李丹，宋浩志，高維崧，劉興健，張志芳，李軼女

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR），俗稱(chēng)羊瘟，又稱(chēng)小反芻獸假性牛瘟，是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性、烈性、接觸性疾病[1]，其發(fā)病率和死亡率分別達(dá)到100%和90%[2]。該病于1940年首次發(fā)生于非洲象牙海岸，之后逐漸蔓延[3]。2003年以來(lái)，我國(guó)周邊的緬甸、老撾、俄羅斯等國(guó)家相繼爆發(fā)了嚴(yán)重的小反芻獸疫疫情[4]。2007年7月我國(guó)西藏自治區(qū)日土縣熱幫鄉(xiāng)龍門(mén)卡村發(fā)生PPR疫情后，又相繼發(fā)生了多起流行疫病[5]，且該病傳播速度快、風(fēng)險(xiǎn)高，對(duì)我國(guó)動(dòng)物疫情的防控造成極大的威脅[6]。我國(guó)已將其列為一類(lèi)動(dòng)物疾病，為最高關(guān)注級(jí)別。

目前，對(duì)于小反芻獸疫尚無(wú)有效的治療方法，主要通過(guò)研制疫苗進(jìn)行防控[7]。傳統(tǒng)疫苗如弱毒疫苗、滅活疫苗，雖然可以有效預(yù)防疫病的發(fā)生，但是無(wú)法通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物[8]，難以在PPR流行地區(qū)進(jìn)行有效的調(diào)查，且在保存、使用和接種等方面均易出現(xiàn)相關(guān)問(wèn)題[9]。近年來(lái)，基因工程疫苗取得了巨大的進(jìn)展，由于其具有安全、免疫效果可靠、易大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，在預(yù)防小反芻獸疫疫情中發(fā)揮重要作用。但作為一種新型疫苗，基因工程疫苗仍有較多需要改進(jìn)的地方[10]，如免疫效力有待提高及可能產(chǎn)生免疫耐受、插入突變等現(xiàn)象。近年來(lái)，PPR疫苗的研制仍是研究的熱點(diǎn)。

小反芻獸疫病毒屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬[11]，其基因組為單股負(fù)鏈RNA[12]，含有6個(gè)基因，依次為3′-N-P-M-F-H-L-5′，編碼核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和C、V 2種非結(jié)構(gòu)蛋白[13]。其中，PPRV的H基因全長(zhǎng)1 852 bp，編碼609個(gè)氨基酸，分子量約為70 kD[14]。PPRV H蛋白具有神經(jīng)氨酸酶及血凝素活性[15]，其是病毒表面的主要抗原，與宿主細(xì)胞表面受體連接，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[16?17]。因此，H蛋白可作為抗原進(jìn)行PPRV疫苗研究。本研究將H蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)菌株篩選及表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化提高H蛋白表達(dá)量，將該抗原制備為疫苗在小鼠中對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為H蛋白篩選出一種高表達(dá)條件，并對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的H蛋白免疫原性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶、DNA聚合酶、重組酶購(gòu)自北京諾維贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根生化（北京）科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、Protein marker購(gòu)自Thermo Scientific公司；鼠源PPRV H單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)皮比賴特研究所（Pirbright Institute）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Beyotime公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；佐劑Montanide GEL 02 PR購(gòu)自法國(guó)SEPPIC公 司；TOP10、BL21（DE3）、BL21（DE3）PLySs、Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、Vero細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保存；PPRV疫苗株（PPRV 75/1 Clone9）購(gòu)自天康生物技術(shù)公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；ELISA及包涵體純化所用試劑配方參照張偉業(yè)等[18]的方法。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；PPRV的H基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物合成及測(cè)序由北京睿博興科生物科技有限公司完成。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 目的基因的優(yōu)化合成從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找目前公布的小反芻獸疫H蛋白的氨基酸序列，利用Mega[19]軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出1條符合我國(guó)流行趨勢(shì)的氨基酸序列，對(duì)其進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)及信號(hào)肽分析。綜合考慮密碼子使用情況及臨近密碼子使用頻率等其他負(fù)面約束，對(duì)PPRV的H基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并在其5′端添加起始密碼子及BamHⅠ酶切位點(diǎn)，3′端添加終止密碼子及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，將該基因序列送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，合成的基因連接于pUC57載體上，并命名為pUC57-PPRV H。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)優(yōu)化后的

pUC57-PPRV H基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為PPRV H-F1:5′-CGGGATCCATGAGCGCGCAGCGTGAACGTATC-3′;PPRV H-R1:5′-CGGAATTCTTACACCGGGTTGCAGGTAACC-3′(下劃線處分別表示BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用膠回收試劑盒回收目的片段，利用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后在T4 DNA連接酶作用下連接于pET28a載體上，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在卡那抗性平板上篩選出陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，并用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至北京睿博興科生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET28a-PPRV H轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、BL21（PLySs）感受態(tài)細(xì)胞，在卡那抗性（50 mg·mL?1）平板中篩選陽(yáng)性菌落，挑取單菌落于4.5 mL相同濃度卡那抗性的無(wú)菌LB培養(yǎng)基中，置于37℃搖床220 r·min?1培養(yǎng)2.5～3.5 h，加入不同濃度IPTG誘導(dǎo)6～8 h，同時(shí)，設(shè)置未加誘導(dǎo)劑作為對(duì)照。8 000 r·min?1離心10 min收集菌體，并加入450 μL PBS重懸，按照破碎3 s停5 s的原則進(jìn)行超聲破碎，12 000 r·min?1離心10 min，收集上清及沉淀，分別取10 μL上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 融合蛋白的親和純化

在200 mL培養(yǎng)基中大量表達(dá)PPRV H蛋白，離心收集菌體。加入20 mL裂解緩沖液置于冰上裂解30 min，然后進(jìn)行超聲破碎（功率為200 W）5次，每次間隔2 min，12 000 r·min?1離心10 min，收集沉淀，用20 mL包涵體洗滌液Ⅰ和包涵體洗滌液Ⅱ洗滌1次，棄多余液體，沉淀中加入20 mL脲NTA-0 Buffer緩沖液于4℃過(guò)夜溶解。12 000 r·min?1離心10 min，取上清用0.45 μm濾器過(guò)濾后裝入鎳柱，收集穿透液重復(fù)上柱2次，分別用咪唑濃度為50、100、250 mmol·L?1的NTA-尿素緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)純化結(jié)果。

1.5 Western-blot分析及質(zhì)譜鑒定

將表達(dá)的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在3%的BSA中過(guò)夜封閉，將鼠源PPRV H單克隆抗體稀釋1 000倍后孵育1.5 h，再將HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG稀釋5 000倍孵育1.5 h，每次孵育前用PBST將多余液體清洗干凈。最后在膜上滴加化學(xué)發(fā)光液后置于化學(xué)發(fā)光儀中顯色。對(duì)鑒定正確的樣品，切取SDS-PAGE中大小合適的蛋白膠條置于PBS緩沖液中，送至上海歐易生物公司，使用Easy-nLC 1 200液相系統(tǒng)、高pH分離液相色譜儀等進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.6 重組蛋白PPRV H免疫小鼠

將購(gòu)買(mǎi)的Balb/c小鼠飼養(yǎng)至7周齡，取純化的PPRV H蛋白樣品20 μg與佐劑Montanide GEL 02 PR按照7∶1混合后腹腔多點(diǎn)注射小鼠，同時(shí)，設(shè)置PBS組作為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)10個(gè)重復(fù)。從一免2周開(kāi)始每周進(jìn)行眼球后靜脈取血，取得的血液室溫靜置2 h，2 000 r·min?1離心5 min分離血清。免疫3周后，以相同劑量進(jìn)行二次免疫，每周取血清置于?80℃冰箱保存。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清抗體滴度

對(duì)純化好的PPRV H蛋白用蛋白定量試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，用包被緩沖液稀釋至5 μg·mL?1，每孔100 μL加入96孔板中，置于4℃冰箱過(guò)夜包被。每孔加入300 μL 3% BSA，置于37℃培養(yǎng)箱封閉1.5 h。將小鼠血清從200倍開(kāi)始進(jìn)行2倍倍比稀釋后，每孔加入100 μL孵育1.5 h，同時(shí)將PBS組血清以相同倍數(shù)稀釋作為陰性對(duì)照。以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，每孔100 μL孵育1 h。每次抗體孵育前用PBST將多余液體清洗干凈。加入OPD顯色液于暗處顯色30 min，加入50 μL 2 mol·L?1硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀中492 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算P/N值，樣品組大于陰性對(duì)照2.1倍即為陽(yáng)性。

1.8 中和抗體檢測(cè)

將Vero細(xì)胞用含10%FBS及1‰青霉素鏈霉素（1∶1）的DMEM培養(yǎng)基稀釋至105個(gè)·mL?1，每孔100 μL加入96孔板中培養(yǎng)約10 h，待細(xì)胞完全貼壁。將小鼠血清置于56℃水浴鍋30 min使滅活補(bǔ)體，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行2倍倍比稀釋。將稀釋后的血清與等體積的100倍半數(shù)組織細(xì)胞感染量（median tissue culture infective dose，100 TCID50）PPRV疫苗株混合，置于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h。每孔200 μL加入培養(yǎng)好的Vero細(xì)胞中，每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空細(xì)胞對(duì)照組及病毒對(duì)照組。每天觀察細(xì)胞發(fā)病狀況，待病毒對(duì)照組全部發(fā)病時(shí)進(jìn)行記錄，能完全中和病毒的血清最大稀釋倍數(shù)即為血清的中和抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的優(yōu)化合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取小反芻獸疫H蛋白的氨基酸序列（GenBank:AJE30413.1），小反芻獸疫病毒H蛋白編碼609個(gè)氨基酸，對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)及跨膜區(qū)分析，結(jié)果顯示，PPRV H蛋白無(wú)信號(hào)肽，其36～58位為跨膜區(qū)序列。去除跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)序列，將其余氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后基因長(zhǎng)度為1 659 bp，通過(guò)密碼子適用指數(shù)（codon adaptation index，CAI）及GC含量預(yù)測(cè)其表達(dá)水平，結(jié)果顯示，H蛋白優(yōu)化后序列的CAI達(dá)0.94，表明該基因序列的密碼子使用情況較理想，GC含量為46.98%，在理想的GC含量范圍內(nèi)，預(yù)測(cè)該基因有較高的表達(dá)水平。將該序列送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出PPRV的H基因序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在1 600 bp附近出現(xiàn)清晰的目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1A），對(duì)其進(jìn)行回收后利用雙酶切法連入pET28a載體，在卡那抗性平板中篩選出陽(yáng)性菌株，提質(zhì)粒后用BamHⅠ與EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1B所示，在1 600 bp及5 300 bp附近分別出現(xiàn)目的基因及載體條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。將該質(zhì)粒送至北京睿博興科生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段相符，表明原核表達(dá)載體pET28a-PPRV H構(gòu)建成功。

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of the target gene and BamHⅠand EcoRⅠdigestion identification of the recombinant plasmid

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、BL21（DE3）PLySs感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)條件優(yōu)化后，篩選出表達(dá)量高的Rosetta（DE3）菌株在37℃、0.5 mmol·L?1IPTG誘導(dǎo)7 h進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，與未誘導(dǎo)組相比，IPTG誘導(dǎo)后在65 kD附近出現(xiàn)清晰條帶，與預(yù)期大小相符。且該蛋白主要出現(xiàn)在沉淀中，表明外源蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，可溶性表達(dá)較少（圖2）。

圖2 重組蛋白在Rosetta菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 Induced expression of recombinant protein in Rosetta strains

2.4 重組蛋白的親和層析純化及濃度測(cè)定

在大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌液中收集菌體，經(jīng)超聲破碎、離心、洗滌、溶解等步驟后，將包涵體樣品用鎳柱進(jìn)行親和層析純化，純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在咪唑濃度為100及250 mmol·L?1的NTA-脲洗脫液中均有單一蛋白被洗脫下來(lái)，大小與目的蛋白相符（圖3）。將純化得到的單一蛋白樣品混合后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，結(jié)果顯示，純化得到的蛋白濃度為108 μg·mL?1。

圖3 重組蛋白的鎳柱親和純化Fig.3 Nickel column affinity purification of recombinant protein

2.5 Western blot分析及質(zhì)譜鑒定

以PPRV H單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗對(duì)純化的樣品進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，在約65 kD附近出現(xiàn)清晰條帶，大小與預(yù)期一致，而對(duì)照中無(wú)相應(yīng)條帶（圖4），表明目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，且表達(dá)量較高。進(jìn)一步切取目的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明該蛋白為PPRV H蛋白。

圖4 重組蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein

2.6 重組蛋白免疫小鼠后血清抗體效價(jià)檢測(cè)

將20 μg純化的PPRV H蛋白樣品混合佐劑后以免疫小鼠，取血清后以0.5 μg H蛋白作為抗原進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測(cè)。一免2周時(shí)，樣品組吸光值明顯高于對(duì)照組，表明小鼠產(chǎn)生了PPRV H蛋白抗體，抗體滴度為1∶100。隨著時(shí)間延長(zhǎng)抗體滴度逐漸升高，在兩免2周時(shí)抗體滴度達(dá)到1∶6 400，表明H蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)（圖5）。

圖5 重組蛋白免疫小鼠后引起的抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.5 Detection of antibody titer caused by recombinant protein immunization in mice

2.7 重組蛋白免疫小鼠后血清抗體效價(jià)檢測(cè)

為測(cè)定血清對(duì)PPRV病毒的中和效價(jià)，進(jìn)一步對(duì)兩免2周時(shí)血清在Vero細(xì)胞上進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。如圖6所示，加入TCID50的病毒感染細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯聚集、皺縮等病變現(xiàn)象；當(dāng)加入的小鼠血清能完全抑制病毒擴(kuò)增時(shí)，無(wú)病變現(xiàn)象出現(xiàn)；空細(xì)胞對(duì)照組無(wú)病變現(xiàn)象。結(jié)果顯示，該血清對(duì)PPRV疫苗株具有明顯的中和效應(yīng)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算后，其中和抗體效價(jià)不高于1∶40。

3 討論

近年來(lái)，隨著生命科學(xué)的發(fā)展，小反芻獸疫疫苗的研發(fā)取得了明顯的進(jìn)展，滅活疫苗、基因工程疫苗、重組疫苗相繼問(wèn)世，對(duì)控制小反芻獸疫疫情蔓延具有重要作用。但這些疫苗通常需輔助劑以提高免疫效果，仍需開(kāi)發(fā)出可引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的疫苗，以有效控制該病在我國(guó)的蔓延，甚至消滅該病，因此，對(duì)小反芻獸疫疫苗的研制引起了人們廣泛關(guān)注。PPRV H蛋白是病毒粒子上的重要糖蛋白之一，具有神經(jīng)氨酸酶活性和血凝素活性，其主要作用是作為受體連接病毒和宿主細(xì)胞，調(diào)節(jié)病毒吸附及侵入，并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[7]，是機(jī)體主要的保護(hù)性免疫原。

Tian等[20]將H蛋白全長(zhǎng)克隆至pET28a載體上，并在Rosetta菌株中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化條件后其表達(dá)量仍較低，而選擇將H蛋白的主要抗原位點(diǎn)分段進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量明顯提高，且能引起宿主的免疫反應(yīng)，但抗原的完整性受到影響，進(jìn)而可能影響后續(xù)試驗(yàn)。2006年，陳勇軍等[21]發(fā)現(xiàn)，將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒GP5蛋白的跨膜區(qū)去掉，在原核表達(dá)系統(tǒng)中可明顯提高該蛋白的表達(dá)量，并證實(shí)去掉跨膜區(qū)的GP5蛋白仍能誘導(dǎo)良好的體液免疫和細(xì)胞免疫。因此，為高效表達(dá)具有免疫活性的H蛋白，可將H蛋白跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)序列去掉，保留其所有胞外區(qū)序列進(jìn)行表達(dá)。另外，丁軍穎等[22]發(fā)現(xiàn)，菌株濃度不同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)丁肝抗原蛋白的表達(dá)具有重大影響。王劼等[23]發(fā)現(xiàn)，菌株濃度、IPTG用量及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量均有顯著影響。因此，合適的表達(dá)條件對(duì)提高外源蛋白的表達(dá)量具有重要意義。本研究對(duì)表達(dá)菌株及表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出表達(dá)量高的菌株在合適的條件下表達(dá)H蛋白，為原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H蛋白提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前在大腸桿菌中表達(dá)PPRV H蛋白主要用于制備抗體[24]，本研究利用大腸桿菌Rosetta（DE3）菌株高效表達(dá)僅去除跨膜區(qū)的H蛋白，并對(duì)表達(dá)蛋白在小鼠中的免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)該蛋白在小鼠中引起了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，血清抗體滴度在兩免2周時(shí)達(dá)到1∶6 400，并產(chǎn)生了PPRV病毒的中和抗體，表明大腸桿菌表達(dá)的H蛋白具有良好的免疫原性及反應(yīng)原性，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，說(shuō)明原核表達(dá)的H蛋白作為PPRV亞單位疫苗的研究應(yīng)用前景良好。