田輝，王帥，劉波

中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類通常被認為安全的（generally recognized as safe，GARS）革蘭氏陽性菌，因其具有培養(yǎng)條件簡單、分泌系統(tǒng)良好、不含內毒素等特點，廣泛用于食品加工、藥物研制、工程酶生產等方面[1?2]。B.subtilis168于1997年完成全基因組測序[3]，為從分子水平上研究B.subtilis提供了可靠的信息平臺。便捷的遺傳轉化體系是實現B.subtilis基因操作技術的關鍵，目前，B.subtilis主要的轉化方法包括以下幾種方法。①原生質體轉化法[4]。原生質體是在溶菌酶作用下芽孢桿菌消除細胞壁后的細胞，在聚乙二醇（polyethylene glycol）介導下，促進細胞膜對外源DNA的吸附，進而完成轉化；②自然感受態(tài)法[5]。通過控制芽孢桿菌的培養(yǎng)條件，將枯草芽孢桿菌從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中轉接至營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，生長到特定的生長階段，形成感受態(tài)；③電擊轉化法[6]。在瞬時的電脈沖下，菌體上形成小孔，使DNA分子進入。這些方法普遍流程繁瑣，對操作技術要求極高，難以大面積推廣。

芽孢桿菌的自然感受態(tài)是細胞易于吸收外源DNA的一個特定理化狀態(tài)[7]，主要由ComX和CSF信息素組成的菌體密度感應網絡介導[8?10]，其中ComK是一個全局調控因子，能激活晚期感受態(tài)形成相關基因的表達，主要包括ComC、ComE、ComF等DNA轉運蛋白，參與DNA斷裂降解過程的核酸酶NucA以及重組交換相關的蛋白RecA、AddB等[11?12]，comK僅在嚴格的培養(yǎng)環(huán)境以及菌體生長階段才開始轉錄[13]，當ComK在胞內達到一定的閾值時，細胞即成為感受態(tài)。因此，comK的定量表達是細胞自然感受態(tài)形成的關鍵，并在B.licheniformis[14]以及B.pumilus[15]中得到應用，Zhang等[16]在枯草芽孢桿菌B.subtilis1A751菌株lacA位點，以紅霉素抗性篩選標記，整合1個木糖誘導啟動子調控的Pxyl-comK表達盒，建立了該菌株高效轉化體系，對于質粒轉化高達1×104CFU·μg?1。然而在基因組上整合一個誘導細胞感受態(tài)形成的元件存在兩個弊端：①菌株增加額外選擇性標記（通常為抗生素抗性基因）；②木糖誘導啟動子Pxyl存在一定的滲漏轉錄進而使comK持續(xù)表達，細胞內comK表達量本底高，導致細胞長期處于自然感受態(tài)狀態(tài)，從而吸收環(huán)境（培養(yǎng)基）中DNA片段并可能整合到染色體上，致使細胞性狀發(fā)生改變。因此，誘導感受態(tài)形成后，再消除感受態(tài)形成的元件可有效保障細胞性狀穩(wěn)定性。

本研究通過在E.coli和B.subtilis穿梭質粒pUBC01上引入Pxyl調控comK表達的元件，將其以游離質粒的形式導入B.subtilis并獲得重組菌株B.subtilisK1，通過木糖誘導時間的摸索與質粒消除等手段，確定該菌株最優(yōu)的轉化條件以及建立Pxyl?comK元件靈活的移除方法，以期在B.subtilis中創(chuàng)建一套便捷高效、不殘留篩選標記、不影響菌株穩(wěn)定性的遺傳轉化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒B.subtilisWB600為本實驗室保存；B.subtilisSCK6購自美國Bacillus Genetic Stock Center（BGSC）；大腸桿菌E.coliTop10感受態(tài)細胞購自康為世紀有限公司；含有質粒pUBC01的B.subtilisWB600-01為本實驗室保存；質 粒pUBC01[17]為 本 實 驗 保 存；質 粒pHY300-p43-egfp是 由 質 粒pHY300-PLK[18]骨架 上添加有p43-egfp表達盒[19]構建獲得，為實驗室保存；pUBC01-Pxyl-comK為本實驗室構建；研究中所使用的引物詳見表1。

1.1.2 試劑與儀器高保真DNA聚合酶以及無縫克隆試劑盒購于南京諾維贊技術有限公司；瓊脂糖購自莫納生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶AscⅠ、PacⅠ購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；卡那霉素和四環(huán)素購自北京索萊寶科技有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為進口或國產分析純。

PCR儀及基因電擊導入儀（Bio-Rad公司）；立式冷凍離心機（HITACHI公司）；電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（天能科技有限公司）；恒溫金屬儀（杭州奧盛儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海旻泉儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（上海尤尼科儀器有限公司）；藍光透射儀[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.1.3 培養(yǎng)基及相關試劑LB液體培養(yǎng)基（固體添加2%瓊脂粉）：1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化鈉，121℃滅菌；碘液：2 g碘化鉀，1 g碘，將碘化鉀溶于少量水中，全部溶解后再加碘，攪拌充分溶解后，加水定容至300 mL，避光保存。

1.2 研究方法

1.2.1 質粒pUBC01-Pxyl-comK的構建以B.sub?tilisSCK6基因組為模板，引物PxylF/TTRR擴增Pxyl-comK表達盒，將其擴增片段凝膠回收后，重組法連入AscⅠ和PacⅠ同時酶切后的pUBC01質粒，熱激轉化E.coliTop10感受態(tài)，涂布含有50 μg·mL?1卡那霉素的LB平板，過夜培養(yǎng)。用質粒上引物01seqF/01seqR，進行菌液PCR驗證，取陽性轉化子的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，選取測序正確的菌株，用質粒小提試劑盒提取pUBC01-Pxyl-comK質粒。采用高滲法[6]轉化B.subtilisWB600，得到菌株B.subtilisK1。

表1 研究所用引物列表Table 1 List of primers used in research

1.2.2B.subtilisK1的優(yōu)化分別挑取含有質粒pUBC01的B.subtilisWB600-01和 含 有 質 粒pUBC01-Pxyl-comK的B.subtilisK1菌株，置于含有20 μg·mL?1卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min?1，過夜培養(yǎng)，分別將菌液按5%的比例轉接至新鮮的含有20 μg·mL?1卡那霉素的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，B.subtilisWB600-01轉接1組，B.subtilisK1轉接2組（每組設3個平行）。培養(yǎng)OD600至1.0左右時，在B.subtilisWB600-01以及B.subtilisK1其中1組中添加木糖至終濃度為1%（質量體積比分數），B.subtilisK1的另一組不添加木糖。每隔1 h取出100 μL新鮮的培養(yǎng)液，添加100 ng的pHY300-P43-egfp質粒，37℃，220 r·min?1，共培養(yǎng)1.5 h，涂布含有10 μg·mL?1四環(huán)素的LB平板，37℃，倒置培養(yǎng)，次日統(tǒng)計轉化子數目。挑取轉化子于450 μL LB（含有10 μg·mL?1四環(huán)素）的EP管中，37℃，220 r·min?1，培養(yǎng)3 h，置于藍光透射儀下觀察熒光。

1.2.3 質粒pUBC01-Pxyl-comK的消除分別取含有pHY300-P43-egfp質粒的B.subtilisK1菌株的100 μL菌液，于含有10 μg·mL?1四環(huán)素的5 mL LB培養(yǎng)液中，以及同時含有10 μg·mL?1四環(huán)素和20 μg·mL?1卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中，在2類LB培養(yǎng)液中各添加1%的木糖，培養(yǎng)12 h后，稀釋涂布于對應抗性LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)。長出單菌落后，挑取單菌，同時點接至四環(huán)素抗性（10 μg·mL?1）和卡那霉素抗性（20 μg·mL?1）LB平板，對比2個平板的菌落生長情況，同時，通過引物01seqF/01seqR驗 證pUBC01-Pxyl?comK，引 物pHseqF/pHseqR驗證pHY300-p43-egfp。

1.2.4 菌株B.subtilisK1基因敲除選擇B.subti?lisK1的α-淀粉水解酶編碼基因（amyE）作為整合位點，以B.subtilisWB600基因組為模板，用amyE-LF和amyE-LR擴 增amyE左 臂 同 源 序 列amy-L；用amyE-RF和amyE-RR擴增右臂同源序列amy-R；用Tet-F/Tet-R擴增pHY300-P43-egfp上四環(huán)素抗性表達盒Tet；同時以amyE-L，amyE-R以及Tet回收片段為模板，用引物amyE-LF/amyE-RR，通過overlap-PCR程序將上述3個片段融合成片段LTR，回收LTR片段并轉化B.subtilisK1誘導感受態(tài)細胞，涂布含有10 μg·mL?1四環(huán)素LB平板，37℃倒置培養(yǎng)。次日，挑取轉化子，用位點側翼引物amyE-VF/amyE-VR進行PCR驗證。分別挑取WB600菌株以及ΔamyE菌株，點接于含有1%淀粉的LB固體平板上，培養(yǎng)24 h，均勻噴灑碘液，觀察水解透明圈的形成情況。

2 結果與分析

2.1 表達盒Pxyl-comK擴增以及穿梭質粒的構建

構建含有Pxyl?comK表達盒的穿梭質粒，在枯草芽孢桿菌中建立以游離型質粒為基礎的木糖誘導感受態(tài)的遺傳轉化體系。以B.subtilisSCK6菌株基因組為模板，擴增Pxyl-comK表達盒，片段大小為2.4 kb（圖1A），回收的片段連入pUBC01質粒，通過質粒上引物驗證，pUBC01質粒對照為0.3 kb，陽性轉化子為2.7 kb。挑取的4個轉化子均為陽性轉化子，測序正確后，將pUBC01-Pxyl?comK質粒電擊轉化B.subtilisWB600得到菌株B.subtilisK1，即完成了誘導感受態(tài)菌株的創(chuàng)建（圖1B）。

圖1 Pxyl?comK表達盒的擴增以及pUBC01-Pxyl-comK的PCR鑒定Fig.1 Amplification of Pxyl?comK cassette and verification of plasmid pUBC01-Pxyl-comK by PCR

2.2 木糖誘導B.subtilis K1感受態(tài)的優(yōu)化及熒光觀察

含有質粒pUBC01的B.subtilisWB600-01在添加木糖和pHY300-P43-egfp質粒共培養(yǎng)后，未產生轉化子，說明B.subtilisWB600出發(fā)菌株，在LB培養(yǎng)條件下，不會吸收外源DNA。對于菌株B.subtilisK1，隨著木糖誘導時間的延長，pHY300-P43-egfp質粒轉化效率逐步升高，在第4小時，轉化效率最高，達到4.8×103CFU·μg?1；到第5～6小時，轉化效率逐漸降低，可能ComK在胞內維持合適的濃度，更利于感受態(tài)的形成以及質粒轉化。此外，不添加木糖的B.subtilisK1對照組，從2 h開始，有少量的轉化子出現，可能是木糖誘導啟動子Pxyl存在一定的本底轉錄而導致comK滲漏表達，促進細胞形成感受態(tài)而吸收外源DNA片段（圖2）。

木糖誘導的B.subtilisK1感受態(tài)添加質粒pHY300-p43-egfp后轉化效率顯著提高，產生的轉化子對10 μg·mL?1的四環(huán)素表現出明顯的抗性。由于轉化質粒上含有p43-egfp表達盒，可通過熒光檢測判斷陽性轉化子。隨機挑取的8個轉化子均能產生顯著的熒光，進一步證明該木糖誘導轉化體系具備較高的準確性（圖3）。

2.3 pUBC01-Pxyl-comK質粒的消除

由于Pxyl-comK存在微量的本底轉錄，有影響菌株穩(wěn)定性的風險，可采取質粒消除的策略進行規(guī)避。挑取含有綠色熒光的轉化子，分別在添加1%木糖的單抗或雙抗LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，稀釋涂布，挑取單菌到四環(huán)素抗性LB平板上，同時，轉接到卡那霉素抗性LB平板上。雙抗培養(yǎng)條件下，挑取的單菌既能在四環(huán)素平板上生長，又能在卡那霉素平板生長，說明雙抗培養(yǎng)能使WB600同時 保 持pUBC01-Pxyl?comK和pHY300-p43-egfp質粒（圖4A、B）。四環(huán)素單抗培養(yǎng)條件下，挑取的96個單菌中，只有7個對卡那霉素有明顯的抗性，即大部分菌株實現pUBC01-Pxyl?comK質粒成功丟失（圖4C、D）。對C平板上的1～5號單菌進行PCR驗證，挑取的5個單菌含有pHY300-p43-egfp質粒的擴增條帶，而不含有pUBC01-Pxyl?comK質粒的擴增條帶，與抗性實驗結果一致，說明pUBC01-Pxyl?comK作為可移動的誘導感受態(tài)質粒，可在添加卡那霉素條件下培養(yǎng)，使之在B.subtilisK1穩(wěn)定遺傳，以便后續(xù)的遺傳轉化，也可完成單輪轉化后使之消除，以保障菌株性狀穩(wěn)定（圖5）。

2.4 WB600的基因amyE的敲除

為探究木糖誘導B.subtilisK1感受態(tài)可否適用于染色體基因的編輯，構建以四環(huán)素抗性基因Tet為篩選標記的PCR整合片段。分別擴增了amyE-L、amyE-R以及Tet片段，三者通過overlap-PCR融合在一起，形成LTR整合片段（圖6A），回收PCR產物直接轉化B.subtilisK1感受態(tài)，用位點側翼引物amyE-VF/VR驗證轉化子，WB600出發(fā)菌株理論條帶大小為2.1 kb，發(fā)生位點整合的轉化子理論條帶為2.8 kb。挑取的4個單菌的條帶顯著高于對照，且符合預期大小，說明PCR產物可與位點發(fā)生同源雙交換整合（圖6B）。amyE為α-淀粉酶，可催化淀粉水解，并通過淀粉碘液反應鑒定，該酶對應的編碼序列也是芽孢桿菌中常用的整合位點[20?21]。在含有1%可溶性淀粉的LB平板上，噴灑碘液后，WB600野生型有明顯的透明圈產生，而amyE敲除菌株不產生透明圈，且菌體形態(tài)較小（圖7）。上述的實驗結果表明該木糖誘導轉化體系同樣適用于對芽孢桿菌染色體的基因編輯，是一套快速便捷且完善的遺傳轉化體系。

圖2 B.subtilis K1菌株不同誘導時間的單位轉化效率Fig.2 The transformation efficiency of strain B.subtilis K1 under different induced times

圖3 轉化結果以及熒光的觀察Fig.3 The result of transformation and fluorescence visualization

圖4 抗生素抗性驗證質粒pUBC01-Pxyl?comK的消除Fig.4 Identification of plasmid pUBC01-Pxyl?comK elimination by antibiotic resistance assay

圖5 PCR驗證pHY300-p43-egfp以及pUBC01-Pxyl-comK質粒Fig.5 PCR verification of pHY300-p43-egfp and pUBC01-Pxyl-comK plasmids

圖6 整合片段的擴增及amyE敲除菌株的PCR驗證Fig.6 Amplification of integration fragments and PCR vertification of strains with amyE knocked out

3 討論

枯草芽孢桿菌因具有蛋白分泌能力強、培養(yǎng)發(fā)酵方便等特點，廣泛地應用于酶的生產以及小分子化合物的合成。除了深入對芽孢桿菌代謝調控機制的研究以及發(fā)酵培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，構建快速便捷、成功率高的遺傳操作技術，也是加快芽孢桿菌應用的重要手段。

圖7 淀粉水解實驗Fig.7 Starch hydrolysis experiment

選取枯草芽孢桿菌感受態(tài)形成的關鍵調控基因comK，將含有Pxyl-comK表達盒的質粒轉化B.subtilisWB600中，實現了質粒pHY300-P43-egfp高達4.8×103CFU·μg?1的轉化效率，能達到質粒常規(guī)轉化以及突變體建庫的要求，后期可通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分以及木糖的誘導濃度，或采用多聚體質粒轉化等方法進一步提高其轉化效率[6,22?23]。此外，由于Pxyl啟動子有一定的本底轉錄[24]，即使在不添加木糖培養(yǎng)條件下，滲漏表達的ComK也會調控下游感受態(tài)形成相關基因的轉錄，使細胞吸收外源DNA，影響菌體生長以及性狀的穩(wěn)定性。將Pxyl-comK表達盒搭載在游離質粒上，在完成誘導轉化后，可在無選擇壓力條件下連續(xù)培養(yǎng)，質粒會丟失，避免因comK滲漏表達而導致的菌株性狀不穩(wěn)定。此外，該誘導芽孢桿菌感受態(tài)的方法同樣適用于染色體基因的編輯，含有同源臂以及四環(huán)素抗性篩選標記的PCR產物可直接轉化芽孢桿菌誘導感受態(tài)，敲除amyE基因，使B.subtilisWB600失去水解淀粉的活性。在芽孢桿菌中建立的木糖誘導型遺傳轉化體系與常規(guī)芽孢桿菌的轉化體系[4?6]相比，具有流程簡便、周期短等優(yōu)點，充分利用Comk調控芽孢桿菌感受態(tài)形成的特性，又能通過質粒消除規(guī)避其造成的負面影響，是一套較完善的芽孢桿菌轉化體系，未來可在該誘導感受態(tài)的基礎上，結合誘導毒性蛋白MazF這種負向篩選的手段[25?26]，在枯草芽孢桿菌中建立綠色的、無篩選標記殘留的基因敲除體系，從而避免由于抗生素抗性基因漂移造成的風險。