鐘觀新

（廣東省遂溪縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 524300）

精液冷凍是精液經(jīng)過特殊處理后，在極低溫度下（-196℃）保存，抑制精子代謝活動，使精子生命在靜止?fàn)顟B(tài)下保存下來，升溫又能復(fù)蘇而不失去授精能力的一種長期保存精液的方法。在種質(zhì)資源保護(hù)、減少公豬飼養(yǎng)量及開展跨地區(qū)遺傳交流等方面具有重要意義。但豬精子對溫度變化的敏感性，使其在冷凍解凍過程中易受損傷，導(dǎo)致豬冷凍精液的生產(chǎn)難度大。豬冷凍精液技術(shù)的關(guān)鍵在于豬精子在冷凍和解凍過程中是否失去活力、保持受精能力等。對于地方豬種而言，精液冷凍保存技術(shù)可以對瀕危家畜及珍稀動物的保種提供技術(shù)支持。本文對影響廣東小耳花豬細(xì)管法精液冷凍保存效果的因素進(jìn)行分析，為廣東小耳花豬冷凍精液制作提供參考。

1 廣東小耳花豬的個體差異

豬精子射精量大，采精后對外界溫度的突然改變相當(dāng)敏感。外界因素、精子本身生物學(xué)特性、種公豬個體差異和每次采精的質(zhì)量差異都會影響凍精效果。在常溫保存下，廣東小耳花豬的精液保存時間存在個體差異性，體現(xiàn)出不同個體間或不同時間采集的精液對溫度耐受力不一。筆者在對廣東小耳花豬精液進(jìn)行冷凍保存的過程中，發(fā)現(xiàn)來源不同個體、品質(zhì)相近、同一批次精液，最終凍精復(fù)蘇后的品質(zhì)不一、存在著某些個體凍精效果差，一般復(fù)蘇后活力在0.4 左右、高者可以達(dá)到0.6、低者甚至在0.1 以下。

2 稀釋、常溫平衡

豬精子細(xì)胞對溫度的變化特別敏感，尤其是降溫，因此，不但要求精子對低溫有耐受能力，而且要能經(jīng)受從射精時體溫到保存時超低溫的變化。在整個過程中要求精子活力、形態(tài)都能夠保持基本不變。因此在對廣東小耳花豬精液做冷凍保存時，使精液安全度過致命溫度。采精后需馬上對精液進(jìn)行稀釋，研究表明，豬精液按照0.25、0.5、0.75、1 億/ml 稀釋時，17℃保存24h 后活力保持在0.8 以上。廣東小耳花豬精液密度在1.5 億/ml 之間，因此可0.5～1 倍稀釋。在25℃下達(dá)到平衡后轉(zhuǎn)移至17℃冷柜中平衡，平衡2.5～4h；超過5h，在離心時易使精子黏附管壁造成損耗，從而影響復(fù)蘇后活力。

3 離心速率與時間

豬精液離心后棄去上清液，用冷凍稀釋液重懸浮，使冷凍保護(hù)物質(zhì)充分接觸，可以提高精液冷凍后的活力。研究表明，豬精液800r/min 的離心效果明顯好于500r/min 和1000r/min[1]。宋先忱等[2]認(rèn)為，遼寧絨山羊精液以800～1200r/min，可明顯提高細(xì)管凍精的冷凍效果。以上研究表明，不同品種精液對離心的條件及轉(zhuǎn)速要求不同。筆者在廣東小耳花豬的精液冷凍保存過程中發(fā)現(xiàn)：精液在17℃中經(jīng)1500r/min 離心12min 后易分離精清，減少有效精子的浪費(fèi)，同時減少機(jī)械性損傷，冷凍效果較好。

4 冷凍稀釋液種類

在降溫過程中，精子細(xì)胞外及冷凍稀釋液中的水分開始形成冰晶，造成溶質(zhì)濃度增高，導(dǎo)致精子細(xì)胞脫水，原生質(zhì)變干，電解質(zhì)濃度增高，酸堿度失去平衡，最終精子因受到冰晶化產(chǎn)生的化學(xué)性傷害而死亡。甘油及卵黃是精液冷凍稀釋液中必不可缺的抗冷凍物質(zhì)。另外，黃俻華等[3]對陸川豬精液冷凍稀釋液的研究表明，冷凍稀釋中添加600μg/ml VC和600μg/ml VE，能有效防止冷凍精子發(fā)生過氧化反應(yīng)，提高精子頂體完整率，降低精子畸形率，增加解凍后精子的活力。筆者在對廣東小耳花豬精液冷凍過程中發(fā)現(xiàn)，加入新鮮雞蛋卵黃要比陳舊雞蛋卵黃效果要好。

5 低溫平衡時間及溫度

精子細(xì)胞有其適宜的冷凍與解凍速率要求，冷凍速率太慢時，保存的細(xì)胞易受高濃度溶液的影響而遭到破壞或死亡（溶液效應(yīng)）。因此，在冷凍時要經(jīng)過平衡時間是影響冷凍復(fù)蘇精子存活率的一個重要因素。對于不同動物來說，甘油透過精子細(xì)胞膜的速度不同，對低溫耐受性也不同。目前，應(yīng)用水浴降溫是一種較穩(wěn)定的降溫方法，水浴過程溫度差不超過1℃。將降溫速率控制在2～3min/℃可提高豬精液的冷凍成功率，并在5℃平衡2～4h。平衡時間受冷凍載體的容積和精子密度的影響，容積越大或密度越高，精液平衡時間越長，反之平衡時間越短。在整個過程，嚴(yán)格控制精液溫度，防止精液回溫。

6 熏蒸時間及高度

冷凍過程是影響精液冷凍效果的關(guān)鍵步驟，可用冷凍儀和液氮熏蒸進(jìn)行精液冷凍，而液氮熏蒸方法設(shè)備簡單便宜，易被中小企業(yè)采用。對豬精液超低溫冷凍保存的研究指出，5ml 細(xì)管在距液氮面3cm 熏蒸20min，冷凍效果明顯優(yōu)于5cm 及7cm；0.25ml 細(xì)管在距液氮面5cm 進(jìn)行熏蒸，冷凍效果優(yōu)于3cm 及7cm。劉莉[4]研究指出，距離液氮面2cm、5cm 熏蒸較之9cm 處熏蒸效果顯著提升，并且5cm 處熏蒸精子頂體完整率顯著高于2cm 處。筆者對廣東小耳花豬的精液進(jìn)行冷凍保存時，0.5ml 細(xì)管距離液氮面3cm 熏蒸8min 效果優(yōu)于2cm 及5cm。

7 復(fù)蘇工藝

凍精在復(fù)蘇過程中的關(guān)鍵點在于使精子細(xì)胞安全通過冰晶化危險溫度區(qū)，即0～6℃低溫區(qū)域。李青旺等[5]用干解法與濕解法對同一批次豬凍精的研究中指出，干解法解凍后精液活力明顯高于濕解法解凍的精液活力。馬紅等[6]在37、42 及47℃對民豬凍精解凍30s 后發(fā)現(xiàn)，精子頂體完整率在42 及47℃解凍時明顯高于37℃解凍的精子頂體完整率。筆者在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，廣東小耳花豬0.5ml 細(xì)管在50℃水浴15s 解凍效果最佳。

8 問題與展望

目前，豬精液冷凍過程中的冷凍與復(fù)蘇機(jī)理尚未研究透徹，對于廣東小耳花豬精液冷凍及復(fù)蘇條件仍需摸索，同等條件下杜洛克和廣東小耳花豬精液冷凍復(fù)蘇后，前者活力可達(dá)帶0.6 以上，后者平均活力只有0.4。廣東小耳花豬作為廣東區(qū)域優(yōu)良的地方豬品種，在應(yīng)對國外豬種及“非洲豬瘟” 的雙重挑戰(zhàn)下進(jìn)行精液冷凍保存在保護(hù)種質(zhì)資源、推廣利用方面具有重要作用。因此，需要加強(qiáng)對廣東小耳花豬精液冷凍的研究，探索更適宜的冷凍方法提高精液冷凍成功率。