牛榮威 綜述 楊 敏, 審校

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心消化科（廣東廣州 510120）；2.廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣東省人民醫(yī)院（廣東廣州 510080）

顆粒酶（granzymes，Gzms）是一類絲氨酸蛋白酶，主要由自然殺傷（nature killer，NK）細胞及細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）分泌，主要功能為誘導(dǎo)細胞凋亡[1]。迄今為止在人體中共發(fā)現(xiàn)了5種Gzms（A、B、H、K、M），而在小鼠中發(fā)現(xiàn)10種Gzms（A、B、C、D、E、F、G、K、M、N）。既往對于顆粒酶的研究主要集中于GzmB在細胞凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)其在Gzms誘導(dǎo)細胞凋亡過程中起主導(dǎo)作用。GzmA作為含量最豐富的顆粒酶，其誘導(dǎo)細胞凋亡能力僅次于GzmB，而某些魚類的GzmA 誘導(dǎo)細胞凋亡能力則強于GzmB[2]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，GzmA除了誘導(dǎo)程序性細胞死亡外，還在炎癥過程、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 GzmA的一般特性

1.1 GzmA的合成與調(diào)控

GzmA 的結(jié)構(gòu)類似于胰蛋白酶，切割位點位于精氨酸或賴氨酸之后，GzmA基因在人類及小鼠中分別位于5 號及13 號染色體，相對分子質(zhì)量為52 000[3]。Gzms在體內(nèi)的合成與釋放都需要經(jīng)過一系列相同的步驟。Gzms首先被合成為無活性的前體分子，前體分子中包含分選信號及N-末端二肽，在分選信號的引導(dǎo)下前體分子被引導(dǎo)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工。前體分子的N-末端二肽只能被細胞毒性顆粒中組織蛋白酶C（cathepsin C）分解，才能激發(fā)顆粒酶活性[4]。研究報道，組織蛋白酶C缺陷導(dǎo)致顆粒酶不能激活，與Papillon-Lefèvre綜合征（亦稱為掌跖角化-牙周破壞綜合征）發(fā)病相關(guān)[5]。當殺傷細胞識別特定的靶細胞時，殺傷細胞釋放細胞毒性顆粒進入與靶細胞之間形成的免疫突觸中，Gzms 通過細胞毒性顆粒中的穿孔素（peforin，PFN）進入靶細胞，激活胞內(nèi)特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而發(fā)揮作用[6]。Gzms 在體內(nèi)發(fā)揮作用受絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin家族的調(diào)控，Serpinb6b和Serpinb12能夠抑制外周循環(huán)中的GzmA[7-8]。

1.2 GzmA與細胞凋亡

細胞凋亡（apoptosis）是程序性細胞死亡的一種。既往研究發(fā)現(xiàn)，Gzms 的主要功能為誘導(dǎo)細胞凋亡，不同Gzms 誘導(dǎo)細胞凋亡所涉及的信號通路不完全一樣。GzmB 作用于線粒體產(chǎn)生細胞色素c，激活caspase 依賴途徑導(dǎo)致細胞凋亡[1]。而GzmA 主要通過非caspase 途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，通過PFN 進入靶細胞內(nèi)的GzmA 在熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70和HSP 90幫助下穿過線粒體膜，進入線粒體基質(zhì)GzmA 蛋白水解電子傳遞鏈（electron transport complex，ETC）中的NADH 脫氫酶（泛醌）鐵硫蛋白3（NADH dehydrogenase [ubiquinone] ferrithionein 3，NDUFS3），干擾線粒體的正常代謝功能，從而導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，通過ROS誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)SET復(fù)合物易位到細胞核，SET復(fù)合物釋放的NM23-H1和TREX-1兩種核酸酶能引起單鏈DNA損傷，從而導(dǎo)致細胞凋亡[3]。ETC結(jié)構(gòu)和功能的完整性在GzmA誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生中起重要作用，當用魚藤酮抑制ETC時，GzmA誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生以及細胞凋亡將會被抑制，另外當NDUFS3的水解位點突變時，ROS的產(chǎn)生以及細胞凋亡也會被抑制[3]。GzmA還可作用于DNA 雙鏈修復(fù)蛋白Ku 70，影響受損DNA 的修復(fù)[9]。

1.3 GzmA與細胞焦亡

細胞焦亡是近年來才發(fā)現(xiàn)的由Gasdermin所介導(dǎo)的程序性細胞死亡方式[10]。與細胞凋亡不同的是，細胞焦亡過程伴隨著炎癥發(fā)生，是一種促炎形式的細胞死亡[11]。既往認為，細胞焦亡的完成依賴于caspase活化[12]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，NK 細胞分泌的GzmA 通過穿孔素進入靶細胞內(nèi)，蛋白水解Gasdermin B 從而誘導(dǎo)細胞焦亡過程的發(fā)生，而且該過程不涉及caspase的活化[13]。進一步研究證實，該過程還能夠增強機體抗腫瘤能力[13]。

1.4 GzmA的滅菌能力

人類生活在充滿病原體的環(huán)境中，機體的免疫系統(tǒng)可以抵御病原體入侵。人類NK 細胞以及CTLs分泌的細胞毒性顆粒中還包含一種叫顆粒溶素（granulysin，GNLY）的蛋白[14]，其能幫助Gzms殺滅宿主細胞內(nèi)的細菌及寄生蟲。Gzms 和GNLY 可以通過PFN 形成的孔道進入被細菌感染的細胞內(nèi)，Gzms借助GNLY 進入胞內(nèi)的細菌體內(nèi)后作用于ETC 產(chǎn)生ROS，通過ROS誘導(dǎo)細菌快速死亡[15]。該過程可以通過殺死宿主細胞內(nèi)的細菌來增強機體的抗菌能力，而不是直接誘導(dǎo)宿主細胞死亡來減少細菌的復(fù)制。Gzms殺滅宿主細胞的寄生蟲過程與細菌相似，Gzms在PFN及GNLY的幫助下分別穿過細胞膜及寄生蟲膜，誘導(dǎo)寄生蟲產(chǎn)生ROS，摧毀其氧化防御系統(tǒng)，從而導(dǎo)致寄生蟲死亡[16]。在此過程中，胞內(nèi)寄生蟲會先于宿主細胞死亡，這能限制寄生蟲的進一步傳播。

2 GzmA與感染性疾病

2.1 GzmA誘導(dǎo)巨噬細胞分泌TNF-α抑制結(jié)核桿菌生長

研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者血清中的Gzms 和PFN水平低于健康人[17]。結(jié)核活動期與潛伏期血清中的GzmA水平較正常人顯著下降，而且活動期下降的更加明顯[18]。檢測血清中GzmA濃度可能為結(jié)核的診斷及鑒別帶來幫助。γ9δ2 T細胞對包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的病原微生物有很強的抑制作用，而人們既往對于具體機制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，其抑制作用與γ9δ2 T細胞產(chǎn)生的GzmA有關(guān)。GzmA誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α，通過TNF-α 抑制結(jié)核桿菌生長，并且GzmA水平與細胞內(nèi)分枝桿菌生長抑制之間存在高度顯著的相關(guān)性，敲除GzmA 將會損害γ9δ2T 細胞對結(jié)核桿菌的生長抑制作用[19]。

2.2 GzmA誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-6和TNF-α等細胞因子影響膿毒癥的發(fā)生發(fā)展

細菌性膿毒癥的發(fā)生與細菌侵入機體導(dǎo)致大量炎癥因子釋放有關(guān)。GzmA能刺激成纖維細胞和上皮細胞釋放促炎細胞因子IL-6和IL-8[20]，還能促進巨噬細胞產(chǎn)生IL-6[21]，提示GzmA在膿毒癥的發(fā)生中起一定的促進作用。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，敲除GzmA 的小鼠感染布魯菌發(fā)生膿毒癥時，小鼠的存活率會明顯上升，進一步研究證實這主要與NK細胞產(chǎn)生的GzmA刺激IL-1a、IL-1b、TNF-a、IL-6等炎癥因子的生成減少有關(guān)[22]。腹膜炎是誘發(fā)膿毒癥的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)于腹膜炎的膿毒癥患者血清中GzmA明顯升高[23]，提示GzmA在這一病理中起重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血中升高的GzmA將會誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α等促炎因子，加重膿毒癥的發(fā)展。當在小鼠實驗中使用Serpinb6b抑制GzmA的功能時,膿毒癥小鼠的生存率明顯升高[23]。是否可以通過使用GzmA的拮抗劑減少某些細胞因子的產(chǎn)生，達到預(yù)防膿毒癥的發(fā)生以及減緩敗血癥的發(fā)展有待進一步研究。

2.3 GzmA影響病毒復(fù)制

CD4+T 細胞是人體感染艾滋病病毒后被攻擊的主要免疫細胞，其數(shù)目及功能對評估治療效果及患者免疫功能具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，艾滋病早期血中HIV 特異性CD4+T 細胞所表達的GzmA 越高，CD4+T 細胞數(shù)目維持在正常范圍的時間越長，且血中HIV 滴度越低[24]。說明GzmA 對控制病毒復(fù)制具有重要作用，這或許能為評估艾滋病的治療效果提供重要工具。另一項研究發(fā)現(xiàn)，當感染奇昆古尼亞病毒（chikungunya virus）后，患者血中GzmA濃度會明顯升高，并且血中的病毒滴度和疾病評分與GzmA升高的水平相關(guān)[25]。以上研究說明GzmA能夠抑制某些病毒的復(fù)制,但其具體的機制需要進一步研究。

3 GzmA與非感染性疾病

3.1 GzmA 通過誘導(dǎo)破骨細胞分化影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，與破骨細胞被促炎細胞因子過度活化有關(guān)[26]。破骨細胞由骨髓內(nèi)未成熟的前體細胞轉(zhuǎn)化而來，前體細胞可以分泌TNF-α，促進自身成熟轉(zhuǎn)化為破骨細胞[27]。研究發(fā)現(xiàn)，GzmA可促進前體細胞TNF-α mRNA的表達，進而促進破骨細胞分化，在一定程度上可加重RA的病情[28]。IFN-γ、IL-6、IL-17、TNF 等促炎因子在RA 患者的血清中明顯升高，而在敲除GzmA 的RA 小鼠中發(fā)現(xiàn)，這些促炎因子在血清中的濃度明顯下降，證明這些促炎因子是GzmA刺激細胞釋放的來源之一[28]。敲除或阻斷GzmA的作用，或許能夠緩解RA的發(fā)生及發(fā)展，這為RA的治療帶來新的靶點。

3.2 GzmA通過調(diào)節(jié)IFN-I的表達影響1型糖尿病的發(fā)生

研究發(fā)現(xiàn)，GzmA缺陷可能也是1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）的易感因素之一，因為在T1D患者血清中發(fā)現(xiàn)，其T細胞表達的GzmA明顯下降，并且在動物實驗中證實，缺乏GzmA時，T1D的發(fā)生率會明顯上升[29]。在另一項研究中，實驗人員敲除非肥胖糖尿病小鼠的GzmA 基因發(fā)現(xiàn)，小鼠胰島中IFN-I 調(diào)節(jié)基因的表達與對照組相比明顯上升，IFN-I 能夠激活小鼠體內(nèi)的T 細胞，打破免疫耐受，導(dǎo)致胰島β 細胞被破壞[30]。同時，GzmA缺乏導(dǎo)致胰島及脾臟中的樹突狀細胞和NK 細胞單鏈DNA 異常積累。單鏈DNA作為一種內(nèi)源性信號，也能夠刺激局部IFN-I的產(chǎn)生，進一步加重胰島的破壞[30]，但具體的信號通路有待進一步研究證實。

3.3 GzmA激活腸癌細胞pSTAT3，促進腸道炎癥及結(jié)直腸癌的發(fā)展

潰瘍結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及結(jié)腸以及直腸，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重和不同程度的全身癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中GzmA的表達受CD4+T細胞調(diào)控，UC患者結(jié)腸細胞中GzmA水平較正常人升高[31]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在etrolizumab 單抗治療的UC 患者中，高水平的GzmA與UC的臨床緩解及黏膜愈合呈正相關(guān)[32]。一項關(guān)于UC患者罹患結(jié)腸癌的隊列研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，UC患者罹患結(jié)腸癌的風(fēng)險明顯增加[33]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，細胞外GzmA 能夠誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生IL-6，激活結(jié)腸癌細胞中的pSTAT3信號，間接促進腸道炎癥以及結(jié)直腸癌的發(fā)展[21]。當使用Serpin 6 b 拮抗GzmA的作用或敲除GzmA 后，腸炎小鼠結(jié)腸中的IL-6、TNF-α等炎癥因子水平明顯下降，小鼠的腸道炎癥明顯減輕并且大大減緩結(jié)腸癌的發(fā)展[21]。拮抗GzmA的作用可能成為UC以及結(jié)腸癌的新治療靶點。

綜上，目前研究表明GzmA介導(dǎo)細胞凋亡和細胞焦亡，誘導(dǎo)炎癥因子釋放，參與機體抵御致病菌感染，并與某些自身免疫性疾病及結(jié)腸腫瘤的發(fā)生有關(guān)，病理生理學(xué)機制尚未完全了解。GzmA在不同疾病中的作用機制不同，其血清或組織中的表達水平不同，GzmA表達水平對疾病的診斷和療效評估作用有待進一步研究。激活或抑制GzmA 與疾病發(fā)生進展相關(guān)，使用GzmA激動劑或抑制劑可能為疾病防治帶來新的靶點。