楊勁松(綜述)，張文昌(審校)

環(huán)境污染導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)已成為全球的健康挑戰(zhàn)[1]。鎘(cadmium, Cd)是一種毒性重金屬，被工業(yè)化國家歸為主要環(huán)境和職業(yè)性化學(xué)污染物[2-3]，其引發(fā)的健康危害仍是重要的公共衛(wèi)生問題。在鎘的非職業(yè)性暴露中，吸煙和飲食是主要的途徑[4-5]。動物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)資料顯示，長期鎘暴露與多器官損傷及疾病密切相關(guān)，包括肝病、腎病、心血管疾病、腫瘤、生殖疾病等[3]。卵巢作為重要的女性生殖器官，也是鎘的主要作用靶點(diǎn)[6]。

近年來，表觀遺傳學(xué)成為生命科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)調(diào)控是研究基因的修飾，并在不改變DNA序列和結(jié)構(gòu)修飾的情況下控制和調(diào)控基因的表達(dá)，其機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾和非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。這些過程可能受到各種環(huán)境因素的影響，其失調(diào)與多種疾病有關(guān)[7-8]。本研究擬探討鎘的卵巢表觀遺傳毒理學(xué)進(jìn)展。

1 鎘對DNA甲基化的影響

DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)(Cytosine-phosphate-guanine sites, CpGs)二核苷酸5’端的胞嘧啶添加甲基后變成5’甲基胞嘧啶的過程，DNA甲基化主要依靠DNMT的催化和維持，其在調(diào)控基因的表達(dá)和細(xì)胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[9]，如調(diào)控胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因，X染色體失活、基因組印跡、細(xì)胞分化、老化等功能基因的表達(dá)。在生殖細(xì)胞和胚胎生長發(fā)育過程中，DNA甲基化模式經(jīng)歷去甲基化及重新甲基化的過程，調(diào)控特異基因的活化與失活，進(jìn)而保證卵子和胚胎的正常生長[10]。鎘暴露后卵巢細(xì)胞DNA甲基化異常主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1.1 鎘對基因組總甲基化的影響 基因組總甲基化水平的改變會增加基因組的不穩(wěn)定性，鎘暴露能影響基因組總甲基化的水平，并與卵巢功能失調(diào)密切相關(guān)。妊娠期鎘暴露對F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞全基因組 DNA 啟動子區(qū)甲基化產(chǎn)生影響，與對照組比較，8.0 mg/kg 鎘暴露組基因組 DNA 發(fā)生低甲基化的數(shù)量高于發(fā)生高甲基化的數(shù)量，且主要發(fā)生在中、高密度啟動子區(qū)[11]。鎘可導(dǎo)致卵巢功能的異常，參照職業(yè)鎘暴露劑量對雌性大鼠進(jìn)行亞急性染毒，會導(dǎo)致多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢功能早衰[12]。流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，甲基化異常與PCOS關(guān)系密切。與對照組比較，PCOS組顆粒細(xì)胞表現(xiàn)出差異甲基化水平；2 977個(gè)CpGs(代表2 063個(gè)基因)存在低甲基化，而2 509個(gè)CpGs(1 777個(gè)基因)存在高甲基化[13]。以上研究提示，鎘可能通過參與卵泡發(fā)育重要過程的基因組甲基化水平失調(diào)引發(fā)婦女的卵巢缺陷。

1.2 鎘對DNMTs活性的影響 在哺乳動物中，有3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3α和DNMT3β[14]，在著床期胚胎和生殖細(xì)胞分化過程中，DNMT3α和DNMT3β通過其新生型DNA甲基化活性建立DNA甲基化模式。一旦模式建立，維持型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1就會通過復(fù)制將其忠實(shí)地傳遞到下一代[15]。鎘暴露可致DNMTs酶類表達(dá)異常，進(jìn)而引起DNA甲基化模式的改變。卵巢體外染鎘實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著染鎘劑量的增加(0～10 μmol/L)，卵巢細(xì)胞DNMT1、DNMT3α和DNMT3β的mRNA表達(dá)量呈遞增趨勢，表明較低濃度的鎘能夠促進(jìn)DNMTs的轉(zhuǎn)錄，從而改變DNA甲基化狀態(tài)[16]。

1.3 鎘對基因啟動子及基因表達(dá)的影響 鎘暴露會誘導(dǎo)特定基因啟動子DNA甲基化水平的變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。斷乳至性成熟大鼠鎘暴露干擾了卵泡發(fā)育相關(guān)基因Figlα、H1foo、AMH及甾體激素合成相關(guān)基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和CYP19A1的mRNA與蛋白表達(dá)水平；Figlα基因啟動子區(qū)CpG島甲基化在其mRNA表達(dá)下調(diào)中發(fā)揮作用；但CYP17A1和CYP19A1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平未發(fā)生改變[11]，提示鎘并非通過升高上述兩種基因啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平，進(jìn)而表現(xiàn)出其抑制mRNA表達(dá)的毒效應(yīng)。進(jìn)一步關(guān)注非CpG島的DNA甲基化水平也是必要的，因其也可以參與調(diào)控基因的表達(dá)[17]。鎘暴露還可導(dǎo)致F1代大鼠顆粒細(xì)胞Eif2s1等14個(gè)凋亡通路相關(guān)基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化，Bcl-xl基因啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化；激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化，DNA甲基化可能參與抑制Eif2s1基因表達(dá)的調(diào)控[18]。

由于DNA甲基化通常發(fā)生在基因改變之前，是一類早期的效應(yīng)標(biāo)志物，因此，對生殖細(xì)胞DNA甲基化的及早檢測有可能提示卵巢的損傷，為進(jìn)一步防控生殖健康損害提供依據(jù)。

2 鎘對組蛋白修飾的影響

組蛋白不僅是一種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，而且可作為基因表達(dá)的活性調(diào)節(jié)因子參與翻譯后的化學(xué)修飾，修飾發(fā)生在組蛋白尾部的N端和C端，包括但不限于乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、類泛素化和ADP-核糖基化，這些修飾在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)過程中起著重要作用[19]。環(huán)境因素已被證明可以改變組蛋白修飾，從而改變基因轉(zhuǎn)錄的平衡[20]。鎘暴露可誘導(dǎo)異常的組蛋白甲基化、乙?；?，導(dǎo)致機(jī)體生殖功能異常[21]。急性鎘暴露后小鼠卵母細(xì)胞成熟和生育能力關(guān)鍵指標(biāo)發(fā)生改變，卵母細(xì)胞發(fā)育受阻、質(zhì)量下降，鎘暴露組卵母細(xì)胞蛋白賴氨酸甲基化(H3K9me3)和乙?；?H3K9ac)整體水平低于對照組，提示組蛋白修飾等途徑可能影響卵母細(xì)胞成熟和受精能力[6]。雌鼠飲水鎘(64 mg/L)暴露后，MⅡ期卵母細(xì)胞組蛋白H3第9位賴氨酸殘基(H3K9)甲基化水平和H4第12位賴氨酸殘基(H4K12)的乙?；斤@著增強(qiáng)，說明卵母細(xì)胞的去乙酰化水平降低，影響染色體的正常分離，進(jìn)而影響受精后受精卵的正常發(fā)育，表明鎘暴露可通過介導(dǎo)雌鼠卵母細(xì)胞組蛋白甲基化水平影響雌鼠的生殖功能[22]。

3 鎘對ncRNA的影響及調(diào)控

ncRNA是從DNA轉(zhuǎn)錄而來的功能性RNA，但未翻譯成蛋白質(zhì)[23]。ncRNA按長度常分為小ncRNA(sncRNA，<200個(gè)核苷酸)和長ncRNA(lncRNA，>200個(gè)核苷酸)[24]。大量證據(jù)表明，異常的ncRNA對女性類固醇激素分泌的影響和卵巢疾病的發(fā)生密切相關(guān)[25]。ncRNA在鎘的生殖毒性作用中也發(fā)揮了重要作用。子癇前期(pre-eclampsia, PE)是一種以高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯娜焉锛膊。蓪δ赣H和胎兒造成不利的健康影響。臨床資料顯示，microRNA(miRNA)失調(diào)是PE的一個(gè)重要特征，并隨著鎘暴露的增加而增強(qiáng)[26]。目前，有關(guān)ncRNA介導(dǎo)鎘的卵巢毒性機(jī)制研究主要包括以下幾個(gè)方面：

3.1 miRNA介導(dǎo)鎘的卵巢毒性 miRNA是一種最典型的非編碼RNA分子，包含21～22個(gè)核苷酸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合可導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制[27]。研究表明，miRNA參與了鎘所致卵巢毒性作用的多個(gè)生理病理過程，通過對目的基因的靶向效應(yīng)，調(diào)控卵巢細(xì)胞凋亡、雌孕激素合成及分泌等，現(xiàn)已成為鎘的卵巢毒性表觀遺傳機(jī)制調(diào)控研究的重要組成部分。

3.1.1 鎘誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)異常 體內(nèi)和體外研究表明，鎘暴露可誘導(dǎo)卵巢組織和細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。妊娠期F0代大鼠鎘暴露(8.0 mg/kg)后，取F1代成年大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行微陣列分析，共發(fā)現(xiàn)232個(gè)miRNA表達(dá)失調(diào)，111個(gè)表達(dá)量升高(fold change，F(xiàn)C≥1.5)，121個(gè)降低(FC≤0.67)[28]。顆粒細(xì)胞暴露于含10 μmol/L CdCl2的培養(yǎng)液4 h后，與對照組比較，335個(gè)miRNA表達(dá)失調(diào)(FC≥2)，191個(gè)表達(dá)量升高，144個(gè)降低，58個(gè)FC>10倍[29]。

3.1.2 miRNA表達(dá)異常與卵巢細(xì)胞損傷 鎘暴露會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞增殖與凋亡、生長發(fā)育、激素合成等相關(guān)靶基因以及信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的改變，從而表現(xiàn)為卵巢和生殖毒性，多種miRNA參與調(diào)控這些損傷過程。

3.1.2.1 凋亡相關(guān)的miRNA Zhong等[30]探討鎘對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞(ovarian granulosa cell, OGCs)凋亡或自噬是否通過miRNAs介導(dǎo)。結(jié)果顯示，鎘誘導(dǎo)的OGCs損傷是由線粒體凋亡而非自噬介導(dǎo)的，包括miR-204-5p和miR-29a-3p在內(nèi)的19個(gè)凋亡相關(guān)的miRNA可能參與該過程。上調(diào)的miRNAs增加對Bcl2基因mRNA和蛋白表達(dá)的靶向抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而在鎘誘導(dǎo)的大鼠OGCs毒性作用中發(fā)揮重要作用。免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein,BIP)基因的誘導(dǎo)表達(dá)和PERK/eIF2α路徑的激活是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激繼發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，BIP的調(diào)控受到多種因素的影響。鎘可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生損傷。有研究探討了miRNA調(diào)控BIP的可能性，篩選出5個(gè)與BIP相關(guān)的miRNA：miR-199a-5p、miR-181a-5p、miR-495、miR-30b-3p及miR-150-5p，但經(jīng)qRT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，各劑量染鎘組5個(gè)miRNA均無明顯變化，它們可能未參與BIP基因表達(dá)的調(diào)控[31]。

3.1.2.2 生長發(fā)育相關(guān)的miRNA Kitl作為一種旁分泌因子，在卵泡早期發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用[32]。Wang等[29]研究miRNA對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Kitl pre-mRNA選擇性剪接的影響，將芯片結(jié)果與Kitl以及選擇性剪接重要因子hnRNPA1、hnRNPD、SR基因靶miRNA預(yù)測結(jié)果、文獻(xiàn)資料的查閱結(jié)果進(jìn)行比對，取交集，最終得到29個(gè)與Kitl基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的miRNA，其下游靶基因可能緊密參與了細(xì)胞增殖生長分化、細(xì)胞凋亡調(diào)控、應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等毒作用效應(yīng)?？姑缋占に?anti-mullerian hormone，AMH)由早期發(fā)育卵泡中的顆粒細(xì)胞分泌，通過自分泌和旁分泌途徑發(fā)揮作用，使得原始卵泡的募集受到抑制，參與優(yōu)勢卵泡的選擇，從而調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育[33]。鎘能通過上調(diào)AMH負(fù)調(diào)控干細(xì)胞因子的表達(dá)參與大鼠卵巢細(xì)胞損傷；各染毒組miR-129-5p、miR-486、miR-503-3p及miR-871-3p表達(dá)水平降低；miR-133a-5p、miR-138-5p、miR-325-3p及miR-615表達(dá)水平上升，提示它們可能參與調(diào)控鎘暴露所致的AMH表達(dá)水平的改變[34]。

3.1.2.3 甾體激素合成相關(guān)的miRNA 莊思琪[28]將鎘暴露后F1代成年大鼠顆粒細(xì)胞激素合成基因的靶miRNA進(jìn)行篩選。根據(jù)微陣列芯片表達(dá)譜、在線預(yù)測軟件以及文獻(xiàn)綜述，篩選出10個(gè)相關(guān)miRNA，8個(gè)miRNA經(jīng)qRT-PCR確認(rèn)。GO分析富集到3個(gè)與雌孕激素相關(guān)的生物過程，分別為細(xì)胞內(nèi)雌孕激素受體信號通路，類固醇激素介導(dǎo)的信號通路和膽固醇代謝過程；Pathway富集到4個(gè)與雌孕激素作用相關(guān)的通路，分別為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、孕酮介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟、雌孕激素信號通路以及PI3K-Akt信號通路[28]。

3.1.3 鎘對miRNA表達(dá)調(diào)控的影響 當(dāng)前研究工作主要聚焦于miRNA異常表達(dá)影響靶基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)和調(diào)控，但對于miRNA本身受到的表達(dá)調(diào)控研究很少。研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a家族基因在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞的增殖、凋亡與分化、腫瘤發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[35]。宗超威[36]曾深入研究miR-92a在鎘致顆粒細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用及miR-92a本身可能受到的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-92a-2-5p通過靶向抗凋亡基因Bcl2，參與鎘致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的過程；上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子c-myc促進(jìn)了miR-92a-2-5p的轉(zhuǎn)錄過程；雖然DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶水平降低，但miR-92a-2-5p的DNA甲基化可能未參與其表達(dá)的調(diào)控。

3.1.4 miRNA介導(dǎo)鎘的卵巢毒性跨代遺傳 近年來研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)親代暴露于不利環(huán)境因素時(shí)，易通過跨代遺傳引起子代生理功能紊亂[37]。miRNA不僅介導(dǎo)鎘所致親代卵巢顆粒細(xì)胞的損傷和功能障礙，還可在不同代際進(jìn)行跨代調(diào)控，表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng)。F0代大鼠妊娠期鎘暴露后，F(xiàn)1代成年大鼠顆粒細(xì)胞miR-16和miR-92a表達(dá)上調(diào)并靶向下調(diào)Bcl2，從而參與凋亡過程；然而，F(xiàn)2代成年大鼠顆粒細(xì)胞未出現(xiàn)明顯凋亡改變，miR-92a的下調(diào)可能發(fā)揮了抑制凋亡的作用[38]。Liu等[39]篩選出10個(gè)與孕期鎘暴露F1代成年大鼠卵巢顆粒細(xì)胞雌孕激素作用通路及合成相關(guān)的miRNA，其中miR-27a-3p和miR-10b-5p可調(diào)控孕期鎘暴露致F1代成年大鼠顆粒細(xì)胞雌孕激素的合成；鎘對于F2代的雌孕激素合成功能仍具有影響，miR-27a-3p和miR-10b-5p主要通過抑制STAR基因翻譯過程來影響雌孕激素合成功能。miRNA介導(dǎo)的毒性跨代遺傳和調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，這種跨代遺傳的持續(xù)性和危害性尚需進(jìn)一步評估。

3.2 lncRNA介導(dǎo)鎘的生殖毒性 lncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸但缺乏蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[40]。研究表明，lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄后、轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后等不同水平調(diào)控基因表達(dá)[40-41]。目前，鎘暴露后對生殖器官和細(xì)胞lncRNA表達(dá)變化的研究還十分少見。有研究證實(shí)，胎盤內(nèi)lncRNA表達(dá)與胎盤鎘濃度和體質(zhì)量之間的相關(guān)性，lncRNA表達(dá)失調(diào)可能是鎘生殖毒性機(jī)制的一部分[42]。鎘暴露會導(dǎo)致C57BL/6J小鼠睪丸和精子lncRNA的差異表達(dá)，這些失調(diào)的lncRNA可能是鎘誘導(dǎo)的雄性生殖毒性的潛在生物標(biāo)記?；虮倔w和KEGG路徑分析表明，差異表達(dá)的功能lncRNA的靶標(biāo)與多種生命活動密切相關(guān)，如胞質(zhì)鈣運(yùn)輸、大分子代謝過程、細(xì)胞分化和周期等，這些生物事件和途徑已被證實(shí)與精子的產(chǎn)生、活力、形態(tài)和運(yùn)動有關(guān)[43]。筆者推測，lncRNA也參與了卵母和顆粒細(xì)胞生理功能的調(diào)控，有待深入研究。

4 展 望

盡管表觀遺傳學(xué)改變與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素所致健康損傷的密切相關(guān)性已得到了公認(rèn)，但為了進(jìn)一步掌握卵巢毒性損傷的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，仍需更加深入的研究。首先，在動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，重金屬不同暴露劑量和時(shí)間的表觀遺傳改變不盡相同，研究結(jié)果必然會存在差異，外推到人群尚有不小的難度，有必要進(jìn)行前瞻性的大隊(duì)列研究，以明確其致病作用。其次，表觀遺傳修飾在調(diào)控基因表達(dá)的同時(shí)，本身也受到多因素的調(diào)控，如鎘暴露于顆粒細(xì)胞后，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子c-myc促進(jìn)了miR-92a-2-5p的轉(zhuǎn)錄過程。如果能發(fā)現(xiàn)和證實(shí)更多調(diào)控miRNA表達(dá)的通路和機(jī)制，可為治療細(xì)胞損傷提供新的策略。最后，miRNA介導(dǎo)環(huán)境因素毒性的跨代遺傳是當(dāng)前生殖毒理學(xué)的研究前沿,生殖細(xì)胞可能作為媒介,在代際間傳遞表觀遺傳標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)有害環(huán)境影響的跨代遺傳。然而，該假說涉及的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，不同miRNA在不同代際生殖細(xì)胞中的表達(dá)并不相同，推測其因不同的基因靶向作用，受到更高層次的表達(dá)調(diào)控，從而維持生殖細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)。未來可通過系統(tǒng)比較動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果和人群臨床數(shù)據(jù)，研究這些跨代遺傳的精準(zhǔn)運(yùn)行機(jī)制。