劉 婷，羅 弦，劉 竹，許丹迪，劉蕾穎，譚曉秋，李 濤

1.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心（瀘州 646000）

心律失常是臨床上常見且復(fù)雜的心血管疾病，并隨年齡增加發(fā)病率增高。心律失常容易合并或繼發(fā)心力衰竭、心肌肥大、心肌缺血等心血管疾病，最終導(dǎo)致患者暈厥、心臟驟停，甚至心源性猝死[1]。臨床上按心律失常發(fā)作時心率的快慢分為快速性和緩慢性心律失常兩大類，前者常見于過早搏動、心動過速、心房顫動和心室顫動等；后者常見于竇性緩慢性心律失常和各種傳導(dǎo)阻滯等。目前心律失常的治療仍然是臨床上的一大難題，發(fā)生發(fā)展過程中存在復(fù)雜的電生理與結(jié)構(gòu)重構(gòu)改變，這是因為對心律失常疾病的發(fā)生發(fā)展機制認知還存在嚴重不足。研究證明，心肌細胞的氧化應(yīng)激與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[2]。因此，探索心臟氧化應(yīng)激的調(diào)控機制，有助于探討心律失常的發(fā)生機制及尋找新的干預(yù)靶點，對于預(yù)防和治療心律失常具有重要的理論基礎(chǔ)和臨床意義。

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)堆積的一種負面反應(yīng)，被認為是導(dǎo)致疾病的一個重要因素[3]。目前越來越多的證據(jù)顯示，氧化應(yīng)激參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。

異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）是合成的兒茶酚胺，屬于非選擇性的β受體激動劑，在心血管功能的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4]。但是，ISO 對心肌組織氧化應(yīng)激的研究不全面。本研究通過觀察ISO 對線粒體相關(guān)指標的影響，評估ISO 在線粒體通路中影響氧化應(yīng)激的調(diào)控，進一步探討ISO 對小鼠心肌氧化應(yīng)激的作用機制，為臨床應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

C57 雄鼠由西南醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，20～22 g，所有的動物操作符合西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理要求（201903-259）。小鼠腹腔注射ISO，劑量為10 mg/kg。

1.2 心電圖記錄

將小鼠放進氣體麻醉盒里，異氟烷麻醉后，小鼠仰臥位固定。將電極一端插入小鼠四肢末端的皮下，另一端與心電換能器相連接；右上肢為I導(dǎo)聯(lián)、左上肢為Ⅱ?qū)?lián)、右下肢為III導(dǎo)聯(lián)、左下肢為AVF導(dǎo)聯(lián)；AcqKnowledge 4.4 軟件采集小鼠心電數(shù)據(jù)，記錄注射ISO 前后的心電圖。接下來對小鼠進行程序性電刺激pacing起搏，對小鼠行氣管插管，并接上小動物呼吸機。開胸后暴露心臟，并在小鼠左心室位置安放刺激電極，調(diào)整電子刺激器（Nihon Kohden Corporation），開始Pacing 并使用AcqKnowledge 4.4 軟件采集數(shù)據(jù)和記錄Pacing起搏后的心電圖及誘發(fā)的室性心律失常（ventricular tachycardia，VT）情況[5]。

1.3 光標測

將小鼠頸椎脫臼法處死后，取出心臟，將主動脈固定在Langendorff灌流系統(tǒng)。先用PSS心臟灌流10 min 后，再用10 μM 的停搏劑Blebbistatin 灌流大約10 min，觀察到離體心臟停止舒縮活動。取1μM 的RH237 電壓敏感染料循環(huán)灌注染色10 min 后，繼續(xù)循環(huán)灌注停搏劑。

使用Spik2軟件編輯所需刺激方案，電刺激調(diào)整至5 V。刺激波寬2 ms，刺激頻率為10 Hz。使用Meta Morph 軟件設(shè)置信號采集參數(shù)曝光時間為0.9 ms，像素面積為32×32 μm。調(diào)整激發(fā)波長為525 nm 的LED 燈，使其聚焦于心臟上。心尖部進行電刺激，同時打開激發(fā)光源，開始信號采集。信號記錄采集結(jié)束后，給予1 μM ISO灌流1 min后，重復(fù)上述的刺激方案和記錄信號[6-7]。

1.4 取材

小鼠隨機分為未注射組（CON 組）和腹腔注射組（ISO組），快速解剖取心臟，用預(yù)冷的PBS液清洗殘留血液，濾紙拭干稱重，將心肌組織剪碎，轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器，按1∶10 比例加入預(yù)冷的PBS 液，用玻璃研磨器進行勻漿。將勻漿后組織分成三份進行線粒體指標的檢測。

1.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測

按照試劑盒說明書（英濰捷基，C10444），將100μL 的勻漿液4 ℃，5 000 rmp 離心5 min，棄上清。沉淀中加入240μL PBS 重懸混勻，再加入60μL ROS熒光染料，混勻，37 ℃避光孵育30 min。4 ℃，5 000 rmp離心5 min后，棄上清。用PBS洗滌三次，去除多余的熒光染料。最終重懸于300μL 的PBS 中，將懸液加入96 孔板中，每孔100μL，立即用酶標儀檢測熒光強度。

1.6 ATP(ade nosine triphosphate，ATP)檢測

按照試劑盒說明書（英濰捷基，A22066），將200μL 的懸液超聲波破碎2 min，4 ℃，5 000 rmp 離心5 min，取上清進行ATP 檢測，在96 孔板中加入90μL ATP 檢測工作液，10μL 勻漿離心后的上清液，用酶標儀檢測化學(xué)發(fā)光值。

1.7 線粒體呼吸鏈復(fù)合物I檢測

按照試劑盒說明書（南京建成，A089-1-1），在96 孔板中加入156 μL 反應(yīng)液A，20 μL 反應(yīng)液B，4μL反應(yīng)液D，37 ℃孵育3 min后加入20μL勻漿離心后的上清液。用酶標儀檢測OD340 處的吸光值，分別檢測基礎(chǔ)值和反應(yīng)1 min后的值，根據(jù)說明書公式換算復(fù)合物的活性單位。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，自身對照采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P ＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 ISO處理后小鼠的心率增快及VT發(fā)生率增加

C57小鼠腹腔注射ISO前后相比，注射ISO后的C57 小鼠的心率在短時間內(nèi)明顯增快，小鼠心率由415.1 ± 28.54 次/min升高到532.8 ± 14.33 次/min，P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，見圖1。在程序性電刺激下，注射ISO后的C57小鼠，室性快速性心律失常的發(fā)生率明顯增高，未注射組的VT 發(fā)生率為3/22，注射ISO 后小鼠的VT 增加為7/22，P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2。因此，注射ISO后C57小鼠的心室電穩(wěn)定性減弱。

圖1 小鼠腹腔注射ISO后的心率變化

圖2 小鼠心臟刺激后，誘發(fā)VT的情況

2.2 ISO 通過線粒體途徑影響心肌的氧化應(yīng)激

與對照組相比，ISO組ROS的熒光強度由2 509±148.2（N=3）升高到3 514±40.88（N=3），P ＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)差異，表明ISO 組心臟氧化應(yīng)激程度加重，見圖3A。與對照組相比，ISO 組ATP 化學(xué)發(fā)光值由65.67±7.688（N=3）降低至22.67±2.728（N=3），P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)差異，表明ISO 組心肌組織ATP 產(chǎn)量降低，見圖3B。與對照組相比，ISO 組線粒體復(fù)合物I 的活性由0.09333± 0.005364（N=3）降低至0.06367±0.004256（N=3），P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，表明線粒體呼吸鏈受到抑制，見圖3C。

圖3 CON組與ISO組線粒體ROS濃度、ATP含量及呼吸鏈復(fù)合物I的變化

2.3 ISO引起心臟的動作時程縮短

光標測檢測結(jié)果顯示ISO 灌流之后，APD80 時程由30.85±1.880 ms（N=3）縮短至20.65±1.512 ms（N=3），P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，如圖4所示。

圖4 心臟在10Hz刺激下，ISO處理后心電活動的變化

3 討論

異丙腎上腺素是合成的兒茶酚胺，結(jié)構(gòu)上類似于內(nèi)源性腎上腺素和去甲腎上腺素，具有強烈的非選擇性激動β受體。激動心臟β1受體，可以使心肌收縮力增強、心率加快，收縮期和舒張期縮短。激動β2受體使骨骼肌血管舒張，也有舒張冠狀血管和增加組織血流量的作用。除了激動心臟的β2 受體，還可舒張支氣管平滑肌，并具有抑制組胺等過敏性物質(zhì)釋放的作用，增加肝糖原、肌糖原分解，增加組織耗氧量。異丙腎上腺素還可以升高血中游離脂肪酸，作用機制與腎上腺素相似，而升高血糖作用較弱?？傊惐I上腺素在心血管功能的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素處理之后，不僅小鼠心率增加，還會導(dǎo)致小鼠快速起搏之后，VT 的發(fā)生率明顯增加，這也說明小鼠注射異丙腎上腺素后，小鼠的心室電穩(wěn)定性減低。

急性異丙腎上腺素注射可以引起心肌細胞耗氧量增加，產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加。氧化應(yīng)激反應(yīng)不僅可以直接損傷心肌細胞，也能影響線粒體代謝功能，進一步加重心肌損傷[10-11]。線粒體是真核生物重要的細胞器，其主要的功能是參與心肌細胞能量代謝、氧化應(yīng)激以及程序性細胞死亡過程，其功能障礙與心肌肥厚、心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，線粒體對保障心肌細胞的生存和維持心臟正常功能具有重要意義[12-13]。

在健康狀態(tài)下，機體的生命活動所需的能量都以ATP 的形式來提供，因此ATP 是機體直接的能量供體。線粒體作為心肌細胞內(nèi)部的能量工廠，是產(chǎn)生和釋放ATP的場所。活性氧包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。線粒體的能量供應(yīng)依賴于呼吸鏈復(fù)合酶產(chǎn)生的，它們利用電子傳輸過程中釋放的自由能將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移到間隙，可以促進能量的產(chǎn)生及傳遞[14]。

線粒體氧化應(yīng)激不僅參與多種生理和病理過程，包括衰老、基因突變、炎癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等，還參與了心臟發(fā)育和心臟疾病的發(fā)生[15-16]。心臟是終末分化的器官，心肌細胞幾乎沒有復(fù)制和再生的潛力。因此，細胞穩(wěn)態(tài)的精確調(diào)節(jié)和充足的氧供對于心肌細胞的存活和功能至關(guān)重要。由于心肌細胞具有較差的再生能力和對氧供的依賴，因此特別容易受到線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。心臟壓力超負荷或心肌缺血會導(dǎo)致心肌細胞氧化應(yīng)激、能量缺乏、鈣超載和炎癥反應(yīng)，這些都會破壞線粒體功能并誘發(fā)線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)。嚴重的線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致心臟疾病的發(fā)生，動脈粥樣硬化、高血壓、缺血性心肌病、糖尿病性心臟病、心率失常及心力衰竭等心臟疾病的發(fā)生發(fā)展都與線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[17-18]。因此，在一定程度上，通過對線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)通路的干預(yù)可以產(chǎn)生對心肌細胞的保護作用[19-22]。

心律失常的發(fā)生與氧化應(yīng)激ROS 產(chǎn)物表達增加有關(guān)，降低ROS產(chǎn)物表達的水平可降低心律失常的發(fā)生率。其中心房顫動是最常見的快速型的心律失常，有研究發(fā)現(xiàn)與正常竇性心律的相比，心房顫動患者心房組織中ROS 相關(guān)蛋白的表達上調(diào)[23-24]。本研究也證實線粒體氧化應(yīng)激與心律不齊有關(guān)，ROS表達增加可能加速快速心律失常的發(fā)展。

本實驗室特聘教授、牛津大學(xué)雷鳴博士等最近在《Circulation》上提出，將抗心律失常藥物在原來分類的基礎(chǔ)上進行了補充和完善，未來離子通道上游信號調(diào)控是心律失常治療的重要策略之一[25]。本課題關(guān)注線粒體功能障礙，從氧化應(yīng)激反應(yīng)角度研究其心律失常中的作用，為快速性心律失常的發(fā)病機制尋找治療靶點提供新觀點和新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，在ISO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下，線粒體膜通透性增加，從而導(dǎo)致ATP產(chǎn)生過程受到影響，線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性降低，ROS含量增加，這與既往的研究結(jié)論是相符的。在本研究中，我們還觀察了ISO 對心臟電活動的影響，發(fā)現(xiàn)ISO 可以增加心率，動作電位時程縮短，心臟快速起搏之后，VT的發(fā)生率明顯增加。

4 結(jié)論

ISO是通過線粒體途徑影響心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而增加室性快速性心律失常的發(fā)生率，其中具體的分子機制還需要更深入的研究，為臨床預(yù)防和治療心血管疾病提供理論依據(jù)。