賽文莉，姚 敏，姚登福

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心（南通226001）；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系（南通 226001）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一。HCC 發(fā)生的主要病原學(xué)因素與慢性持續(xù)性乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）感染，非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）及毒物攝入等密切相關(guān)[1-3]，為多基因參與、多階段進(jìn)展的肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。其機(jī)制復(fù)雜，早期診斷難，治療效果不理想，預(yù)后差[4-5]。臨床與基礎(chǔ)的最新研究顯示，鋅指蛋白家族（zinc finger proteins，ZNFs）是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，是參與調(diào)控細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和多種疾病相關(guān)的功能性蛋白質(zhì)[6]。復(fù)雜的ZNFs及其多達(dá)18種的Krüppel-like轉(zhuǎn)錄因子（KLFs）異常與多種腫瘤進(jìn)展[7]。作為轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控細(xì)胞周期和增殖分化，在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或HCC 進(jìn)展中，已發(fā)現(xiàn)有多種ZNFs 和至少7 種KLFs參與HCC 細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[8]。本文綜評了HCC 進(jìn)展密切相關(guān)ZNFs 和KLFs 研究的新進(jìn)展。

1 ZNFs/KLFs結(jié)構(gòu)與功能

由2%人類基因編碼ZNFs具豐富生物多樣性功能，參與調(diào)控細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，參與多種腫瘤進(jìn)展[8]。除與DNA 結(jié)合外，也與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用的能力[9]。依據(jù)鋅指半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基所圍繞Zn2＋空間構(gòu)型，可將ZNFs 分為C2H2樣（C2H2like）、塞結(jié)狀（Gag knuckle）、高音譜號（treble clef）、帶 狀（Zinc ribbon）、Zn2/Cys6型（Zn2/Cys6）、TAZ2樣（TAZ2domain like）、短Zn2＋結(jié)合環(huán)（short Zinc binding loops）和金屬硫蛋白（metallothio?nein）等8 種[6]。廣泛研究的是C2H2型，其蛋白羧基端以線性重復(fù)排列，除串聯(lián)鋅指結(jié)構(gòu)外含Krüppel相關(guān)保守盒（Krüppel-associated box）、痘病毒鋅指（poxvi?rus zinc finger）等功能域[7]。KLFs含17個成員（KLF1～17）由73個氨基酸組成，羧基端含3個保守C2H2結(jié)構(gòu)域，鋅指含23～25個氨基酸，不同成員間高度保守，可激活/抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，優(yōu)先與“GC box”或“CACCC”位點結(jié)合，含與靶DNA結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域[10-11]。

ZNFs含通過結(jié)合Zn2+穩(wěn)定的短的可自我折疊形成“手指”結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基酸模板，相隔特定距離的胱氨酸結(jié)合鋅指，因其自身結(jié)構(gòu)特點可選擇性結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)[12-13]，與靶分子DNA、RNA、DNA-RNA 序列特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控靶向基因表達(dá)，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。KLFs通過多種調(diào)控機(jī)制對靶基因進(jìn)行激活或抑制，控制靶基因表達(dá)，功能異同，可分為：①與羧基末端結(jié)合蛋白（Ctbp）相互作用的轉(zhuǎn)錄抑制因子KLF3、KLF8和KLF12；②結(jié)合去乙酰酶的轉(zhuǎn)錄激活因子KLF1～2、KLF4～7；③與共同轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子sin3A 相互作用而產(chǎn)生抑制因子KLF9～11、KLF13～14和KLF16[6，16-17]。KLFs 可調(diào)節(jié)生長、發(fā)育、分化、增殖和胚胎發(fā)育等，通過多種調(diào)控機(jī)制激活或抑制靶基因表達(dá)，具有相對組織特異性，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和新血管生成，或與不同啟動子結(jié)合后異常轉(zhuǎn)錄，從而影響腫瘤的生物行為[18-19]。

2 腫瘤相關(guān)ZNFs/KLFs表達(dá)與調(diào)控機(jī)制

ZNFs/KLFs分布于人體多種組織，在前列腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、腸癌、膀胱癌、乳腺癌和宮頸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮促癌或抑癌作用[20-25]。睪丸組織表達(dá)的ZNF165 為組織特異性抗原（CT-Ag），但三陰性乳腺癌（TNBC）中見CT-Ag表達(dá)，與SMAD3結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β依賴基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)TNBC 細(xì)胞增殖和腫瘤生長[26]。原發(fā)性結(jié)腸癌中ZNF281表達(dá)在腫瘤進(jìn)展過程中增加，并與復(fù)發(fā)相關(guān)，ZNF281 是EMT 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個組成部分，它有助于結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移形成[27]。膀胱癌中ZNF165 mRNA和蛋白均過表達(dá)，可作為一種新的診斷生物標(biāo)志物或用于發(fā)展膀胱腫瘤特異性免疫治療的靶點。KLF6在前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、肝癌等中是一種腫瘤抑制因子，不同剪接變異體可在不同腫瘤起源、發(fā)展過程中發(fā)揮作用[28-29]。

ZNFs 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能巨大，調(diào)控機(jī)制形式多樣[12，30]，如C2H2型ZNF 在HCC 進(jìn)展中調(diào)控可歸類①轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：ZNFs 基因啟動子CpG 島區(qū)域被甲基化，從而抑制ZNFs 基因轉(zhuǎn)錄；②轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控：ZNFs 蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)差異由癌癥相關(guān)的miRNA 調(diào)控；③翻譯后水平調(diào)控：不同的環(huán)境刺激會激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，使ZNFs 發(fā)生翻譯后修飾，如乙酰化、磷酸化等，PTMs 調(diào)控影響ZNFs蛋白與其他蛋白和靶基因DNA結(jié)合的能力；④與序列特異性DNA結(jié)合水平調(diào)控：ZNFs以不同結(jié)構(gòu)域或蛋白翻譯后修飾（protein post-translational modifica?tions，PTMs）結(jié)合方式招募相互作用蛋白[31]，包括轉(zhuǎn)錄輔助激活因子/輔助抑制因子、染色質(zhì)修飾因子和其他轉(zhuǎn)錄因子，最終與序列特異性DNA結(jié)合激活或抑制下游基因調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移，且不同調(diào)控層次致ZNFs 在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制異同[32]。

3 ZNFs/KLFs對HCC的促進(jìn)作用

ZNFs/KLFs 表達(dá)在HCC 進(jìn)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用，包括轉(zhuǎn)錄輔助激活因子/輔助抑制因子、染色質(zhì)修飾因子和其他轉(zhuǎn)錄因子，最終與序列特異性DNA 結(jié)合激活下游基因調(diào)控癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)侵襲或轉(zhuǎn)移等，肝癌相關(guān)ZNFs/KLFs的促進(jìn)作用歸納詳見表1。

表1 幾種肝癌相關(guān)ZNFs/KLFs的促癌作用[33-48]

3.1 促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

由12個鋅指結(jié)構(gòu)域組成的ZNF233在HCC組織中顯著過表達(dá)，與患者的腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)，細(xì)胞研究證實敲除ZNF233基因可抑制癌細(xì)胞增殖[30]；定位于1號染色體的ZNF281（ZBP99）由Snail 和miR-34a/b/c共同調(diào)控，參與胚胎干細(xì)胞分化與組織發(fā)育，其表達(dá)促HCC 增殖與轉(zhuǎn)移有關(guān)；沉默ZNF281顯著下調(diào)炎癥介質(zhì)（IL-8，IL-1 β，IL-17，IL-23）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）信號、TIMP-1、纖維連接蛋白和α-SMA 表達(dá)，EMT 誘導(dǎo)因子Snail 直接誘導(dǎo)ZNF281轉(zhuǎn)錄，抑制miR-34a/b/c，緩解ZNF281mRNA被miR-34 下調(diào)[34]。HCC 組織ZNF384 表達(dá)，上調(diào)Cy?clin D1促HCC細(xì)胞增殖，且與腫瘤復(fù)發(fā)和總體生存率差明顯相關(guān)[35]。ZNF191 與Wnt8B 啟動子nt1491（ATTAATT）和nt1178（ATTC ATT）結(jié)合，經(jīng)Wnt 通路促進(jìn)HCC增殖；HCC組織中ZNF143過表達(dá)，通過與序列特異性DNA結(jié)合，具轉(zhuǎn)錄因子活性在體內(nèi)外促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、集落形成和腫瘤生長[36-37]。肝癌ZNF267、ZNF217 和ZNF667 過表達(dá)，通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[38-40]；KLF5過表達(dá)上調(diào)CD44 使HCC 細(xì)胞耐藥，小干擾RNA 敲除KLF5，影響HCC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為[41]。

3.2 阻斷促凋亡信號

ZNF32 定位于10q23-q24 染色體區(qū)域，在HCC顯著上調(diào)，在活性氧（ROS）下SP1 靶向激活ZNF32轉(zhuǎn)錄、靶基因補(bǔ)體1q結(jié)合蛋白（C1QBP）活化逃避氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡；ZNF689 具有致瘤性，與轉(zhuǎn)錄輔助阻遏物TIF1β相互作用，通過抑制Bak/Bax/Bid 通路阻斷促凋亡信號，其表達(dá)與瘤體大小、包膜浸潤及微血管浸潤顯著相關(guān)；ZNF689過表達(dá)者總生存時間短、預(yù)后差[42-43]。

3.3 促新血管生成與復(fù)發(fā)

HCC 組 織ZNF687 為C2H2型，其上調(diào)活化NF-kB 靶基因參與調(diào)節(jié)新血管生成[44]。KLF8 為促癌基因，肝癌KLF8 表達(dá)與MMP-9 正相關(guān)，MMP-9 是KLF8 下游靶基因，KLF8 表達(dá)致MMP-9 增加，促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移，KLF8 通過PI3K/AKT 通路誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)，可活化Wnt/β-catenin 通路參與肝癌浸潤和轉(zhuǎn)移，Wnt3a可刺激KLF8表達(dá)；另KLF8表達(dá)提高β-catenin 對T-cell factor 4 的招募能力，誘導(dǎo)下游靶基因c-Myc、cyclin D1 及Axin1 活化，促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)[45-46]。

3.4 其它作用

胚胎干細(xì)胞（ESC）和造血干細(xì)胞中ZFX 高表達(dá)，在51.8%肝癌過表達(dá)，體外細(xì)胞水平上，沉默ZFX 基因轉(zhuǎn)錄使癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1 期阻滯，而抑制HCC細(xì)胞的自我更新、集落形成和細(xì)胞增殖能力，使HCC對順鉑藥物敏感性增加；ZFX與Nanog和Sox-2啟動子結(jié)合后在HCC細(xì)胞中過表達(dá)，體內(nèi)移植模型顯示ZFX過表達(dá)促進(jìn)HCC生長，顯示肝癌細(xì)胞具有干性和多功能性[47]。HCC中表達(dá)的ZNF165核苷酸序列與睪丸中ZNF165相同，以重組ZNF165，測定HCC患者ZNF165，僅5%患者血清檢到ZNF165 抗體，表明ZNF165 為新的CT 抗原，引起體液免疫反應(yīng)參與腫瘤生物學(xué)[48]。

4 ZNFs/KLFs對HCC的抑制作用

同樣，龐大的ZNFs/KLFs 表達(dá)在HCC 進(jìn)展過程中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制、激活下游抑癌基因、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活P53、抑制相關(guān)通路關(guān)鍵信號分子阻止癌細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化，對HCC 侵襲或轉(zhuǎn)移等具有抑制作用，臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)的主要相關(guān)ZNFs/KLFs，見表2。

表2 幾種肝癌相關(guān)ZNFs/KLFs的抑癌作用[49-60]

4.1 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

ZNF307（ZKSCAN4、ZSCAN36 和ZNF427）顯著下調(diào)，作為一種腫瘤抑制劑通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制癌細(xì)胞增殖。HCC 組織和細(xì)胞中ZNF307 過表達(dá)，調(diào)控凋亡關(guān)鍵因子如caspase-3、BAX 和BCL-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[49]。ZBP89（ZNF148、BFCOL1和BERF-1）與Bak 啟動子靶向結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，抑制干性細(xì)胞更新，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[50]。KLF9為抑癌基因，在肝癌組織表達(dá)下調(diào)。KLF9直接結(jié)合p53啟動子近端區(qū)域內(nèi)GC盒穩(wěn)定p53，其藥理學(xué)或遺傳活化對HCC可能具有治療作用，對SK-Hep1和HepG2細(xì)胞生長有明顯抑制作用，并致細(xì)胞凋亡[51]。位于19q13.13號染色體上ZNF545過表達(dá)，可抑制肝癌Snur449和Huh7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞G1/S期阻滯和凋亡，體內(nèi)、外研究證實其機(jī)制為抑制NF-KB 活化、細(xì)胞增殖和移植瘤生長[52]。

4.2 抑制相關(guān)通路信號分子

ZNF774是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，親和純化偶聯(lián)質(zhì)譜法顯示ZNF774與胞中Mi-2/核小體重構(gòu)和去乙酰化酶復(fù)合物（NuRD）有關(guān)聯(lián)，全基因組鑒定ZNF774/NuRD 復(fù)合體表明，ZNF774 抑制含notch2 肝癌生長和遷移密切相關(guān)基因，體外抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲，體內(nèi)抑制癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。ZNF774明顯下調(diào)與高notch2 表達(dá)、晚期病理分期及患者總體生存率低密切相關(guān)，提示ZNF774/NuRD-notch 2 軸在肝癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用[53]。KLF10 或稱轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)早期基因1（TIEG1），為含三C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)域的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與DNA 上特異性蛋白1（SP1）位點結(jié)合并與其他調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子相互作用促進(jìn)/抑制基因表達(dá)，具有抗增殖作用，誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[54]。

4.3 抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移

抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)。位于19q13.13 號染色體ZNF382，在HBV 陰性肝組織和HBV 感染肝硬化組織中表達(dá)顯著增高，是mir-6867靶標(biāo)，作為一種潛在癌細(xì)胞抑制因子，可激活蛋白1（AP-1）和Wnt/β-catenin 通路活化，激活p53表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡，抑制原癌基因FOS和JUN等下游靶點發(fā)揮作用，抑制裸鼠癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移、侵襲和致瘤潛能，抑癌基因ZNF382在HBV相關(guān)HCC 中受表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)[55]。CD9 和CD81 是KLF4 轉(zhuǎn)錄靶點，調(diào)控KLF4-CD9/CD81-jnk 信號通路，有望抑制HCC發(fā)展[56]。轉(zhuǎn)化生長因子β-1（TGF-β 1）/Smad 信號通路在腫瘤抑制中起重要作用，KLF17調(diào)控Smad3依賴途徑增強(qiáng)TGF-β1/smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤生長關(guān)鍵環(huán)節(jié)。沉默KLF17 可降低Smad 結(jié)合元件上Smad3-DNA 形成，影響TGF-β1/Smad靶基因表達(dá)，調(diào)控該通路經(jīng)EMT抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移[57]。

4.4 其它作用

由4 個外顯子構(gòu)成的KLF6 位于10p15，含有3個剪接變異體（SV1、SV2、SV3）。KLF6為癌胚抗原具有轉(zhuǎn)錄激活功能，不同剪接變異體在腫瘤中發(fā)揮不同作用；肝癌中KLF6 SV1為促癌基因，KLF6 SV2是抑癌因子，分別發(fā)揮促癌細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞增殖或凋亡作用[58-59]。脂肪生成被認(rèn)為是肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵，ZHX2 為新生脂肪形成的重要抑制因子，異位表達(dá)顯著抑制HCC 新脂肪生成，降低FASN、ACL、ACC1 和SCD1 轉(zhuǎn)錄，與脂肪調(diào)控因子SREBP1c 呈負(fù)相關(guān)。沉默或過表達(dá)ZHX2，轉(zhuǎn)錄水平上增加mir-24-3p 作用于SREBP1c 靶點致其降解，提示ZHX2 抑制肝癌進(jìn)展新機(jī)制，可為HCC 治療提供新策略[60]。

5 ZNFs/KLFs分析的臨床價值

肝癌相關(guān)ZNFs/KLFs 基因轉(zhuǎn)錄異常，在肝癌組織或循環(huán)血中的表達(dá)水平改變，有助于良惡性肝病診斷、HCC預(yù)后判別或分子靶向治療。

5.1 良、惡性肝病鑒別

肝癌ZNF191 過表達(dá)直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在HCC 增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]；KLF4 為誘導(dǎo)HCC分化介質(zhì)，可提高HCC 預(yù)測準(zhǔn)確性[61]；KLF5 轉(zhuǎn)錄因子在良、惡肝病中的表達(dá)存在顯著差異，有助于良、惡性肝病的診斷與鑒別診斷，初步臨床應(yīng)用（待發(fā)表資料），顯示可特異診斷HCC，優(yōu)于常規(guī)AFP分析。

5.2 預(yù)后標(biāo)志物

肝癌患者組織或血ZNF281、ZNF384、KLF5 等表達(dá)升高，與瘤體大小、腫瘤分期、腫瘤復(fù)發(fā)及血管侵襲性等呈正相關(guān)，與患者的總體生存率差相關(guān)；HCC 組織KLF4 和Sp1 表達(dá)與腫瘤分化顯著相關(guān)；KLF6 與HCC 患者淋巴血管空間侵襲呈負(fù)相關(guān)，KLF6 陰性患者生存時間短。KLF17 是抑癌基因，能與突變型p53 形成復(fù)合物抑制HCC 患者的EMT 形成。HCC 中ZFHX3 上調(diào)，是HIF-1a/VEGFA 的血管生成因子所必需，可見ZNF281、ZNF384、KLF5 等表達(dá)升高，與瘤體大小、腫瘤分期、腫瘤復(fù)發(fā)及血管侵襲性等相關(guān)，與患者總體生存率相關(guān)，可作為HCC預(yù)后標(biāo)志物[34-35，41，58]。

5.3 分子靶標(biāo)

ZNF267參與調(diào)控發(fā)育、增殖和分化等生物學(xué)過程，在肝硬化及癌組織均升高，靶向ZNF267 可抑制HCC 增殖和遷移[38]。ZNF191 與Wnt8b mRNA 啟動子ATTAATT（nt-1491）和ATTCATT（nt-1178）結(jié)合，直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄，在HCC 進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。KLF6過表達(dá)抑制了異種移植腫瘤的生長，在體外和體內(nèi)抑制HCC生長和侵襲，具抑癌功能可能用于預(yù)防和治療[58]。KLF5激活PI3K/AKT/Snail通路誘導(dǎo)EMT發(fā)生，是調(diào)控HCC中CSCs關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[41]。KLF8激活wnt/β-連環(huán)蛋白促干細(xì)胞樣，靶向KLF8可抑制HCC[45]。另ZHX2 表達(dá)增加miR-24-3p，可靶向SREBP1c 抑制HCC進(jìn)展[60]。位于20q13的ZNF217基因與miR101結(jié)合，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖與侵襲，以及ZNF23等調(diào)控HCC增殖和分化，均可望成為HCC治療靶點[30，39，62]。

6 展望

ZNFs/KLFs作為人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與了人體多種生物學(xué)過程，在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移，發(fā)揮促癌/抑癌作用。現(xiàn)有資料顯示ZNFs/KLFs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，與HCC關(guān)系密切，已引起醫(yī)學(xué)界的高度重視，但因該家族相關(guān)分子種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，隨著對該家族相關(guān)因子研究的深入，解析HCC 發(fā)病機(jī)制和論證有價值的關(guān)鍵ZNFs/KLFs 分子，將有助于HCC 早期診斷和預(yù)后判斷，以及特異分子靶向干預(yù)技術(shù)開發(fā)與臨床應(yīng)用。