張騰騰， 孫俊杰， 吳從飛， 梅 玲， 趙鵬友，桂倩倩， 張小倩， 胡云飛，2

（1.亳州學院中藥學院，安徽亳州236800；2.天津中醫(yī)藥大學中藥制藥工程學院，天津300193）

生姜皮，別稱姜皮、生姜衣，為姜科植物姜Zingiber officinale Rose.的根莖外皮[1].生姜在我國南部、中部各省區(qū)廣為栽培.10月份左右采挖生姜的根莖，清洗掉泥土，采用竹刀輕輕刮取外層的栓皮，干燥后即得[1].生姜皮性味涼辛，可用于水腫、嘔吐、白發(fā)的治療[2].生姜皮中化學成分豐富，文獻報道其含有揮發(fā)油[3]、姜辣素類[4]及糖類[5]等多種成分.現(xiàn)代臨床研究表明，姜酚類成分具有抗腫瘤、保護胃黏液膜等生物活性[6].

生姜皮作為生姜生產(chǎn)的“副產(chǎn)物”研究報道較少，含量測定方面的研究更是鮮見.為了探究不同產(chǎn)地生姜皮的品質差異，為生姜皮的品質鑒定、質量評估以及有效成分的開發(fā)利用等提供研究基礎，本實驗利用HPLC同時測定生姜皮中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚4個主要組分的含量，并對其指紋圖譜相似性進行匹配.

1 儀器與材料

1.1 儀器

SHIMADZU品牌HPLC（PDA檢測器，LC-16），Waters XBridge C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；XS-105型分析天平（梅特勒），KQ-100DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），HH-6型六孔恒溫水浴鍋（金壇區(qū)西城新瑞儀器廠）

1.2 材料

6-姜烯酚（批號：AF20050113；純度：98%）、6-姜酚（批號：AF20110206；純度：98%）、8-姜酚（批號：AF 20070715；純度：98%）、10-姜酚（批號：AF20070716；純度：98%），均采購自成都埃法生物科技有限公司；水為實驗室自制超純水；HPLC級甲醇（國藥試劑）.樣品由周建理教授（安徽中醫(yī)藥大學）鑒定，確定為生姜皮，樣品信息見表1.

表1 10批生姜皮樣品信息

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

生姜皮挑選雜質后打粉，過二號篩，取干燥粉末約0.5 g，精密稱定，置于磨口100 ml錐形瓶中，精密加入75%甲醇（溶劑）30 ml，稱重，加熱回流45 min，保持微沸，放冷至室溫，再次稱重，用溶劑補至初始重量.用0.45 μm的有機系濾頭過濾至進樣瓶中，即可.

2.2 對照品溶液的制備

由于對照品為液體狀態(tài)且易揮發(fā)，故用甲醇全部轉移，制備成對照品儲備液，濃度各為0.392mg·mL-1.

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm×250mm）；流動相：甲醇-水，洗脫程序見表2；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：40℃；供試品、對照品溶液的進樣量分別是20 μL、10 μL.色譜圖如圖1.

表2 梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系

分別精密吸取6-姜酚對照品儲備液0.51 ml、1.79 ml、3.06 ml、4.34 ml、5.61 ml、6.89 ml轉移至10 ml容量瓶中，用甲醇定容，得到一系列濃度不同的6-姜酚對照品溶液，另外三種對照品標曲配制方式與之類似.6-姜烯酚標曲配制：精密移取6-姜烯酚對照品儲備液0.334 ml、0.668 ml、1.002 ml、1.336 ml、1.670 ml、2.004 ml，其他操作同6-姜酚；8-姜酚標曲配制：精密吸取8-姜酚對照品儲備液0.143 ml、0.285 ml、0.592 ml、0.898 ml、1.205 ml、1.512 ml，其余同6-姜酚標曲操作；10-姜酚標曲配制：精密移取10-姜酚對照品儲備液0.178 ml、0.429 ml、0.679 ml、0.929 ml、1.180 ml、1.430 ml置于5 ml容量瓶中，其他操作同6-姜酚標曲配制流程.按照文中所述色譜條件進樣，線性回歸分析結果見表3.

表3 4個成分線性關系

2.4.2 精密度試驗

分別移取一定體積四種對照品儲備液，制備成混合對照品溶液.按本文所述色譜條件進樣，重復進樣6次，計算得6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚四種成分峰面積的RSD依次為0.35%、0.94%、2.04%、2.00%，結果表明儀器精密度較好.

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取生姜皮樣品溶液（S6），按本文所述色譜條件進樣，于0，4，8，12，18，24 h進樣，計算得6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積的RSD依次為0.55%，1.58%，2.30%，1.98%，表明生姜皮供試品溶液在考察時間內(nèi)較為穩(wěn)定.

2.4.4 重復性試驗

取同一批樣品（S9）干燥粉末6份，按本文所述供試品制備方法及色譜條件進樣，計算得生姜皮中4種待測成分6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚的含量均值（n=6）的RSD依次為0.63%，1.42%，1.85%，1.17%，結果表明生姜皮樣品重復性較好.

2.4.5 回收率試驗

分別精密移取四種對照品溶液6-姜酚3 ml、8-姜酚0.5 ml、10-姜酚1.5 ml、6-姜烯酚1 ml加入至S1中（平行制備6份），按本文所述供試品制備方法及色譜條件進樣，經(jīng)計算得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚加樣回收率分別為96.62%、95.98%、91.80%、102.27%，RSD為2.30%、1.47%、2.12%、1.15%（n=6）.

2.5 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地生姜皮樣品，按本文所述供試品制備方法（每個樣品平行處理3份）及色譜條件進樣，所測4種組分的含量平均值計算結果見表4，平行樣之間含量誤差均小于2.0%.

表4 10批生姜皮樣品中4個化合物含量測定結果

2.6 不同產(chǎn)地生姜皮中4種成分指紋圖譜的建立

使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）軟件建立指紋圖譜（圖2）并計算相似度（表5），由生成峰進行實驗數(shù)據(jù)分析，并驗證實驗的準確性.

圖2 不同產(chǎn)地生姜皮指紋圖譜

表5 不同產(chǎn)地生姜皮指紋圖譜相似度

3 討論

3.1 色譜條件的建立

針對生姜皮樣品提取考察了如下因素：提取方式、提取溶劑、提取時間、溶劑體積.通過比較得出：采用30 ml 75%甲醇加熱回流45 min，提取效果好；色譜條件綜合考察了柱溫、流速、流動相比例等，結果顯示在40℃、1.0 ml·min-1、梯度洗脫（甲醇-水）等條件下，相鄰色譜峰分離度較好、峰形較對稱.

3.2 結果分析

生姜皮樣品中4種成分含量測定結果如表4，色譜結果如圖1所示.通過對比10批樣品中4種成分含量信息，可知：6-姜辣素含量最高是云南產(chǎn)S10批0.979%，含量最低的是廣西產(chǎn)S1批0.240%，最高含量約是最低的4倍；四種成分總含量規(guī)律與之類似.總體來看，廣西和山東產(chǎn)生姜皮中6-姜辣素含量及四種成分總含量較低，云南及四川產(chǎn)6-姜辣素含量及總含量均較高，這表明生姜皮的次生代謝產(chǎn)物受產(chǎn)地的氣候條件、土壤營養(yǎng)、地理位置等環(huán)境因素的影響.云南、四川地區(qū)所產(chǎn)生姜皮臨床應用價值高.

不同產(chǎn)地生姜皮4種成分的指紋圖譜匹配建立及相似度匹配：以四川地區(qū)為參照，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），參數(shù)設置多點校正、mark峰匹配（如圖2所示），通過軟件計算相似度（如表5所示），結果各產(chǎn)地生姜皮4種成分指紋圖譜相似度高于0.96，說明不同產(chǎn)地間生姜皮化學組分類似.

本研究在同一色譜條件下完成了5個產(chǎn)地生姜皮中4種成分的含量測定及指紋圖譜的建立.生姜皮指紋圖譜與含量測定通過定性與定量結合，實現(xiàn)整體評價與局部分析更加科學、合理地評價生姜皮質量.通過生姜皮的研究，對比生姜前期相關研究報道，為進一步闡明生姜是否去皮提供依據(jù).

2020 年版《中國藥典》[7]未對生姜皮檢查項作出明確規(guī)定，僅在“生姜”項下記載“取凈生姜，削取外皮”.目前僅有少量學者[8]對生姜皮質量標準進行了研究.本實驗建立的方法精密度較好，靈敏度高，為后續(xù)生姜皮質量標準的制定奠定基礎.