李彥嬌，高媛，王磊，2*，張?zhí)m，2*

1.中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081；

2.三亞中國農業(yè)科學院南繁研究院，海南 三亞572000

早在1922年，Evans和Bishops就發(fā)現了維生素E。當小鼠體內缺乏一種脂溶性小分子化合物時會致其不育[1]，由于這類物質能夠影響動物的生殖機能，因此被命名為生育酚。但直到1936—1937年，維生素E的化學結構才被確定下來。生育酚（tocopherol）、三烯生育酚（tocotrienol）的結構均是由芳香環(huán)頭部連接來自于類異戊二烯的疏水尾巴，二者最大的區(qū)別是生育酚的植基側鏈是飽和的，而三烯生育酚的植基側鏈含有3個不飽和雙鍵。根據芳香環(huán)頭部含有甲基的數目和位置的不同，分別有α、β、γ、δ四種形式的生育酚和三烯生育酚。盡管維生素E只能在植物或者光合細菌等光合組織合成，但維生素E的功能最早是在動物中發(fā)現的，主要歸因于在動物中最早發(fā)現了α-生育酚轉運蛋白（α-tocopherol transfer protein,α-TTP）[2]。維生素E在動物體內具有抗氧化、降低膽固醇、抗腫瘤、預防心腦血管疾病和神經保護等重要生理功能。近年來的研究發(fā)現，維生素E在植物體內也至關重要，其可以清除活性氧，阻止脂質過氧化，保護光系統(tǒng)和維護生物膜的穩(wěn)定性；還參與植物生長發(fā)育、糖類運輸和信號轉導，能夠提高植物對非生物逆境的適應性[3]。

植物中生育酚分布較為廣泛，而三烯生育酚分布范圍較小，并且其生物活性和生物利用率均較低[4]，所以早期的工作主要集中于生育酚的功能及其生物強化研究[3,5]。但近年來研究發(fā)現，三烯生育酚的抗氧化功效遠高于生育酚。從醫(yī)學應用來講，三烯生育酚具有強大的神經保護、抗癌以及降低膽固醇的功能，而且，口服三烯生育酚還可以保護腦細胞免受損傷，這些都是生育酚所不具備的功能[6?8]。因此，三烯生育酚的研究逐漸成為近年來的研究熱點。三烯生育酚主要產生于多種單子葉植物中，如大麥、小麥、燕麥、黑麥、水稻、油棕櫚、椰子等，而目前的報道尤以棕櫚油中三烯生育酚的含量最高[9]。由于三烯生育酚具有保持人體和動物健康的特性，現在已經從米糠和棕櫚油的脫臭餾出物提取三烯生育酚用于商業(yè)化生產[7?8,10?11]。但由于總體上三烯生育酚的含量較低，仍需要利用基因工程的手段提高其含量。隨著三烯生育酚合成途徑日漸清晰，人們也已經開始了其生物強化研究。目前報道較多的就是利用三烯生育酚生物合成途徑的第一個關鍵酶基因HGGT的高表達來提高三烯生育酚的含量[12?14]。本文從三烯生育酚的合成途徑入手，針對三烯生育酚的生物學功能、生物強化等方面的研究進展進行綜述，并對其將來的研究方向提出展望。

1 三烯生育酚的生物合成及分布

三烯生育酚和生育酚具有相似的生物合成途徑，均在質體中發(fā)生，它們的前體物質分別是尿黑酸（homogentisate,HGA）和牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl-pyrophosphate,GGPP）、HGA和植基焦磷酸（phytyl-pyrophosphate,PPP）[3]。HGA來自于莽草酸途徑的4-羥基丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate，HPP）經4-羥基丙酮酸二加氧酶（p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）的催化生成，是三烯生育酚和生育酚合成的共同前體物質；PPP和GGPP則主要來自于非甲羥戊酸途徑。尿黑酸牻牛兒牻牛兒基轉移酶（homogentisate geranylgeranyl-transferase,HGGT）催 化GGPP和HGA發(fā)生縮合反應起始三烯生育酚的合成[8，15]，接下來經由生育酚環(huán)化酶（tocopherol cyclase,TC/VTE1）、2-甲基-6-植基苯醌甲基轉移酶（MPBQ methyltransferase,MPBQ MT/VTE3）、γ-生育酚甲基轉移酶（γ-tocopherol methyltransferase,γ-TMT/VTE4）的催化生成α-、β-、γ-、δ-四種不同組分（圖1）。

圖1 三烯生育酚/生育酚的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of tocotrienol/tocopherol

三烯生育酚主要產生于多種單子葉植物種子中，如大麥、小麥、燕麥、黑麥、水稻、油棕櫚、椰子等[9]。目前棕櫚油中三烯生育酚的含量最高，達到550 mg·kg?1，且α-、β-、γ-、δ-三烯生育酚四種組分均存在，而以γ-形式存在的三烯生育酚含量最高[16]；米糠中三烯生育酚的含量僅次于棕櫚油，達到465 mg·kg?1。

2 三烯生育酚的生物學功能

三烯生育酚和生育酚具有相似的結構，因此三烯生育酚也具有生育酚所具有的一些功能，如抗氧化等[17]。由于三烯生育酚具有不飽和植基側鏈，因此三烯生育酚又具有了一些不同于生育酚的功能，比如三烯生育酚的不飽和側鏈使其能夠有效地穿透含有飽和脂肪層的組織，如肝臟和腦組織等，更好地分布在細胞膜的脂肪層，從而有更優(yōu)越的抗氧化功能和清除自由基作用[18]；三烯生育酚的側鏈可以增加代謝中間產物法尼醇的含量，從而抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）的活性，因此三烯生育酚具有降低膽固醇的功能；三烯生育酚還具有抗血管生成的特性，且細胞攝取潛力是生育酚的70倍[8,19]。

2.1 抗氧化作用

維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，通過氧化還原反應，清除自由基，阻止脂質過氧化反應的發(fā)生。Matringe等[20]研究了生育酚和三烯生育酚在植物體內的抗氧化功能。轉HPPD?PDH基因煙草葉片中三烯生育酚含量大幅提高；在高光脅迫下，野生型和轉基因煙草幼葉中糖積累相似，但轉基因煙草葉片中三烯生育酚含量下降，表明在清除氧自由基過程中消耗了維生素E，同時也表明三烯生育酚可以作為有效的抗氧化劑保護膜脂免受過氧化損傷。Che等[21]在高粱中過表達HGGT基因和類胡蘿卜素合成途徑關鍵酶基因DXS、PSY和CRTⅠ，研究結果表明，轉基因高粱中不但三烯生育酚和β-胡蘿卜素得到大量積累，而且β-胡蘿卜素的儲存穩(wěn)定性得到了大幅提高，表明三烯生育酚起到了應有的抗氧化作用，使得β-胡蘿卜素免受氧化降解。Salimath等[6]在棉花種子中過表達HGGT基因，使得三烯生育酚含量大幅提高，更主要的是利用該轉基因棉花種子提取的棉籽油中三烯生育酚含量升高，不但增加了棉籽油的營養(yǎng)成分，更有利于人體健康，而且延長了棉籽油的貨架期。

三烯生育酚的抗氧化作用在減緩動脈粥樣硬化發(fā)展上有重要意義，可改善動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）。AS會引起冠心病、腦梗死、外周血管病等疾病，而三烯生育酚的抗氧化能力可以有效地抑制體內形成低密度脂蛋白、氧化型低密度脂蛋白以及甘油三酯，從而抑制形成動脈粥樣硬化斑塊[22]。Valenza等[23]對大鼠肝臟微粒體膜質過氧化過程的研究顯示，α-生育酚和α-三烯生育酚在清除自由基的能力上幾乎沒有差異，但α-三烯生育酚的抗氧化活性比α-生育酚更強，前者約是后者的40倍；同時保護細胞色素P450的能力也更強，前者為后者的615倍。這也反映了三烯生育酚具有比生育酚更廣闊的應用前景。

2.2 抗癌、抗炎作用

炎癥的本質是機體受到刺激時的一種防御反應。癌是指起源于上皮組織的惡性腫瘤。炎癥反應在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡變、侵襲和轉移等不同的階段中起決定性作用[24?25]。生育酚和三烯生育酚均能通過降低血清中C反應蛋白（C-veactive protein,CRP）、晚期糖基化終末產物水平以及細胞黏附分子的表達來起到抗炎作用，但是三烯生育酚的作用大于生育酚[26]。Ahn等研究了γ-三烯生育酚對NF-κb活化通路和NF-κb調節(jié)凋亡的基因產物的影響，結果表明，三烯生育酚通過抑制誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,INOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenas-2,COX-2)的產生以及抑制核轉錄因子NF-κB的表達來實現抗炎活性[27?28]。多項研究發(fā)現，三烯生育酚通過調節(jié)NF-κB信號途徑、PI3 K/AKT信號途徑、MAPK途徑來實現抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡和抗血管生成的作用[29?31]。

另外，三烯生育酚還可以對機體免疫細胞及免疫因子的表達進行調節(jié)，從而提高免疫力，預防癌癥[32?34]。Ren等[32]通過對幼齡(4月齡)和老齡(23月齡)C57BL/6小鼠飼喂三烯生育酚和含有等量生育酚的飲食6周，發(fā)現老齡小鼠三烯生育酚干預組體內淋巴細胞增殖能力明顯高于對照組，而幼鼠無明顯差異，結果表明三烯生育酚在改善與年齡相關的T細胞功能下降方面有重要意義。Mahalingam等[33]研究了補充TRF（富含三烯生育酚的組分）對正常健康人體破傷風類毒素免疫應答的影響，結果發(fā)現，補充TRF顯著增加了志愿者血漿中的總維生素E水平，TRF具有免疫刺激效應和潛在的臨床益處，可以增強對疫苗的免疫反應。

2.3 神經保護作用

癲癇、帕金森病等神經系統(tǒng)的疾病病理損傷的主要機制是血谷氨酸水平升高介導的神經興奮性毒性。研究發(fā)現，三烯生育酚處于高濃度時通過抗氧化特性進行神經保護作用，而低濃度時則通過不依賴于抗氧化特性的機制進行神經保護作用。Khanna等[35]在研究亞油酸誘導的神經毒性時發(fā)現，亞油酸會導致氧化劑損傷和隨后的神經毒性，研究結果證實微摩爾的α-三烯生育酚起到了保護神經元的抗氧化劑的作用。而在納摩爾濃度下，三烯生育酚調節(jié)特定的神經退行性信號過程[36?38]。Sen等[38]的研究發(fā)現，納摩爾級的α-三烯生育酚可以完全行使神經保護的功能。納摩爾級的低作用量標志著α-三烯生育酚的神經保護功能不是通過抗氧化來修復損傷，而是通過調節(jié)神經變性信號實現的。Khanna等[39]的研究首次證實谷氨酸誘導的cpla2改變是一種新的神經保護機制，可在納摩爾濃度的α-三烯生育酚作用下觀察到，據此已經建立了依賴三烯生育酚抗氧化特性的神經保護作用機制以及不依賴于抗氧化特性的神經保護作用機制。

三烯生育酚的神經保護功能也不僅局限于抗谷氨酸上，其還能應對谷胱甘肽、高半胱氨酸缺乏以及亞麻酸感應的氧化壓力[35?37]。Osakada等[40]的研究發(fā)現，從棕櫚油中分離得到的三烯生育酚可顯著減輕過氧化氫誘導的神經毒性，還可顯著保護超氧化物供體百草枯、一氧化氮供體S-亞硝基半胱氨酸和3-嗎啉嘧啶的細胞毒性；另外，α-三烯生育酚在紋狀體神經元培養(yǎng)中顯示出最強的神經保護作用。

2.4 降低膽固醇的功能

血液中膽固醇過多是心血管疾病的主要病因，因此，降低膽固醇是預防心血管疾病的有效手段。人們一般會通過合理飲食、適當運動、服用藥物等來降低膽固醇含量。近年來的研究發(fā)現，三烯生育酚具有降低膽固醇的作用。Qureshi等[41?42]的研究發(fā)現，大麥中提取的三烯生育酚既抑制了肝臟中膽固醇合成途徑的限速酶HMG-CoA還原酶的活性，又降低了血清中低密度脂蛋白(LDL)膽固醇水平，從而降低了膽固醇的生物合成水平。Cicero[43]分析認為，三烯生育酚通過干預HMG-CoA還原酶基因的轉錄后調控來調節(jié)該基因的表達，并能加速HMG-CoA還原酶的分解，從而影響膽固醇的合成。Parker等[44]在動物細胞水平上的研究結果也證明了三烯生育酚是通過HMG-CoA還原酶的轉錄后抑制方式來降低膽固醇含量的。

以上研究結果說明，人們可以通過食用含有三烯生育酚的食物來預防心血管疾病、神經受損性疾病，抵抗炎癥預防癌癥等，這也對三烯生育酚的生物強化提出了更高的要求。但是目前存在的主要問題是，三烯生育酚的吸收利用率較低，這也是未來研究的一個重要課題。

3 三烯生育酚的生物強化

由于三烯生育酚重要的生物學功能，人們已經根據其合成途徑開展了生物強化研究。從三烯生育酚的合成途徑來看，HGGT是其合成途徑的第一個關鍵酶基因，因此HGGT已經被作為首選基因來研究三烯生育酚的生物強化。同時，人們在利用合成途徑中其他關鍵酶基因研究維生素E生物強化時，也意外地提高了三烯生育酚的含量。這表明，植物體內三烯生育酚的合成至少受兩方面的控制：一是由其合成關鍵酶的高表達決定，二是受到其合成前體物質含量的限制。

3.1 HGGT基因過表達提高三烯生育酚含量

目前，HGGT編碼基因已經在大麥、水稻等作物中得到克隆，而且近些年也得到了廣泛應用。Cahoon等[12]首先克隆了大麥的HGGT基因并研究了其功能。將大麥HGGT基因在玉米中過表達發(fā)現，轉基因玉米籽粒中維生素E含量提高了6倍，其中生育酚含量并無變化，主要增加的成分是三烯生育酚；而在本不存在三烯生育酚的擬南芥和煙草中分別過表達大麥HGGT基因和水稻HGGT基因，轉基因擬南芥和煙草葉片中維生素E含量分別提高了5倍和15倍，也是以大量提高三烯生育酚含量為主[12,45]。分別在大豆和亞麻薺中過表達大麥HGGT基因，轉基因種子中維生素E含量分別提高了10倍和6倍，并且提高的部分主要成分也是三烯生育酚[46]。Salimath等[6]將大麥HGGT基因導入棉花，使得轉基因棉花種子中三烯生育酚含量大幅提高，更主要的是利用該轉基因棉花種子提取的棉籽油中三烯生育酚升高，不但增加了棉籽油的營養(yǎng)成分，更有利于人體健康，而且延長了棉籽油的貨架期。Che等[21]在高粱中過表達大麥HGGT基因和類胡蘿卜素合成途徑關鍵酶基因DXS、PSY和CRTⅠ，轉基因高粱中不但三烯生育酚和β-胡蘿卜素得到大量積累，而且β-胡蘿卜素穩(wěn)定性得到了大幅提升。這些數據表明，采用此種策略，不僅三烯生育酚得到了強化，而且三烯生育酚起到了其應有的抗氧化作用使得β-胡蘿卜素免受氧化降解。

以上研究表明，HGGT基因是三烯生育酚合成的重要基因，而且HGGT基因的高表達是三烯生育酚含量提高的有效途徑，并且三烯生育酚還能很好地保護其他營養(yǎng)成分；同時也從側面反映出HGGT決定了三烯生育酚的生物合成。

3.2 合成途徑其他關鍵酶基因過表達提高三烯生育酚含量

上述都是過表達HGGT基因進行三烯生育酚生物強化比較成功的例子，但也有的實驗并沒有得到人們預想的結果，比如Kim等[47]在大豆中過表達水稻的HGGT基因，轉基因大豆中三烯生育酚含量僅提高了26.3%~35.9%，初步分析可能與基因的來源有關，也可能與使用的啟動子、受體材料等不同有關。因此，人們也嘗試利用合成途徑其他關鍵酶基因過表達來提高三烯生育酚含量。

HGA是生育酚和三烯生育酚共同的合成前體物質，因此研究人員采用提高HGA含量的策略來提高維生素E含量。在擬南芥和煙草中共表達羥基苯丙酮酸雙加氧酶HPPD和預苯酸脫氫酶TyrA，轉基因植株葉片中維生素E含量分別提高了2倍和10倍；而在擬南芥、大豆和油菜種子中過表達HPPD和TyrA基因，轉基因材料中維生素E含量分別提高了1.8倍、2.6倍和2.4倍[48?50]。以上轉基因植株中HGA得到了積累，提高的維生素E以三烯生育酚為主，表明前體物質HGA的含量是限制三烯生育酚合成的一個主要因素，過表達HPPD和TyrA基因是提高三烯生育酚含量的一種有效途徑。

三烯生育酚合成的另一前體物質GGPP，是多種代謝物（類胡蘿卜素、葉綠素、赤霉素以及萜類等）的共同前體物質，也是生育酚的另一前體物質PPP的來源之一，因此分析GGPP的含量對三烯生育酚的合成至關重要。強化策略是利用其合成途徑的關鍵酶基因過表達來提高GGPP的含量。GGPP來自于非甲羥戊酸途徑，目前研究較多的是過表達非甲羥戊酸途徑的第一個和第二個關鍵酶基因DXS和DXR，但是，實驗結果并未得到三烯生育酚含量提高的預期[51?53]。推測是由于GGPP處于多種代謝物合成的關鍵節(jié)點位置，可能體內存在復雜的調控網絡。Ruiz-Sola等[54]報道了對擬南芥GGPP合成酶GGPPS的研究，發(fā)現GGPPS11是一些類異戊二烯類物質合成必需的。后續(xù)三烯生育酚的生物強化研究可以考慮利用GGPPS基因。

3.3 提高高活性的三烯生育酚組分含量

盡管三烯生育酚的活性相對于生育酚較低，從強化的角度目前也未提及提高高活性的三烯生育酚組分含量的要求，但是從上述報道中看出，α-三烯生育酚比α-生育酚抗脂質過氧化的能力更強。因此，從抗氧化活性的角度，提高活性較高的α-和β-三烯生育酚組分也可以作為強化的一部分。Konda等[46]在大豆中過表達大麥HGGT基因和大豆γ?TMT基因，使得本不含有三烯生育酚的大豆種子中維生素E含量升高了8~10倍，主要是三烯生育酚含量增多，并且相對活性較高的α-和β-三烯生育酚含量得到了提高，同時提高了油品質量。玉米中過表達ZmTMT基因，不但使得轉基因玉米種子中α-生育酚含量大幅提高，同時α-三烯生育酚含量也得到了提高[55]。Munusamy等[56]對莧菜和韭菜中HPT進行轉錄后沉默PTGS研究時發(fā)現，維生素E組分的合成發(fā)生了轉移。由于HPT發(fā)生了沉默，從而使得α-生育酚的合成減少；而當α-生育酚的含量降低到非常低的水平時，植物自身從莽草酸途徑切換到非甲羥戊酸途徑，并開始產生α-三烯生育酚作為一種補償。

4 展望

三烯生育酚對動物和植物均表現出了很強的生物學功能，尤其是在人類醫(yī)藥方面展現出了巨大的應用前景，并且使用天然來源的三烯生育酚越來越受到人們的歡迎。因此，解析三烯生育酚合成的分子機制、提高三烯生育酚含量仍是未來研究的重點。

近年來，三烯生育酚的研究受到人們的廣泛關注，其生物強化主要是圍繞HGGT基因開展的，也確實起到了比較好的效果[12,45?46,57]。但是，目前對三烯生育酚的研究還遠遠不夠。因此，人們已經從遺傳學角度分析了維生素E的合成。Diepenbrock等[58]的研究發(fā)現，不僅維生素E核心合成途徑中的HGGT1、γ?TMT對維生素E合成起主要作用，而且其上游非核心合成途徑中的DXS2、DXS3、ArodeH2以及HPPD1等也與維生素E的合成密切相關。DXS2和DXS3是非甲羥戊酸途徑的關鍵酶基因，控制著三烯生育酚合成前體物 質GGPP的含量；ArodeH2和HPPD1是莽草酸途徑的關鍵酶基因，影響著維生素E的合成前體物質HGA的含量。盡管已有的對DXS的研究未達到人們的預期結果，但是今后對于三烯生育酚的生物強化研究，人們仍可以考慮利用核心合成途徑與非核心合成途徑關鍵酶基因共表達的方法來更好地提高三烯生育酚的含量。另外，利用維生素E的抗氧化特性可以提高其他營養(yǎng)成分的穩(wěn)定性，從而延長作物的儲藏期，提高油品品質[21,46,59]。近些年營養(yǎng)強化日漸提上日程，這些研究為將來進行多營養(yǎng)性狀育種工作提供了借鑒。

已有研究表明，維生素E的合成受光調控影響，經分析發(fā)現，基因的啟動子區(qū)含有光反應順式作用元件（GATA-box、晝夜LHC和AT1-box）、對不同植物激素反應的元件（赤霉素、細胞分裂素、生長素和脫落酸）以及光響應元件[60]。對非洲油棕櫚中HPT基因和HGGT基因的啟動子分析發(fā)現，這兩個啟動子中均存在多個激素響應元件以及光響應元件[61]，暗示了可能有轉錄因子與啟動子的這些元件結合從而調控維生素E的合成。因此，今后可以從維生素E合成關鍵酶基因啟動子入手，挖掘維生素E合成的調控因子，闡明調控維生素E合成的分子機制。

三烯生育酚具有生育酚不具有的一些生物學功能，但是目前只在動物體內發(fā)現了α-生育酚的結合蛋白，其能夠高度專一地結合α-生育酚，使三烯生育酚不能很好地被吸收利用。因此，有效解決三烯生育酚的吸收和利用問題，并開發(fā)針對三烯生育酚的功能型動植物產品才能使三烯生育酚更好地為人類服務。