 次。取上清液，即得衍生化樣品。

色譜柱：Xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：250 nm；進(jìn)樣量：20 μL（SDF溶液質(zhì)量濃度1.24 mg/mL、SDF-Cr(III)溶液質(zhì)量濃度1.46 mg/mL）；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 6.70）-乙腈（83∶17，V/V）。

1.3.9 體外抗氧化性分析

1.3.9.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定參照Li等[25]的方法并作適當(dāng)修改。用無水甲醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，用去離子水將樣品分別稀釋為1、2、3、4、5、6 mg/mL，以VC溶液作為陽性對(duì)照。樣品在室溫下避光30 min，517 nm波長處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為1 mL樣品+2 mL DPPH-甲醇溶液的吸光度；A2為1 mL樣品+2 mL甲醇的吸光度；A0為1 mL甲醇+2 mL DPPH-甲醇溶液的吸光度。

1.3.9.2 ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定

ABTS陽離子自由基清除率測(cè)定參照賈雨朦等[26]的方法并作適當(dāng)修改。用2.6 mmol/L K2S2O8溶液配制獲得7.4 mmol/L ABTS溶液，在室溫下避光保存12 h，制得ABTS儲(chǔ)備液。用磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS儲(chǔ)備液直至在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，1 h內(nèi)用于測(cè)定。用去離子水將樣品稀釋為1、2、3、4、5、6 mg/mL，以VC溶液作為陽性對(duì)照，取0.2 mL樣品溶液與1.6 mL稀釋的ABTS儲(chǔ)備液混合，暗處反應(yīng)10 min，于734 nm波長處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。按式（3）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A1為0.2 mL樣品+1.2 mL ABTS稀釋儲(chǔ)備液的吸光度；A2為0.2 mL樣品+1.2 mL無水甲醇的吸光度；A0為0.2 mL無水甲醇+1.2 mL ABTS稀釋儲(chǔ)備液的吸光度。

1.3.9.3 羥自由基清除率的測(cè)定

羥自由基通常通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生[27]，其清除率測(cè)定參照Huang Xiaoqin等[28]的方法并作適當(dāng)修改。稱取一定量的待測(cè)樣品，將其配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6 mg/mL的系列樣品溶液，備用待測(cè)。以VC溶液作為陽性對(duì)照，取1.0 mL待測(cè)樣液，加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL體積分?jǐn)?shù)0.5% H2O2溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，在37 ℃下水浴30 min，于510 nm波長處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。按式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0為空白對(duì)照（不加樣品）在510 nm波長處的吸光度；A1為待測(cè)樣品在510 nm波長處的吸光度。

1.3.9.4 總抗氧化能力測(cè)定

采用鐵離子還原能力法測(cè)定樣品的總抗氧化能力，參照Benzie等[29]的方法并作適當(dāng)修改?？偪寡趸芰y(cè)定溶液由醋酸鹽緩沖溶液（pH 3.6、300 mmol/L）、10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪（40 mmol/L鹽酸溶液配制）和20 mmol/L氯化鐵溶液以體積比10∶1∶1制備。用去離子水將樣品分別稀釋為1、2、3、4、5、6 mg/mL，取100 μL樣液加入5.0 mL總抗氧化能力測(cè)定溶液，37 ℃水浴20 min，593 nm波長處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。配制0.2～0.8 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以FeSO4濃度反映樣品總抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22（Duncan法分析差異顯著性）及Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF-Cr(III)配合物的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

由圖1可知，在相同放大倍數(shù)下，SDF-Cr(III)表面結(jié)構(gòu)疏松，呈現(xiàn)出多孔性，顯示出多孔的致密蜂窩狀外觀，SDF分子在弱堿環(huán)境下，鏈端或支鏈的官能團(tuán)（如羥基、氨基、羧基等）會(huì)由于加入親核試劑而脫水失去氫離子，形成孤電子基團(tuán)，打破原有的分子穩(wěn)定性，這時(shí)加入Cr3+后形成中心配位離子，從而形成穩(wěn)定產(chǎn)物SDF-Cr(III)[29]；SDF呈團(tuán)塊狀，表面較光滑，且無孔洞，表現(xiàn)出分層且緊湊的結(jié)構(gòu)[30]，SDF是由葡萄糖為主要分子枝干形成的大分子結(jié)構(gòu)，一般以氫鍵作用力形成片層鏈狀。兩者結(jié)構(gòu)的變化可能歸因于配位反應(yīng)在堿性條件下糖苷鍵的斷裂和Cr3+與游離出氫離子的SDF孤電子基團(tuán)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生更多小分子單糖、低聚糖或多糖，使SDF碎片化，發(fā)生Cr3+配位反應(yīng)后，使SDF分子空化作用增強(qiáng)，從而暴露出更多活性基團(tuán)，聚合成更小的多糖基團(tuán)，使其結(jié)構(gòu)變得疏松；初步推測(cè)SDF為2D片層結(jié)構(gòu)經(jīng)過絡(luò)合反應(yīng)解聚后重新聚集成3D螺旋狀結(jié)構(gòu)[31]。

圖1 SDF（A）和SDF-Cr(III)SDF-Cr(III)配合物（B）SEM圖Fig. 1 SEM images of SDF (A) and SDF-Cr (III) complexes (B)

2.2 SDF-Cr(III)配合物的原子力顯微鏡分析結(jié)果

AFM是一種可視化的掃描探針顯微鏡，是測(cè)定樣品表面形態(tài)、粒徑和分布的有力工具，這些指標(biāo)與生物分子的功能特性相關(guān)[24,32]。SDF和SDF-Cr(III)的平面圖像和三維AFM圖像如圖2所示。圖2A1和圖2B1分別展示了小米麩皮SDF和SDF-Cr(III)配合物的表面分子形態(tài)，結(jié)果顯示小米麩皮SDF分子表面上有許多聚集體，而SDF-Cr(III)的分子表面上僅有少量的球狀聚集體。圖2A2、A3和圖2B2、B3分別展示了SDF和SDF-Cr(III)的三維結(jié)構(gòu)，SDF表面形貌崎嶇不平，由許多個(gè)不規(guī)則的針狀突起組成，這些突起的末端尖銳，表明SDF的結(jié)構(gòu)單元和多糖類似，是相互分支和連接的。這與SEM觀察結(jié)果相印證。但是，SDF-Cr(III)的表面形貌變得平坦，僅有一些零星的島嶼狀突起，聚集度有所下降，分子間變得更加分散，這與Guo Yiting等[33]研究結(jié)論一致?；谶@些形態(tài)學(xué)特性，推斷由Cr3+引起的聚集變化影響了SDF的構(gòu)象、分子質(zhì)量和生物活性。

圖2 SDF與SDF-Cr(III)配合物AFM圖Fig. 2 AFM images of SDF and SDF-Cr (III) complexes

由圖3可以看出，小米麩皮SDF聚集顆粒顯示出較小的尺寸，高度集中在50～250 nm，絡(luò)合反應(yīng)處理SDF時(shí)，由于弱堿性使SDF解聚，和Cr3+發(fā)生配位聚集作用，在云母片表面形成了分布均勻且較大的納米聚集體。SDF-Cr(III)顆粒的高度分布在50～350 nm。

圖3 SDF與SDF-Cr(III)配合物高度分布的尺寸直方圖Fig. 3 Height distribution of particle sizes of SDF and SDF-Cr (III) complexes

2.3 SDF-Cr(III)配合物的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

小米麩皮SDF和小米麩皮SDF-Cr(III)配合物的FTIR如圖4所示，小米麩皮SDF在3 340 cm-1附近的寬吸收峰歸因于羥基的伸縮振動(dòng)[34]，然而，SDF-Cr(III)配合物在3 340 cm-1處的吸收峰有所減弱并藍(lán)移至3 364 cm-1處，推測(cè)小米麩皮SDF分子上的羥基可能參與和Cr3+配位，導(dǎo)致羥基形成分子間和分子內(nèi)氫鍵能力減弱[35]。此外，小米麩皮SDF-Cr(III)配合物的FTIR在530.27 cm-1出現(xiàn)Cr—O的特征吸收峰[36]。小米麩皮SDF在2 923 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)較弱的吸收峰，這是由υ（C—H）伸縮振動(dòng)所引起，而在1 395 cm-1處的吸收峰是由σ（C—H）的伸縮振動(dòng)所引起。1 617 cm-1處的吸收峰可能與C＝O或σ（—OH）伸縮振動(dòng)有關(guān)[21]，然而，SDF-Cr(III)在1 617 cm-1處的吸收峰明顯有所減弱，且藍(lán)移至1 634 cm-1，推測(cè)C＝O或σ（—OH）可能與Cr3+發(fā)生配位反應(yīng)。SDF在1 089 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，是由C—O—C中C—O的伸縮振動(dòng)和C—O—H的O—H變角振動(dòng)所引起[37]，表明小米麩皮SDF由吡喃糖苷組成，并且SDF-Cr(III)在1 089 cm-1處的吸收峰有所減弱，紅移至1 100 cm-1處，推測(cè)C—O—C中的C—O或C—O—H的O—H在堿性環(huán)境中形成孤電子基團(tuán)，與Cr3+發(fā)生配位反應(yīng)。以上FTIR結(jié)果可以說明小米麩皮SDF的化學(xué)官能團(tuán)和多糖類物質(zhì)及其相似，和多糖一樣能夠發(fā)生鉻離子螯合反應(yīng)[38]。

圖4 SDF、SDF-Cr(III)配合物傅里葉變換紅外光譜掃描圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of SDF and SDF-Cr(III) complexes

2.4 SDF-Cr(III)配合物的分子質(zhì)量分布分析結(jié)果

由圖5可看出，SDF和SDF-Cr(III)在17 min前都有兩個(gè)主要組分的峰（17 min以后的峰是容器或溶劑中的小分子雜質(zhì)峰，不在有效范圍內(nèi)，故不作考慮），SDF在保留時(shí)間為13.393 min時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)峰，峰所占面積為13.65%，分子質(zhì)量為2.43×104Da；保留時(shí)間為15.199 min時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)峰，峰所占面積86.35%，分子質(zhì)量為0.2×104Da。SDF-Cr(III)在保留時(shí)間為13.487 min時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)峰，峰所占面積94.39%，分子質(zhì)量為2.14×104Da；保留時(shí)間為15.155 min時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)峰，峰所占面積5.61%，分子質(zhì)量為0.21×104Da；綜上可知，SDF和SDF-Cr(III)都包含兩部分峰，SDF中分子質(zhì)量0.2×104Da占主體，分子質(zhì)量2.43×104Da占少數(shù)，而SDF-Cr(III)配合物分子質(zhì)量2.14×104Da占主體，分子質(zhì)量0.21×104Da占少數(shù)，說明在絡(luò)合反應(yīng)之前，SDF分子以鏈狀多分支結(jié)構(gòu)連接，而絡(luò)合反應(yīng)以Cr3+為中心離子發(fā)生配位后，使SDF分子聚集在一起，形成三維結(jié)構(gòu)更強(qiáng)的分子結(jié)構(gòu)。也可能是弱堿性的環(huán)境使SDF大分子發(fā)生糖苷鍵斷裂，降解為更多可溶性小分子，當(dāng)加入Cr3+后，與其發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。

圖5 SDF（A）和SDF-Cr(III)（B）配合物的凝膠柱圖譜Fig. 5 Gel permeation profiles of SDF (A) and SDF-Cr(III) complexes (B)

圖6為小米麩皮SDF和SDF-Cr(III)配合物的分子質(zhì)量分布結(jié)果。修飾前后小米麩皮SDF各有兩個(gè)組分，分別為10.11×104～0.52×104、0.64×104～0.03×104Da和306.88×104～0.05×104、27.33×104～0.34×104Da。

圖6 SDF（A）與SDF-Cr(III)配合物（B）的分子質(zhì)量分析圖Fig. 6 Molecular mass analysis of SDF (A) and SDF-Cr (III) complexes (B)

表1為修飾前后小米麩皮SDF的分子質(zhì)量分布結(jié)果。為了比較SDF和SDF-Cr(III)配合物之間的變化，主要看整體峰（不分峰）分子質(zhì)量的變化，出峰越早，分子質(zhì)量越大，計(jì)算得到SDF的mn＝0.195×104Da、mw＝0.940×104Da、D＝4.81，SDF-Cr(III)的mn＝0.742×104Da、mw＝4.708×104Da、D＝6.35。由分布寬度指數(shù)D可知該組分在這一范圍內(nèi)分子質(zhì)量的分布寬度及是否分散均勻，D＜10時(shí)，是均一分子質(zhì)量的聚合物，D＞10且越大表明其分子質(zhì)量分布越寬，分散程度越大，由SDF和SDF-Cr(III)分布寬度指數(shù)D可知，SDF-Cr(III)分子質(zhì)量偏大的分子占主體，分布較寬；然而分子質(zhì)量較小的分子分布寬度指數(shù)接近1，分布較窄；這和分布曲線和微分曲線對(duì)應(yīng)，近似正態(tài)分布。從各峰分布寬度指數(shù)可以看出都小于10，分子質(zhì)量分布較均勻[39]。

表1 SDF與SDF-Cr(III)配合物分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of molecular masses of SDF and SDF-Cr (III) complex

2.5 單糖組成分析結(jié)果

由圖7可知，兩種SDF單糖種類未發(fā)生明顯變化，單糖物質(zhì)的量比有明顯變化，主要的單糖分別為葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、木糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖（SDF-Cr(III)中未檢測(cè)出）、葡萄糖醛酸。如表2所示，SDF-Cr(III)中每一個(gè)單糖相對(duì)含量比SDF都有所增加，其中，葡萄糖相對(duì)含量增加4.11%、半乳糖相對(duì)含量增加4.49%、甘露糖相對(duì)含量增加1.08%、阿拉伯糖相對(duì)含量增加2.12%、半乳糖醛酸相對(duì)含量增加0.65%、木糖相對(duì)含量增加2.12%、鼠李糖相對(duì)含量增加0.41%、核糖相對(duì)含量增加0.19%、葡萄糖醛酸相對(duì)含量增加0.37%，但是改性后SDF-Cr(III)配合物中沒有巖藻糖，可能是其參與了反應(yīng)，發(fā)生降解。造成這種情況的可能原因是螯合反應(yīng)在弱堿性條件下既破壞了SDF分子中雙糖、寡糖、多糖的糖苷鍵，溶解出更多的水溶性小分子單糖、低聚糖或多糖，又使SDF分子中羥基、羧基、氨基等官能團(tuán)游離出氫離子，形成孤電子基團(tuán)，與Cr3+發(fā)生配合反應(yīng)，從而增加了單糖的相對(duì)含量。這與張聰[40]對(duì)苦瓜多糖-Cr(III)配合物的研究結(jié)果一致。此外，結(jié)合分子質(zhì)量顯著增加（從0.940×104Da達(dá)到4.708×104Da）的結(jié)果，初步表明成功合成了一種新型小米麩皮SDF-Cr(III)配合物。

表2 SDF與SDF-Cr(III)配合物單糖含量Table 2 Monosaccharide contents in SDF and SDF-Cr (III) complexes

圖7 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）、SDF（B）與SDF-Cr(III)配合物（C）高效液相色譜圖Fig. 7 High performance liquid chromatograms of mixed monosaccharide standards (A), SDF (B) and SDF-Cr (III) complexes (C)

2.6 體外抗氧化能力分析結(jié)果

由圖8可知，小米麩皮SDF-Cr(III)配合物DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除率以及總抗氧化能力都顯著高于SDF。其中，當(dāng)VC質(zhì)量濃度最低時(shí)，DPPH自由基清除率和羥自由基清除率已經(jīng)達(dá)到最高。當(dāng)質(zhì)量濃度最高時(shí)，SDF-Cr(III)對(duì)DPPH自由基清除率和羥自由基清除率分別達(dá)到78.6%、92.45%，ABTS陽離子自由基清除率和總抗氧化能力分別達(dá)到68.42%、0.68 mol/mL。因?yàn)镾DF-Cr(III)配合物由單糖組分可知較SDF有更多的還原糖和糖醛酸，同時(shí)SDF-Cr(III)配合物結(jié)構(gòu)疏松多孔。Yan Jingkun等[41]認(rèn)為SDF的抗氧化活性與碳水化合物中的還原糖、糖醛酸含量、分子質(zhì)量大小以及結(jié)構(gòu)有關(guān)?？偪寡趸芰y(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到最大時(shí)，SDF和SDF-Cr(III)的FeSO4當(dāng)量濃度分別為0.34、0.68 mol/mL，SDF-Cr(III)的總抗氧化能力顯著高于SDF。這可能與半乳糖和巖藻糖的含量有關(guān)，這與張啟月[42]的研究結(jié)論一致。Su Yue等[43]證實(shí)4 種木耳多糖的巖藻糖和半乳糖含量會(huì)同時(shí)影響樣品的總抗氧化能力，并且總抗氧化能力與巖藻糖含量顯著負(fù)相關(guān)，與半乳糖含量負(fù)相關(guān)。結(jié)合自由基學(xué)說，巖藻糖和半乳糖含量增多，導(dǎo)致自由基累積，自由基過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化作用失衡，引起氧化應(yīng)激。SDF-Cr(III)配合物中Cr3+具有清除活性氧或活性氮等自由基能力，從而可以提高某些酶活力，間接提高總抗氧能力。制備SDF-Cr(III)配合物的目的是引入活性因子Cr3+，清除累積的自由基，從而達(dá)到緩解氧化應(yīng)激，提高總抗氧能力的目的。

圖8 SDF與SDF-Cr(III)配合物體外抗氧化能力Fig. 8 In vitro antioxidant capacity of SDF and SDF-Cr (III) complexes

3 結(jié) 論

本研究合成得到了小米麩皮SDF-Cr(III)配合物，利用SEM、FTIR、AFM對(duì)小米麩皮SDF和SDF-Cr(III)配合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。SEM結(jié)果表明：SDF呈團(tuán)塊狀，表面較光滑且無孔洞，表現(xiàn)出分層且緊湊的結(jié)構(gòu)；SDF-Cr(III)表面結(jié)構(gòu)疏松，顯示出具有多孔的致密蜂窩狀外觀。AFM結(jié)果表明：SDF的表面形貌崎嶇不平，由許多個(gè)不規(guī)則的針狀突起組成，表面形貌變得平坦，有一些零星的島嶼狀突起，聚集度有所下降，分子間變得更加分散均勻；SDF顆粒的高度為50～250 nm，SDF-Cr(III)顆粒的高度為50～350 nm。FTIR結(jié)果表明：羥基、酯基、羰基等活性官能團(tuán)伸縮振動(dòng)減弱，特征吸收峰位置發(fā)生藍(lán)移，在530.27 cm-1處有Cr—O伸縮振動(dòng)，表明SDF與Cr3+結(jié)合形成配合物。采用常溫GPC和高效液相色譜分析了小米麩皮SDF和SDF-Cr(III)配合物分子質(zhì)量分布及單糖組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SDF與Cr3+發(fā)生配位反應(yīng)后，SDFmn＝0.195×104Da、mw＝0.940×104Da、D＝4.81，SDF-Cr(III)mn＝0.742×104Da、mw＝4.708×104Da、D＝6.35，表明SDF分子聚集在一起，形成三維結(jié)構(gòu)更強(qiáng)的分子結(jié)構(gòu)；SDF-Cr(III)單糖相對(duì)含量高于SDF。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，SDF-Cr(III)具有較好的DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、羥自由基清除能力和總抗氧化能力。綜上，初步認(rèn)為小米麩皮SDF-Cr(III)配合物具有進(jìn)一步研究的價(jià)值，可用于開發(fā)降糖醫(yī)藥保健品。