張峰瑞，王緣梅，葛慧琳

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625099；2.家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（西南大學(xué)），重慶市 400715；3.北京大學(xué)物理學(xué)院，北京市 100091）

雖然過去幾年在液體或冷凍儲存馬精子方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但種馬精液保存情況仍存在很大的個(gè)體差異。在低溫貯藏過程中，馬精子受到膜磷脂、蛋白質(zhì)和染色質(zhì)的氧化損傷。滲透脅迫可導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷和精子代謝的改變。此外，來自許多物種的證據(jù)也表明，精子在冷凍保存過程中會發(fā)生類似凋亡的變化。這3個(gè)過程似乎是相互聯(lián)系的，可能通過類似的途徑影響精子細(xì)胞的功能（段洪云等，2012）。因此，了解這些過程及其共同的代謝途徑對保存馬精子有重要意義。

1 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是許多疾病過程的一個(gè)明確的組成部分?；钚匝醯漠a(chǎn)生可能是氧化代謝的正常結(jié)果，也可能是特定細(xì)胞類型的特定機(jī)制，如白細(xì)胞氧化。氧化應(yīng)激是影響精子功能的重要因素?；钚匝踉谡＞庸δ苤衅鹬匾饔?，活性氧的產(chǎn)生或降解不平衡可能對精子產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。在精子儲存過程中，氧化應(yīng)激的影響尤為重要，當(dāng)精液樣本中大量的精漿被移除時(shí)，這種損害會進(jìn)一步加劇，因?yàn)榫褐械拇罅靠寡趸芰εc精漿共存（趙憲林等，2010）。

1.1 馬精液活性氧清除精液中主要活性氧清除酶為過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶，這些清除酶在精液中的相對數(shù)量和重要性似乎存在很大的物種差異，Baumber和Ball（2005）測定了這些酶系統(tǒng)對馬精液的相對活性，過氧化氫酶為（8.7±29.2）U/mg、超氧化物 歧 化 酶 為（29.15±6.64）U/mg、（0.87±0.06）μmol NADPH氧化/（min/mg）。前列腺組織勻漿過氧化氫酶的比活性明顯大于壺腹部、球尾腺、泡狀腺、附睪尾液或睪丸，這些數(shù)據(jù)表明，馬精漿具有相對較高的過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性，這些清道夫的活性在種馬之間存在顯著差異。精子中活性氧清除劑的數(shù)量似乎非常有限，而精漿是活性氧清除劑的一個(gè)有效來源，其作用是保護(hù)精子免受活性氧的不利影響。在精子保存過程中去除精漿可能會增加精子對氧化應(yīng)激的敏感性。除了上述提到的酶清除劑外，精漿中的許多其他成分也可能抵消純精液中的氧化應(yīng)激，特別是白蛋白、尿酸、?；撬帷⒋闻；撬?、丙酮酸、乳酸、抗壞血酸、生育酚和麥角硫氨酸等。雖然對馬精漿成分及馬精液中低分子量抗氧化劑作用的研究相對較少，但對精漿總抗氧化能力的評估表明，這些低分子量成分可能構(gòu)成了精液的大部分抗氧化能力（Thiele等，2015）。

1.2 活性氧的產(chǎn)生馬精子產(chǎn)生活性氧似乎來自于精子頭部質(zhì)膜中存在的一種精子特異性NADPH氧化酶或來自精子線粒體（Sabeur和Ball，2007）。雖然超氧化物陰離子是馬精子生成的主要活性氧，這種短暫的形式迅速歧化形成過氧化氫，其是精子主要的細(xì)胞毒性物質(zhì)。低溫?fù)p傷、不可存活或形態(tài)異常的精子，特別是以近端細(xì)胞質(zhì)液滴或中段異常為特征的精子，會顯著增加活性氧的產(chǎn)生（Sabeur和Ball，2007）。在這些條件下，大量活性氧主要是由線粒體電子傳遞鏈的電子泄漏和隨后分子氧的還原形成超氧陰離子驅(qū)動的（Sabeur和Ball，2007）。

1.3 活性氧對精子功能的影響在生理?xiàng)l件下，鈣會刺激生成較少的活性氧，而膜相關(guān)的NADPH氧化酶似乎是導(dǎo)致活性氧生成的可能機(jī)制。在冷凍保存過程中，精子細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，活性氧生成增加，由于精漿抗氧化能力降低，可能導(dǎo)致精子過早獲能（Neild等，2005），進(jìn)而導(dǎo)致冷凍保存的精子壽命縮短。

雖然超氧陰離子是精子產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，是對馬精子損傷最重要的活性氧（Neild等，2005）。當(dāng)馬精子暴露于外源性活性氧時(shí)，過氧化氫的產(chǎn)生增加，精子活力下降。添加活性氧酶清除劑來評估超氧陰離子和過氧化氫的相對重要性，如過氧化氫酶分解過氧化氫，而超氧化物歧化酶分解超氧陰離子，在誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下可以維持精子正常的運(yùn)動。因此，精子活力似乎是氧化應(yīng)激的一個(gè)敏感指標(biāo)，可能是氧化應(yīng)激過程中最先受到影響的參數(shù)之一。

1.4 活性氧對精子DNA完整性和膜脂氧化的影響活性氧是造成包括精子在內(nèi)的多種細(xì)胞DNA損傷的原因之一。在馬精子中，活性氧濃度增加，DNA損傷呈劑量依賴性增加。過氧化氫酶或還原性谷胱甘肽存在時(shí)，DNA損傷被阻斷，這表明過氧化氫是導(dǎo)致馬精子DNA損傷的主要活性氧（Baumber等，2005）。較少的氧化應(yīng)激可能會增強(qiáng)精子的獲能能力，從而增強(qiáng)精子的受精能力。因此，較少的氧化應(yīng)激可能使DNA受損的精子與卵母細(xì)胞受精。精子細(xì)胞局限于沒有能力修復(fù)DNA損傷，盡管可能發(fā)生受精，但也會影響后續(xù)的胚胎發(fā)育，增加早期胚胎的死亡速度（Morris等，2007）。

精子膜具有相對高濃度的多不飽和脂肪酸，容易受到過氧化損傷。由于過氧化氫和氧負(fù)離子的能量不足以引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，因此，通常需要過渡金屬催化劑來引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（Ball和Vo，2002）。過渡金屬催化劑（如Fe2+）的存在可引發(fā)脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化與脂質(zhì)過氧化物的形成發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終形成細(xì)胞毒性醛，包括丙二醛和更強(qiáng)的4-羥基壬烯醇（Ball和Vo，2002）。膜脂過氧化改變了精子的膜流動性，這種改變會影響精子膜的融合能力，它是精子頂體胞吐的一個(gè)重要功能。雖然哺乳動物精子的脂質(zhì)過氧化特征明顯，但馬精子相對于其他家畜精子表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗膜過氧化能力（Neild等，2005）。但低溫保存增加了馬精子對脂質(zhì)過氧化的敏感性，這種敏感性在精子中段區(qū)域更為明顯。Ball和Vo（2002）報(bào)道，在5℃下儲存液體精液會導(dǎo)致馬精子的脂質(zhì)過氧化增加。

2 滲透壓應(yīng)激

2.1 滲透壓應(yīng)激對精子功能的影響滲透應(yīng)激是精子冷凍保存過程中損傷的重要因素之一，由于水和溶質(zhì)在精子質(zhì)膜上的移動導(dǎo)致細(xì)胞體積變化所引起的滲透應(yīng)激是精子損傷的一個(gè)重要特征。馬精子表現(xiàn)為線性滲透，當(dāng)精子膨脹或收縮超過相當(dāng)窄的滲透耐受范圍時(shí)細(xì)胞就會死亡發(fā)生（Ball和Vo，2002）。添加甘油或其他可滲透的冷凍保護(hù)劑作為大多數(shù)冷凍保存介質(zhì)的一部分，在冷凍保護(hù)劑通過精子膜達(dá)到平衡前會導(dǎo)致滲透壓瞬間增加，當(dāng)細(xì)胞外的介質(zhì)在冷卻過程中凍結(jié)時(shí)，水的凍結(jié)使精子懸浮在的介質(zhì)中，由于未凍結(jié)的水中溶質(zhì)濃度增加，這些介質(zhì)的滲透壓越來越高。甘油和水滲透率的差異及這些滲透率對溫度的依賴關(guān)系似乎是滲透應(yīng)激的重要組成部分（Pommer等，2002）。當(dāng)甘油含量高的細(xì)胞突然轉(zhuǎn)移到等滲、不含甘油的培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對于細(xì)胞外環(huán)境是高滲的。因?yàn)楦视偷耐ㄍ感员人耐ㄍ感孕。栽谙鄬Φ蜐B透的條件下會有水的凈流入，從而導(dǎo)致細(xì)胞體積增加。如果細(xì)胞體積的變化超過其滲透耐受性，可能導(dǎo)致細(xì)胞裂解。如果精子受到滲透應(yīng)激，并在＞0℃的溫度下受到冷休克，這些因素可能導(dǎo)致精子膜功能改變，這在冷凍和解凍過程中對精子有害。特別是滲透和冷休克對精子共同作用可導(dǎo)致精子膜的水輸運(yùn)減少，而水運(yùn)輸對整個(gè)精子膜在凍融精子生存方面具有重要作用（Devireddy等，2002）。

2.2 氧化和滲透應(yīng)激的交互作用將馬精子暴露于低滲透壓或高滲透壓條件下，活精子細(xì)胞會產(chǎn)生更多的超氧陰離子，表明這兩種刺激因素之間存在積極的相互作用。目前關(guān)于這種相互作用的機(jī)制還不清楚。但來自其他細(xì)胞類型的研究表明，膜相關(guān)磷脂酶A2（PLA2）的激活及隨后NADPH氧化酶的激活可能代表在滲透應(yīng)激下產(chǎn)生超氧陰離子的潛在途徑（Lambert等，2006）。在人類精子中，PLA2的產(chǎn)物（包括花生四烯酸）似乎可以激活NADPH氧化酶，同時(shí)增加超氧陰離子的生成，由此導(dǎo)致的活性氧增加可能反過來參與蛋白酪氨酸激酶的激活，而這些蛋白酪氨酸激酶調(diào)節(jié)體積敏感的滲透通道，對維持體內(nèi)平衡非常重要（Lambert等，2006）。馬精子暴露于高滲條件下會改變蛋白酪氨酸磷酸化，NADPH氧化酶抑制劑和蛋白酪氨酸激酶抑制劑可以阻止這一過程（Linfor等，2002）。總之，這些研究表明，滲透和氧化應(yīng)激在馬精子中存在交互作用，可能改變精子功能，并可能在冷凍保存過程中對暴露于這些應(yīng)激源的細(xì)胞造成復(fù)合損傷。

3 馬精子的細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是多種體細(xì)胞的典型特征，在大多數(shù)哺乳動物（包括馬）的精子形成過程中發(fā)生。通過密度梯度離心分離馬精子可導(dǎo)致較小的線粒體膜電位、膜透性改變、增加DNA碎片和天冬氨酸介導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶激活（Brum等，2008）。同樣，低溫貯藏后，馬精子凋亡的跡象包括降低線粒體膜電位變化、改變膜結(jié)構(gòu)、半胱天冬酶激活。類似的結(jié)果在人和牛精子（Martin等，2007）冷凍保存后也有報(bào)道。盡管在精子亞群和冷凍保存后發(fā)現(xiàn)凋亡標(biāo)記物，但這一發(fā)現(xiàn)仍存在爭議，需要更多的研究來闡明冷凍保存后的凋亡變化對冷凍后馬精子功能的影響。

4 結(jié)論

雖然氧化應(yīng)激、滲透應(yīng)激和凋亡是與精子保存相關(guān)的因素，但這些應(yīng)激因素對精子的影響是相互作用的。滲透應(yīng)激與各種體細(xì)胞和馬精子中超氧化物的產(chǎn)生有關(guān)，可能是細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的信號機(jī)制。氧化應(yīng)激可能引發(fā)馬精子凋亡，對精子的許多氧化損傷特征與凋亡過程類似。還需要進(jìn)一步研究這些應(yīng)激對精子破壞的分子途徑，以降低其在保存過程中對精子的有害影響。