沈仕君
對(duì)大多數(shù)多細(xì)胞動(dòng)物來(lái)說(shuō),新生命起源于生殖細(xì)胞——精子和卵子,它們通過(guò)受精作用將遺傳信息從上一代傳遞到下一代,以維持種群的延續(xù)。精子和卵子都來(lái)自一類特殊的細(xì)胞——原始生殖細(xì)胞,它們是動(dòng)物個(gè)體在胚胎發(fā)育過(guò)程中最先產(chǎn)生的生殖細(xì)胞群體,也是未來(lái)成熟精子或卵子的發(fā)源地。原始生殖細(xì)胞如果出現(xiàn)問(wèn)題,將直接影響生殖細(xì)胞的發(fā)育、后代的健康,甚至種群的延續(xù)。所以,研究原始生殖細(xì)胞的命運(yùn)決定尤為重要。
基本發(fā)育路線
以小鼠為例,原始生殖細(xì)胞的基本發(fā)育路線大致可分為4個(gè)階段(特化——遷移——增殖——分化)。
具體來(lái)說(shuō):在小鼠懷孕后大約7.25天(E7.25),早期胚胎中的一群細(xì)胞(約40個(gè))會(huì)被誘導(dǎo)形成早期狀態(tài)的原始生殖細(xì)胞(即特化);隨著胚胎發(fā)育,這些細(xì)胞將最終遷移進(jìn)入生殖嵴中,這里是未來(lái)形成生殖器官的地方;一直到小鼠懷孕后大約13.5天(E13.5),原始生殖細(xì)胞都在生殖嵴中不斷分裂增殖;13.5天以后,原始生殖細(xì)胞開(kāi)始雌雄分化,雌性原始生殖細(xì)胞在13.5天后迅速進(jìn)行減數(shù)分裂,并最終停滯在第二次減數(shù)分裂時(shí)期等待受精(即卵子初步形成),而雄性原始生殖細(xì)胞則進(jìn)入發(fā)育停滯階段,直到出生后才會(huì)進(jìn)行減數(shù)分裂,形成成熟的精子[1]。
原始生殖細(xì)胞的高通量研究歷程
在很長(zhǎng)一段時(shí)間,有關(guān)原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的研究結(jié)果大多來(lái)自形態(tài)學(xué)研究和少量特定基因的探索。隨著21世紀(jì)基因組測(cè)序計(jì)劃的完成和二代測(cè)序技術(shù)的興起,對(duì)于原始生殖細(xì)胞的觀察和研究已不再局限于低通量單個(gè)基因的研究,高通量研究開(kāi)始成為一種新的趨勢(shì)。
在高通量研究中,科學(xué)家們首先選擇的突破口是轉(zhuǎn)錄組,因?yàn)樗梢詮娜址秶戏从乘谢虻淖罱K表達(dá)情況,直觀展示原始生殖細(xì)胞的分子生物學(xué)特征。目前科學(xué)家們已經(jīng)成功繪制小鼠原始生殖細(xì)胞各個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄組圖譜(PRJNA214836),鑒定出原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的諸多關(guān)鍵基因,如Blimp1、Prdm14、Tfap2c等,同時(shí)揭示了這些基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式,為深入研究原始生殖細(xì)胞發(fā)育中的基因調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
然而,由于轉(zhuǎn)錄組圖譜是眾多基因調(diào)控的最終結(jié)果,并不能及時(shí)反映上游的基因調(diào)控情況,所以僅僅依靠轉(zhuǎn)錄組來(lái)揭示細(xì)胞命運(yùn)是不夠精確的。于是,科學(xué)家們轉(zhuǎn)而選擇從表觀基因組的角度對(duì)原始生殖細(xì)胞的命運(yùn)進(jìn)行更精準(zhǔn)的研究。其實(shí)“表觀遺傳學(xué)”這一名詞由來(lái)已久,早在20世紀(jì)40年代,發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)家沃丁頓(C. Waddington)就提出了這一概念。形象地說(shuō),染色體DNA就像一本龐大的“百科全書(shū)”,而表觀遺傳學(xué)則是指導(dǎo)人們?nèi)绾稳ラ喿x這本“書(shū)”。
目前,科學(xué)家們已成功繪制出小鼠原始生殖細(xì)胞中的全基因組DNA甲基化圖譜(一種典型的表觀遺傳學(xué)研究方向)[2]。他們發(fā)現(xiàn),在原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷一次徹底的全基因組范圍的DNA甲基化清除過(guò)程,全基因組DNA甲基化水平最低時(shí)只有4%~5%。而隨后在形成精子和卵子的過(guò)程中,基因組的DNA甲基化又將重新建立。這種清除親代表觀遺傳信息,再為子代建立新的表觀遺傳信息的過(guò)程,對(duì)于維持種群的多樣性和環(huán)境適應(yīng)性是至關(guān)重要的。
染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)
相較于表觀遺傳學(xué)眾多的研究方向來(lái)說(shuō),目前對(duì)于原始生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展只局限于DNA甲基化這一方向,而對(duì)于原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的染色質(zhì)動(dòng)態(tài)變化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究更是鮮有報(bào)道。究其原因,主要是由于原始生殖細(xì)胞的數(shù)量過(guò)于稀少,在研究技術(shù)上存在瓶頸。早期的原始生殖細(xì)胞數(shù)量只有幾十個(gè),到小鼠懷孕12.5天以后也不過(guò)是數(shù)萬(wàn)個(gè)。而常規(guī)的高通量表觀遺傳學(xué)研究手段大多需要百萬(wàn)級(jí)別的細(xì)胞數(shù)量才能獲得較好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此,亟需開(kāi)發(fā)基于微量細(xì)胞的高通量表觀遺傳學(xué)研究方法,以進(jìn)一步對(duì)原始生殖細(xì)胞的命運(yùn)進(jìn)行探索。
2018年,有科學(xué)家開(kāi)發(fā)了基于微量DNA的限制性內(nèi)切酶I (DNase I)建庫(kù)測(cè)序(Low-input DNase-seq)技術(shù)[3],該方法通過(guò)減少反應(yīng)步驟和容器置換次數(shù),配合建庫(kù)后切膠再回收策略,在微量細(xì)胞(最少可以達(dá)幾百個(gè))中極大提升了測(cè)序效果。利用此項(xiàng)技術(shù),他們首次在小鼠和人的原始生殖細(xì)胞中觀察到全基因組范圍的染色質(zhì)開(kāi)放圖譜,極大地豐富了原始生殖細(xì)胞中的表觀遺傳研究類型。
科學(xué)家們進(jìn)一步以不同樣本中特異的染色質(zhì)開(kāi)放位點(diǎn)為依據(jù),成功繪制出原始生殖細(xì)胞的發(fā)育路徑[3]。他們發(fā)現(xiàn)雖然原始生殖細(xì)胞的發(fā)育路徑在性別上有著明顯的差異,但其發(fā)育方向卻是趨同的,這體現(xiàn)了生物體發(fā)育過(guò)程中“和而不同”的特點(diǎn)。同時(shí),科學(xué)家們還專門(mén)對(duì)全局范圍的染色質(zhì)開(kāi)放圖譜與轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)的比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)進(jìn)行細(xì)胞命運(yùn)預(yù)測(cè)要比轉(zhuǎn)錄組準(zhǔn)確得多,這進(jìn)一步驗(yàn)證了染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)在研究細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控上的優(yōu)勢(shì)。
除了能宏觀地描繪整個(gè)發(fā)育路徑外,染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)研究還能從微觀上揭示關(guān)鍵調(diào)控蛋白的潛在DNA結(jié)合位點(diǎn),從而揭示發(fā)育過(guò)程中的基因調(diào)控細(xì)節(jié)。而為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),科學(xué)家們需要找到染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域富集的基序,即模體,是染色質(zhì)上出現(xiàn)的獨(dú)特DNA序列片段,具有較強(qiáng)的特異性,可以被染色質(zhì)開(kāi)放探測(cè)技術(shù)所捕獲,是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子蛋白潛在的結(jié)合位點(diǎn)。
全基因組同源重組位點(diǎn)探測(cè)
減數(shù)分裂與同源重組
對(duì)于多細(xì)胞生物來(lái)說(shuō),細(xì)胞分裂有兩種關(guān)鍵類型:有絲分裂和減數(shù)分裂。其中,減數(shù)分裂與生殖細(xì)胞的產(chǎn)生密切相關(guān)。減數(shù)分裂的全過(guò)程可大致劃分為4個(gè)階段:間期Ⅰ、減數(shù)分裂Ⅰ、間期Ⅱ和減數(shù)分裂Ⅱ。其中減數(shù)分裂Ⅰ尤為重要,因?yàn)槠溟g會(huì)發(fā)生一個(gè)重要的生物學(xué)事件——同源染色體聯(lián)會(huì),最終會(huì)使每對(duì)染色體形成一個(gè)緊密相伴的二價(jià)體,又稱四分體。每條染色體的兩條染色單體之間稱為姐妹染色單體,同源染色體的不同染色單體之間稱為非姐妹染色單體。同源染色體聯(lián)會(huì)后,非姐妹染色單體的之間可發(fā)生片段互換,即交換,從而使得同源染色體之間的基因產(chǎn)生部分重新組合,即重組。整個(gè)過(guò)程統(tǒng)稱為同源重組,交換染色體的位點(diǎn)就稱為同源重組熱點(diǎn)[4]。
同源重組過(guò)程使生殖細(xì)胞在繼承父母源基因的同時(shí),又能使子代通過(guò)染色體片段交換獲得新的性狀,從而豐富DNA的多樣性。形象地說(shuō),這是一次生殖細(xì)胞的基因“大洗牌”,后代將擁有更多可能的基因組合。當(dāng)然,凡事總有兩面,雖然從基因組入手豐富性狀是非常經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的一種方法,但它也帶來(lái)了一定的風(fēng)險(xiǎn)。由于同源重組涉及DNA斷裂再修復(fù)的過(guò)程,一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤極易引起出生缺陷,所以科學(xué)家們一直致力于探尋同源重組過(guò)程背后的機(jī)制。
同源重組過(guò)程的分子機(jī)制研究
隨著對(duì)同源重組的深入理解,有關(guān)同源重組過(guò)程的研究也逐漸進(jìn)入分子生物學(xué)層面。2012年,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶PRDM9會(huì)在需要發(fā)生同源重組的位點(diǎn)附近標(biāo)記特定的組蛋白修飾信號(hào)(H3K4me3,組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸的三甲基化),這個(gè)信號(hào)會(huì)引導(dǎo)蛋白機(jī)器在這些指定位點(diǎn)進(jìn)行雙鏈斷裂,為同源重組做準(zhǔn)備[5]。而如果將PRDM9蛋白敲除,蛋白機(jī)器就會(huì)選擇其他帶有H3K4me3標(biāo)記的位點(diǎn)進(jìn)行雙鏈斷裂。而那些區(qū)域往往是啟動(dòng)子等具有重要生物學(xué)功能的地方。這樣異常的操作不僅不能實(shí)現(xiàn)豐富DNA多樣性的目的,反而還會(huì)造成基因的損壞,是極其危險(xiǎn)的。因此,PRDM9蛋白在同源重組中具有不可替代的作用。而科學(xué)家們恰好在晚期雌性原始生殖細(xì)胞的染色質(zhì)開(kāi)放信號(hào)中發(fā)現(xiàn)了屬于PRDM9的特異基序[3],這說(shuō)明PRDM9蛋白可能在這一時(shí)期發(fā)揮著調(diào)控同源重組的功能。
那么PRDM9蛋白的基序?yàn)楹翁禺惓霈F(xiàn)在晚期雌性原始生殖細(xì)胞中,而晚期雄性原始生殖細(xì)胞中則沒(méi)有呢?這就涉及雄性和雌性同源重組發(fā)生時(shí)期的重大差異。以小鼠為例,雄性生殖細(xì)胞一般在出生后(大約產(chǎn)后12天)才進(jìn)行同源重組,而雌性生殖細(xì)胞一般在出生前(大約懷孕后14.5天)進(jìn)行同源重組[1]。所以當(dāng)雌性生殖細(xì)胞發(fā)生同源重組時(shí),雄性生殖細(xì)胞離同源重組開(kāi)始還有很長(zhǎng)一段時(shí)間。
此外,這種時(shí)期不同步現(xiàn)象也造成了有關(guān)雌性和雄性生殖細(xì)胞研究進(jìn)展的巨大差距。正因?yàn)樾坌陨臣?xì)胞可以在出生后獲得,取材相對(duì)容易,所以對(duì)于雄性生殖細(xì)胞的同源重組分析已經(jīng)拓展到全基因組位點(diǎn)的高通量研究。早在2012年和2016年,科學(xué)家們就曾利用同源重組中兩個(gè)至關(guān)重要的蛋白DMC1和SPO11,實(shí)現(xiàn)了雄性生殖細(xì)胞全基因組同源重組熱點(diǎn)的探測(cè)[6,7]。而對(duì)于雌性生殖細(xì)胞而言,由于在其出生前還處于原始生殖細(xì)胞階段,取材困難且細(xì)胞數(shù)量較少,尚沒(méi)有很好的關(guān)于其同源重組位點(diǎn)的全基因組范圍的報(bào)道。
基于染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)的全基因組同源重組位點(diǎn)探測(cè)
那么有沒(méi)有機(jī)會(huì)在雌性生殖細(xì)胞的同源重組研究上再進(jìn)一步呢?目前已知:①雌性生殖細(xì)胞同源重組發(fā)生的時(shí)期是晚期雌性原始生殖細(xì)胞階段;②晚期雌性原始生殖細(xì)胞的染色質(zhì)開(kāi)放信號(hào)中富集著PRDM9蛋白的基序;③同源重組過(guò)程中伴隨著DNA雙鏈斷裂,而這種裸露的DNA恰好是限制性內(nèi)切酶I(DNaseI)所青睞的區(qū)域。似乎這些證據(jù)都在暗示利用染色質(zhì)開(kāi)放信號(hào)可以在全基因組范圍探測(cè)雌性生殖細(xì)胞的同源重組位點(diǎn)。那么事實(shí)是否如此呢?
科學(xué)家們通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)計(jì)算發(fā)現(xiàn),利用Lowinput DNase-seq技術(shù)所得到的DNaseI超敏感位點(diǎn)(DNase I hypersensitive site, DHS,可代表染色質(zhì)開(kāi)放程度較高的區(qū)域),配合同源重組過(guò)程中重要蛋白的已知全基因組坐標(biāo),如PRDM9、 DMC1等,可以很好地探測(cè)到雌性生殖細(xì)胞中全基因組范圍內(nèi)的同源重組位點(diǎn)[3]。同時(shí),科學(xué)家們通過(guò)小鼠品系特異性證明實(shí)驗(yàn)、DNaseI超敏感位點(diǎn)與同源重組熱點(diǎn)對(duì)應(yīng)證明實(shí)驗(yàn)等,確認(rèn)了上述探測(cè)方法的可靠性和高檢出效率。
此外,已知PRDM9蛋白會(huì)在同源重組過(guò)程中為即將進(jìn)行雙鏈斷裂的基因位點(diǎn)標(biāo)記組蛋白修飾信號(hào)H3K4me3。研究發(fā)現(xiàn),在同源重組之前(E13.5),同源重組熱點(diǎn)上幾乎沒(méi)有H3K4me3信號(hào),而只有當(dāng)發(fā)生同源重組的時(shí)候(E14.5),同源重組熱點(diǎn)上才會(huì)迅速建立H3K4me3信號(hào)。該結(jié)果很好地建立了遺傳物質(zhì)交換和表觀遺傳調(diào)控的相關(guān)性,進(jìn)一步強(qiáng)化了PRDM9蛋白在同源重組過(guò)程中的重要性。
對(duì)原始生殖細(xì)胞的染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)進(jìn)行研究,不僅豐富了有關(guān)原始生殖細(xì)胞的研究類型和實(shí)驗(yàn)方法,展現(xiàn)了整體發(fā)育過(guò)程中的諸多變化,同時(shí)也揭示了諸如同源重組等關(guān)鍵生物學(xué)事件的機(jī)制細(xì)節(jié)。其中,對(duì)于雌性原始生殖細(xì)胞全基因組同源重組位點(diǎn)的鑒定尤其具有重要意義,研究人員只需要1只胎鼠即可完成實(shí)驗(yàn),實(shí)現(xiàn)了個(gè)體水平上的位點(diǎn)檢測(cè),而2018年其他研究者利用傳統(tǒng)方法操作時(shí)則需要約300只胎鼠才能完成實(shí)驗(yàn)[8]。顯然,利用染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)策略更具推廣價(jià)值,特別是在人雌性原始生殖細(xì)胞樣本更難獲得的情況下。
關(guān)于原始生殖細(xì)胞還有很多未解之謎,但生命科學(xué)技術(shù)也同時(shí)在高速發(fā)展,期待在不久的將來(lái),該領(lǐng)域會(huì)涌現(xiàn)更多新的探索成果。
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