李曼 魏小麗 張丹 俞亞玲 何莎

（陜西省安康市畜牧獸醫(yī)中心 725000）

生豬產(chǎn)業(yè)作為安康市的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，是安康市畜牧業(yè)的“支柱”，歷經(jīng)10 余年發(fā)展壯大，更成為全市農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的“當(dāng)家”產(chǎn)業(yè)。全省畜牧業(yè)發(fā)展布局是“陜北羊，關(guān)中奶，陜南豬”，尤其在新時(shí)期脫貧攻堅(jiān)戰(zhàn)役中，生豬產(chǎn)業(yè)已成為是安康市是非常重要的產(chǎn)業(yè)扶持力量。2018 年8 月非洲豬瘟疫情發(fā)生后，安康市畜牧獸醫(yī)部門持續(xù)強(qiáng)化防控措施，防止疫情傳入，并取得了階段性成效，其中安康市市級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在疫情監(jiān)測(cè)工作中發(fā)揮了巨大作用。但同時(shí)也要看到，安康市非洲豬瘟防控還存在一些薄弱環(huán)節(jié)，各屠宰場(chǎng)雖已配備PCR 儀，能自行開展非洲豬瘟檢測(cè)工作，但檢測(cè)水平參差不齊，尤其是各縣區(qū)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室及規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)均未取得非洲豬瘟檢測(cè)資質(zhì)，導(dǎo)致市級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)壓力過大，難以應(yīng)對(duì)新形勢(shì)下非洲豬瘟常態(tài)化防控工作的需要。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力建設(shè)是非洲豬瘟防控的基石，是精準(zhǔn)防控的前提，國(guó)家、省、市相關(guān)部門雖然一直在鼓勵(lì)各縣區(qū)及有條件的養(yǎng)殖場(chǎng)建立PCR 檢測(cè)室，但在實(shí)際建設(shè)過程中，由于對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室沒有統(tǒng)一的建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，各縣區(qū)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室、屠宰場(chǎng)及企業(yè)自檢實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)環(huán)境、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員、檢測(cè)試劑等方面條件差異較大，造成實(shí)驗(yàn)室建設(shè)進(jìn)程緩慢。因此，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室如何合理科學(xué)建設(shè)非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，順利取得省級(jí)授權(quán)非洲豬瘟檢測(cè)資質(zhì)，盡快開展非洲豬瘟日常排查監(jiān)測(cè)工作，發(fā)揮獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在非洲豬瘟常態(tài)化防控工作中的重要作用，是當(dāng)前防控工作中面臨的重要問題。本文就基層非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)方面提出一些建議，供廣大獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室人員參考。

1 科學(xué)設(shè)計(jì)非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室

1.1 非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行合理分區(qū)

非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域（建有屏障或緩沖區(qū)）或相對(duì)封閉的區(qū)域，其設(shè)計(jì)不同于基層常見的血清學(xué)及病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)PCR 檢測(cè)方法的原理及特點(diǎn)，非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室要進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)。由于現(xiàn)在基層多采用商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作較為簡(jiǎn)單，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作過程至少要分隔為試劑準(zhǔn)備、核酸提取、擴(kuò)增分析3 個(gè)區(qū)域。試劑準(zhǔn)備區(qū)主要用于樣品、試劑存放，離心管、吸頭的儲(chǔ)存，以及檢測(cè)樣品的前期處理等，核酸提取區(qū)主要用于病毒核酸提取，擴(kuò)增分析區(qū)主要用于擴(kuò)增反應(yīng)液的配置、核酸熒光PCR 擴(kuò)增及結(jié)果分析。各分區(qū)之間應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，各工作區(qū)域必須有明確標(biāo)記。

1.2 配備與檢測(cè)相適應(yīng)的儀器設(shè)備

非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須配備與檢測(cè)相適應(yīng)的儀器檢測(cè)設(shè)備，不同區(qū)域擺放相應(yīng)的儀器。試劑準(zhǔn)備區(qū)應(yīng)擺放冰箱、水浴鍋或加熱模塊、組織研磨儀、水槽等，核酸提取區(qū)應(yīng)擺放生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、混均器、微量加樣器等，擴(kuò)增分析區(qū)擺放熒光PCR 儀，電腦、打印機(jī)等，除此之外，各區(qū)域還應(yīng)有空調(diào)等室內(nèi)恒溫設(shè)備、紫外燈消毒設(shè)備、專用工作服及一次性手套、離心管等耗材。各區(qū)域的設(shè)備物品不得混用，各類儀器要有專人管理，儀器技術(shù)規(guī)程要達(dá)到檢驗(yàn)項(xiàng)目的要求，重要儀器要制定儀器操作規(guī)程及使用記錄，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行維護(hù)，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運(yùn)行。

2 做好實(shí)驗(yàn)室人員管理及培訓(xùn)

2.1 合理配置檢測(cè)人員

非洲豬瘟熒光定量PCR 檢測(cè)是以擴(kuò)增檢測(cè)DNA 為方法的分子學(xué)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的要求更為嚴(yán)格。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備具有獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)、生物、畜牧等相關(guān)專業(yè)?？埔陨系臋z測(cè)人員1～2 名，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化的相關(guān)法律法規(guī)、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)規(guī)范、操作規(guī)程、生物安全防護(hù)知識(shí)和實(shí)際操作技能等培訓(xùn)，獲得資格后方可開展相關(guān)檢測(cè)工作。檢測(cè)人員要能熟練操作相關(guān)設(shè)備，明確整個(gè)工作流程，掌握實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制方法、檢測(cè)結(jié)果分析及生物安全防護(hù)措施。

2.2 人員管控

非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室人員需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度培訓(xùn)后方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員必須遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度。人員進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室要做好安全檢查，包括水、電、儀器設(shè)備、門窗等。與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)無關(guān)的人員未經(jīng)允許不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)工作完成后要對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行規(guī)范記錄，原始記錄內(nèi)容要完整，內(nèi)容要真實(shí)，檢測(cè)報(bào)告切實(shí)保證時(shí)效性、客觀性及準(zhǔn)確性，相關(guān)檢測(cè)人員及負(fù)責(zé)人要逐級(jí)簽字，原始記錄及檢測(cè)報(bào)告要及時(shí)存檔。對(duì)實(shí)驗(yàn)室的記錄和檢測(cè)結(jié)果要實(shí)行計(jì)算機(jī)管理，要有專人負(fù)責(zé)，將每份實(shí)驗(yàn)報(bào)告的基本信息錄入計(jì)算機(jī)，并能隨時(shí)查詢。

2.3 培訓(xùn)與考核

非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室要制定實(shí)驗(yàn)室所有相關(guān)人員的培訓(xùn)計(jì)劃，并執(zhí)行周期性的考核和再培訓(xùn)制度，培訓(xùn)內(nèi)容應(yīng)涉及核酸提取和擴(kuò)增操作要點(diǎn)、注意事項(xiàng)、防污染策略及應(yīng)急預(yù)案等，切實(shí)保證檢測(cè)人員的檢測(cè)技能和水平，凡經(jīng)考核不合格者不得上崗。定期參加相關(guān)部門的盲樣比對(duì)考核，要結(jié)合比對(duì)結(jié)果認(rèn)真總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，查找不足，采取行之有效的措施，切實(shí)提高實(shí)驗(yàn)室人員的專業(yè)知識(shí)、設(shè)備維護(hù)使用技能、實(shí)驗(yàn)操作水平及實(shí)驗(yàn)室管理能力，不斷提升實(shí)驗(yàn)室能力水平，確保檢測(cè)流程科學(xué)規(guī)范，檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

3 做好試劑樣品的選擇與管控

3.1 選擇有生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)使用資質(zhì)的診斷制品

基層非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室開展非洲豬瘟檢測(cè)工作時(shí)主要采用商品化的成品試劑盒，目前世面上的檢測(cè)試劑盒質(zhì)量參差不齊，檢測(cè)試劑盒從每盒幾百元到幾千元不等，核酸檢測(cè)穩(wěn)定可靠性尚需存疑。在購(gòu)買非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒時(shí)，不能僅關(guān)注價(jià)格，應(yīng)使用已取得農(nóng)村農(nóng)業(yè)部核發(fā)的產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)的非洲豬瘟病毒診斷制品，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)信息應(yīng)在中國(guó)獸藥信息網(wǎng)“獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)”中查詢。所有未參加或未通過中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心比對(duì)試驗(yàn)的非洲豬瘟病毒診斷制品，以及通過比對(duì)試驗(yàn)但目前未申請(qǐng)注冊(cè)的非洲豬瘟病毒診斷制品一律不能購(gòu)買使用。

3.2 試劑管控

在基層經(jīng)常見到由于存放不合理影響試劑盒檢測(cè)靈敏度甚至導(dǎo)致失效的情況，不僅造成很大的浪費(fèi)，還造成檢測(cè)工作成為“無用功”，因此，科學(xué)有效的試劑管理控制是檢測(cè)成功的前提。目前常用非洲豬瘟檢測(cè)試劑盒一般分為A 盒和B 盒，分別為核酸提取試劑盒和擴(kuò)增試劑盒，要按試劑盒的要求妥善保存試劑，核酸提取試劑盒存放于干燥室溫環(huán)境，擴(kuò)增試劑盒和蛋白酶K 存放于-20℃。試劑在使用前放置室溫解凍，PCR 反應(yīng)體系中酶對(duì)溫度敏感，使用時(shí)應(yīng)置于冰上操作，用完后及時(shí)冷凍保存?；鶎訉?shí)驗(yàn)室由于檢測(cè)量不大，每個(gè)試劑盒的檢測(cè)樣品數(shù)為50 頭份，很多時(shí)候不能一次用完，也可以將檢測(cè)試劑進(jìn)行分裝，避免多次凍融影響試劑檢測(cè)效果。

3.3 樣品管控

安全有效的樣品管理不僅是保證分析數(shù)據(jù)質(zhì)量的需要，也是確保安全的需要。非洲豬瘟采樣過程中要避免交叉污染，采樣后要做好登記、編號(hào)，規(guī)范進(jìn)行保存運(yùn)輸。對(duì)于距離較遠(yuǎn)或其他因素等不能及時(shí)送檢的樣品，應(yīng)儲(chǔ)存于-20℃冰柜冷凍保存。樣本送達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)做好接樣、流轉(zhuǎn)，及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于不能及時(shí)開展檢測(cè)或需要留樣的應(yīng)儲(chǔ)存于-20℃冰柜冷凍保存；切不可隨意放置。一旦發(fā)現(xiàn)疑似陽(yáng)性或可疑的樣品，應(yīng)妥善包裝后盡快送至具有檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)樣品復(fù)核和送檢，完成后要對(duì)留存的樣品進(jìn)行無害化處理。