張欣雨，王智宇，趙文元，馬保錄，陶 濤

(1.青海省交通醫(yī)院泌尿外科，青海西寧 810008；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州 450000；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，青海西寧 810008)

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤之一，其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)即為晚期，腫瘤進(jìn)展快，易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，預(yù)后情況較差[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，膀胱癌發(fā)病機(jī)制逐步清晰，化療仍是不可替代的治療方法[3]。順鉑等化療藥物抵抗和耐藥是影響其應(yīng)用效果和預(yù)后的重要因素之一，復(fù)發(fā)和耐藥是膀胱癌治療面臨的重要難題[4-5]。糖蛋白-130(glycoprotein-130，GP130)為跨膜蛋白，為多個(gè)致癌基因中心點(diǎn)，影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和增殖等[6]。因此，GP130與膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等均可能相關(guān)。為證實(shí)這一假設(shè)，本研究檢測(cè)GP130在膀胱癌中的表達(dá)水平并分析其與膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年1月至2020年5月收治的膀胱癌手術(shù)治療患者32例為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)病理檢查確診膀胱癌，采用腹腔鏡膀胱癌根治性切除手術(shù)治療，檢查完善，臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除術(shù)前經(jīng)其他抗癌治療患者、復(fù)發(fā)性膀胱癌患者、合并其他腫瘤疾病患者、合并自身免疫系統(tǒng)疾病患者、合并肝腎功能疾病患者、合并心血管疾病患者等。研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)同意。32例膀胱癌手術(shù)治療患者中男性20例，女性12例；年齡55～76歲，平均(65.68±6.65)歲；膀胱尿路上皮細(xì)胞癌29例、鱗狀細(xì)胞癌2例、腺細(xì)胞癌1例；組織分級(jí)為G1分級(jí)患者6例、G2分級(jí)患者21 例、G3分級(jí)患者5例；術(shù)后TNM分期為T(mén)2N0M0患者29例、T3N0M0患者1例、T3N1M0患者2例。

1.2 主要試劑和儀器膀胱癌T24細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Lipofectamine 3000、RNA提取試劑盒、RNase Free 蒸餾水等均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。siRNA-GP130、siRNA-NC、GP130、β-actin引物等均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。兔抗人GP130抗體、二抗、ECL試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等均購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司。Transwell小室、蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。GP130、β-actin等BCA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。順鉑、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶、四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(microenzyme reaction of tetramethylazazole， MMT)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。采用德國(guó)艾本德5331型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀、美國(guó)Bio-rad MODEL680型酶標(biāo)儀、日本Olympus CKX31-A11PHP型倒置顯微鏡等儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化檢測(cè) 免疫組化法檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織的GP130表達(dá)水平。膀胱癌組織和癌旁組織標(biāo)本均常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋并切為厚度4 μm的連續(xù)切片，進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。二甲苯浸泡20 min脫蠟，以體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇梯度處理，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3 min并進(jìn)行3次重復(fù)操作，行微波爐EDTA抗原修復(fù)，PBS洗滌3 min并進(jìn)行3次重復(fù)操作，體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗滌3 min并進(jìn)行3次重復(fù)操作，山羊非免疫血清封閉10 min，棄去血清，添加一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，棄去一抗，PBS洗滌3 min并進(jìn)行3次重復(fù)操作，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min并進(jìn)行3次重復(fù)操作，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min并進(jìn)行3次重復(fù)操作，行二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，體積分?jǐn)?shù)為75%、85%、95%、100%的乙醇梯度各處理3 min，二甲苯透明并進(jìn)行中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)觀察，GP130主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)淺黃色、棕色或深棕色染色為細(xì)胞染色陽(yáng)性，計(jì)算每個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)比例，陽(yáng)性細(xì)胞染色比例超過(guò)5%為表達(dá)陽(yáng)性。

1.3.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 膀胱癌T24細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2～3 d/次，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)，將siRNA-GP130(siRNA-GP130組)、siRNA-NC(siRNA-NC組)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3.3PCR檢測(cè) PCR檢測(cè)各組GP130 mRNA水平。轉(zhuǎn)染后48 h，取膀胱癌T24細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測(cè)，根據(jù)RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR,RT-PCR)反應(yīng)，引物序列如下，GP130：正向5′-TACGAATGGCAGCATACACAGA-3′；反向5′-GCTAAGCAAACAGGCACGACT-3′。β肌動(dòng)蛋白(β-actin)：正向5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′；反向5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。10 μL反應(yīng)體系如下：SYBR II GREEN 5 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA 2 μL、RNase Free 蒸餾水 2.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性0.5 min、95 ℃變性1 min、60 ℃退火0.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt算法進(jìn)行GP130 mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。

1.3.4Western blotting檢測(cè) 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 檢測(cè)各組GP130 蛋白水平。轉(zhuǎn)染后48 h，取膀胱癌T24細(xì)胞常規(guī)提取總蛋白質(zhì)，蛋白上樣60 μg，通過(guò)12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，50 g/L脫脂牛奶封閉1.5 h，添加一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，棄去一抗，加入含辣根過(guò)氧化物酶的二抗，室溫孵育2 h，ECL試劑盒暗室顯影，Image J 軟件分析處理蛋白灰度值，以目標(biāo)GP130 蛋白灰度值與β-actin灰度值比值為最終檢測(cè)結(jié)果。

1.3.5MMT法檢測(cè) MMT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌T24細(xì)胞，1×104個(gè)/孔接種至96孔板培養(yǎng)24 h，加入20 μL 的5 μg/L MTT試劑，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，添加150 μL DMSO震蕩，酶標(biāo)儀讀取各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔結(jié)果取平均值，并設(shè)空白對(duì)照，空白對(duì)照細(xì)胞抑制率設(shè)定為0，三組細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為“細(xì)胞抑制率=[1-(A目標(biāo)組/A空白對(duì)照)]×100%”

1.3.6遷移和侵襲能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌T24細(xì)胞，制成2×104/mL細(xì)胞懸液，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移測(cè)定：Transwell上室接種200 μL細(xì)胞懸液，下室接種600 μL含血清培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，無(wú)菌棉簽除去上層膀胱癌T24細(xì)胞并充分清洗，40 g/L多聚甲醛固定0.5 h，結(jié)晶紫染色10 min，染色細(xì)胞素即遷移細(xì)胞素。侵襲測(cè)定是以1∶5比例加入RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel，涂覆于Transwell上室，干燥后根據(jù)遷移測(cè)定步驟進(jìn)行后續(xù)操作，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3.7順鉑敏感性檢測(cè) 將膀胱癌T24細(xì)胞接種于96孔板中，5×103個(gè)/孔，通過(guò)RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞孵育過(guò)夜，通過(guò)含0.5～1.5 μmol/L(梯度間隔0.1 μmol/L)順鉑的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后添加MTT試劑培養(yǎng)4 h，吸取培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)各孔A值，繪制細(xì)胞活力-順鉑濃度曲線，根據(jù)曲線測(cè)定比較三組膀胱癌T24細(xì)胞的順鉑半數(shù)有效濃度(median effective concentration，IC50)。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織GP130表達(dá)水平比較

膀胱癌組織GP130陽(yáng)性表達(dá)率為87.50%(28/32)，高于其癌旁組織的46.88%(15/32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.978，P<0.001)。

圖1 膀胱癌組織(A)和癌旁組織(B)GP130表達(dá)水平(免疫組化，×200)

2.2 三組GP130表達(dá)水平比較siRNA-GP130組GP130 mRNA和蛋白水平均低于siRNA-NC組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA-NC組和空白對(duì)照組的GP130 mRNA和蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖2。

圖2 三組GP130 蛋白表達(dá)水平的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

表1 三組GP130表達(dá)水平比較

2.3 三組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性比較siRNA-GP130組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、順鉑IC50均低于siRNA-NC組和空白對(duì)照組，而其細(xì)胞增殖抑制率則均高于siRNA-NC組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA-NC組和空白對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、順鉑IC50、細(xì)胞增殖抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 三組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性比較

3 討 論

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，化療是其不可替代的治療方法，可在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存期，改善預(yù)后[7-8]。順鉑為膀胱癌一線化療藥物，為細(xì)胞毒性化療藥物，順鉑抗癌的主要作用機(jī)制為引發(fā)DNA損傷和誘導(dǎo)線粒體凋亡，從而促使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，達(dá)到癌癥治療目的[9-10]。化療藥物的重復(fù)給藥可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得性藥物抵抗，化療耐受可導(dǎo)致治療失敗是化療治療的一大難題，順鉑抵抗是其治療后復(fù)發(fā)率高和預(yù)后差的一個(gè)重要原因，臨床上大約有40%的膀胱癌患者在5年內(nèi)由于化療抵抗而出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)，增加了膀胱癌的治療難度，膀胱癌化療的總體預(yù)后情況仍較差[11-13]。因此，明確膀胱癌順鉑耐藥機(jī)制，確定其發(fā)生耐藥的關(guān)鍵分子，并通過(guò)輔助手段提高膀胱癌對(duì)順鉑的敏感性，減輕腫瘤細(xì)胞獲得性順鉑藥物抵抗是提高膀胱癌順鉑化療效果的有效方法。腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移涉及到多種細(xì)胞生理學(xué)改變，亦是影響膀胱癌等癌癥預(yù)后的重要因素[14-16]。明確膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移機(jī)制及其關(guān)鍵分子亦可指導(dǎo)其有效治療。

GP130廣泛存在于多種組織細(xì)胞內(nèi)，是與腫瘤炎癥免疫微環(huán)境、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖等密切相關(guān)的蛋白[17-18]。據(jù)研究報(bào)道，GP130是白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-6、IL-11、IL-27等細(xì)胞信號(hào)分子的下游配體復(fù)合物，這些細(xì)胞因子可特異性地結(jié)合GP130配體復(fù)合物的α鏈，激活下游信號(hào)通路從而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19-20]。因此，GP130可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測(cè)GP130在膀胱癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，膀胱癌組織中GP130陽(yáng)性表達(dá)率高于其癌旁組織，證實(shí)了GP130影響膀胱癌的可能性。本研究亦關(guān)注GP130與膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關(guān)系，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA-GP130、siRNA-NC轉(zhuǎn)染至膀胱癌T24細(xì)胞，并設(shè)立不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的空白對(duì)照，PCR 和 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-GP130可有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞的GP130 mRNA和蛋白表達(dá)，MMT法檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表達(dá)后，膀胱癌T24細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率出現(xiàn)升高，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表達(dá)后，膀胱癌T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低，而通過(guò)含順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞測(cè)定的順鉑IC50結(jié)果顯示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表達(dá)后，膀胱癌T24細(xì)胞的順鉑IC50降低，證實(shí)了GP130參與膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且影響順鉑獲得性抵抗情況。因此，在膀胱癌應(yīng)用含順鉑的一線化療方案時(shí)，通過(guò)GP130抑制劑的應(yīng)用可能有助于提高其化療效果并減少順鉑耐藥的發(fā)生，減少因順鉑耐藥導(dǎo)致復(fù)發(fā)的發(fā)生，改善療效和預(yù)后。

綜上所述，GP130在膀胱癌中的表達(dá)上調(diào)并參與膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，且與順鉑敏感性密切相關(guān)，GP130抑制可能成為膀胱癌治療的有效方法之一，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)。