索彩仙，程學仁，潘禮業(yè)，邱韻靜，吳文平，李國衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的花蕾或初開的花[1]；山銀花為灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、華南忍冬L.confusaDC.或黃褐毛忍冬L.fulvoto-mentosaHsu et S.C.Cheng 的花蕾或帶初開的花[1]；川銀花為淡紅忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或帶初開的花，習稱“肚子銀花”或“沐川銀花”，是四川主流川銀花品種之一[2]。三者均具有清熱解毒、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[3-5]?！叭潭币幻驾d于《名醫(yī)別錄》，后《新修本草》《證類本草》均有收錄[6]，全世界忍冬屬藥材有200 余種，我國有98 種，其中以西南各省種類居多[7]，藥材名稱較為混亂，經(jīng)常出現(xiàn)同名異物的現(xiàn)象[8]。忍冬藥材除《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版中規(guī)定的5種忍冬外，還有很多地方習用品。川銀花一直作為四川地方習用品使用，其藥用資源豐富。目前市面上以金銀花和山銀花（灰氈毛忍冬）作為主流產(chǎn)品流通，且易混淆，對金銀花與山銀花的鑒別研究較多，但以川銀花為主要研究對象并同時對忍冬屬其他基原進行鑒別比較的研究較少[9]。為提高地方習用品的資源開發(fā)利用，豐富忍冬屬藥材不同基原的鑒別研究內(nèi)容，本研究利用性狀和顯微鑒別研究川銀花（淡紅忍冬）、金銀花（忍冬）和山銀花（灰氈毛忍冬）三者的藥材特征差異，通過建立3 種藥材的超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，比較3 種忍冬屬藥材的差異，為忍冬屬藥材資源的可持續(xù)利用和進一步研究提供參考，也為地方習用品川銀花的資源開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀；Waters BEH Phenyl型色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；XP-26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（瑞士Mettler公司）；Milli-Q 超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ICC50W 型光學顯微鏡（LETCA 公司）；甲醇、乙腈為色譜純（Merk 公司）；水為Milli-Q純化水；其余試劑為分析純。

對照品綠原酸（批號：110753-201817，純度：96.8%）、馬錢苷（批號：111640-201808，純度：99%）、木犀草苷（批號：111720-201609，純度：94.9%）由中國食品藥品檢定研究院提供；對照品異綠原酸A（批號：wkq18041207）、異綠原酸B（批號：wkq17060705）、異綠原酸C（批號：wkq18050905）、隱綠原酸（批號：wkq16081903）、新綠原酸（批號：wkq16050805）、獐牙菜苷（批號：wqk17092203）由四川省維克奇生物科技有限公司提供，純度均為98%；實驗所用藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，川銀花為D1～D12 號樣品，是忍冬科植物淡紅忍冬Lonicera acuminataWall.的干燥花蕾或帶初開的花[2]；金銀花為J1～J12 號樣品，是忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]；山銀花為H1～H12 號樣品，是忍冬科植物灰氈毛忍冬[1]L.macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾或帶初開的花，見表1。

表1 川銀花、金銀花、山銀花藥材信息來源

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別研究

對36 批藥材的花蕾顏色和形態(tài)進行鑒別研究，結(jié)果均符合《四川省中藥材標準》2010 年版及《中國藥典》2020年版標準（表2）。

表2 川銀花、金銀花、山銀花藥材性狀鑒別

2.2 光學顯微鑒別研究

采用ICC50W 型光學顯微鏡對已處理的藥材進行顯微鑒別。鑒別要點：川銀花（淡紅忍冬）中未見腺毛；金銀花（忍冬）中可見極多頭部倒圓錐形、類圓形腺毛以及外壁表面皰狀突起厚壁非腺毛；山銀花（灰氈毛忍冬）中可見較多花粉粒，呈類三角形，外壁表面具細密短剌，具3 個孔溝（表3、圖1～3）。

表3 川銀花、金銀花、山銀花藥材光學顯微鑒別

圖1 川銀花（淡紅忍冬）藥材顯微鑒別

圖2 金銀花（忍冬）藥材顯微鑒別

圖3 山銀花（灰氈毛忍冬）藥材顯微鑒別

2.3 指紋圖譜及化學計量學分析

2.3.1 色譜條件 采用Waters BEH Phenyl色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～1 min，4%～5%A；1～9 min，5%～6%A；9～13 min，6%～10%A；13～15 min，10%～14%A；15～30 min，14%～25%A），流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm；進樣量為1 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取對照品綠原酸、木犀草苷、馬錢苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸、獐牙菜苷適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為45.631、87.833、84.233、250.390、176.302、223.832、156.898、191.296、191.982 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（D2），按2.3.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以綠原酸為參照峰，計算11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（D2），按2.3.1項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，以綠原酸為參照峰，計算11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD＜2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.3 重復性試驗 取樣品粉末約0.5 g，平行6 份，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件測定，以綠原酸為參照峰，計算11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD＜2%，表明該方法重復性良好。

2.3.4.4 樣品測定 取36批樣品，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，分別記錄UPLC指紋圖譜。

2.3.5 指紋圖譜分析及評價

2.3.5.1 共有峰及化學成分歸屬 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012A版對36 批藥材UPLC 指紋圖譜進行結(jié)果分析，12 批川銀花樣品共確定11個共有峰（圖4），12批金銀花樣品共確定14個共有峰（圖5），12批山銀花樣品共確定8 個共有峰（圖6）。川銀花、金銀花和山銀花三者共有峰為8個，2號峰（綠原酸）分離度好，峰形對稱，為藥材中清熱、抗菌、抗病毒的主要成分之一，故以2 號峰（綠原酸）為參照峰（S 峰）。通過各對照品保留時間和紫外吸收光譜對共有峰的化學成分進行歸屬，峰1 為新綠原酸，峰2（S）為綠原酸，峰4 為隱綠原酸，峰7 為馬錢苷，峰8 為獐牙菜苷，峰10為木犀草苷，峰11為異綠原酸B，峰12為異綠原酸A，峰14為異綠原酸C（圖7）。

圖4 12批川銀花UPLC指紋圖譜

圖5 12批金銀花UPLC指紋圖譜

圖6 12批山銀花UPLC指紋圖譜

圖7 忍冬屬3種藥材共有峰對照品歸屬

2.3.5.2 川銀花與金銀花、山銀花共有峰比較 以3種藥材在UPLC 指紋圖譜中共有峰的數(shù)目差異作為忍冬屬藥材品種鑒定的依據(jù)。如表4 所示，以峰1～5、7、9、11～14 作為川銀花指紋圖譜的特征峰，與金銀花比較，川銀花中未含有峰6、8、10，以這3個峰作為川銀花與金銀花的鑒別成分；對比山銀花的8 個共有峰，川銀花增加峰5、7、13，以這3 個峰作為川銀花與山銀花的鑒別成分；金銀花與山銀花差異更為明顯，峰5～8、10、13 均是山銀花藥材中未含有成分。

表4 忍冬屬3種藥材UPLC指紋圖譜共有峰信息比較

2.3.5.3 相似度評價 采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版分別對D1～D12、J1～J12、H1～H12 共36 批藥材UPLC 指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，以峰2（綠原酸）為參照峰，采用平均數(shù)，時間窗口為1，自動匹配，計算相似度系數(shù)，12 批川銀花藥材相似度均在1.00，樣品相似度最高，12 批金銀花藥材的相似度在0.99 以上，12批山銀花藥材的相似度在0.98～0.99，見表5。

表5 忍冬屬3種藥材樣品相似度評價結(jié)果

2.3.5.4 相似度比較 指紋圖譜結(jié)果顯示，川銀花與金銀花和山銀花共有峰個數(shù)分別為11、14、8 個，三者共有峰有8個。分別將3種藥材對照圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012A版，進行兩兩相似度比較，其中川銀花和金銀花相似度為0.88（圖8），川銀花和山銀花相似度為0.97（圖9），金銀花和山銀花相似度為0.87（圖10）。實驗數(shù)據(jù)表明，川銀花和金銀花、山銀花的指紋圖譜共有峰信息和相似度均有差異，說明同屬藥材化學成分亦存在差異。

圖8 川銀花和金銀花UPLC指紋圖譜

圖9 川銀花和山銀花UPLC指紋圖譜

圖10 金銀花和山銀花UPLC指紋圖譜

2.3.6 聚類分類 將36 批藥材樣品共有峰各色譜峰峰面積除以稱樣量后，運用SPSS 20.0 軟件對其進行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以平方Euclidean 距離作為樣品相似度的距離公式，得到樣品聚為3 類（圖11）。D1～D12 為川銀花聚為一類，J1～J12為金銀花聚為一類，H1～H12為山銀花，其中H7 號樣品未能與其他樣品聚在一類。聚類結(jié)果說明不同品種間的藥材存在一定差異。

圖11 忍冬屬藥材樣品聚類分析

2.3.7 主成分分析（PCA）以36批藥材UPLC 指紋圖譜8個共有峰峰面積進行PCA，結(jié)果顯示，前2個主成分的累積方差貢獻率達88.101%，確定主成分數(shù)為2（表6）。根據(jù)因子載荷矩陣得知，峰2、4、11、12、14在第1主成分上有較高載荷，5個峰均為酚酸類成分，依次是綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，說明酚酸類成分對主成分1 產(chǎn)生主要影響；峰9 則對主成分2 產(chǎn)生主要影響（表7）。由得分值數(shù)據(jù)可知，川銀花主成分1 均為正值，主成分2 為負值，與山銀花的差異主要體現(xiàn)在主成分2，山銀花的主成分2幾乎為正值，兩者主成分評分值存在差異，可實現(xiàn)樣品分離；金銀花2 個主成分評分均為負值，與川銀花差異更為明顯（表8）。以主成分為變量得到36 批藥材得分圖，由得分圖可見，PCA 將36 批藥材分為3 類，即第Ⅰ類川銀花，第Ⅱ類金銀花，第Ⅲ類山銀花。結(jié)果顯示，3 種藥材得到明顯區(qū)分，且同基原樣品較好地聚集在一起，除第Ⅲ類中，H7 號樣品單獨聚在一類，與聚類分析結(jié)果一致（圖12）。

圖12 忍冬屬3種藥材成分主成分得分

表6 忍冬屬3種藥材PCA特征值及各主成分的貢獻率

表7 忍冬屬3種藥材主成分分析因子載荷矩陣

表8 36批忍冬屬藥材樣品綜合得分結(jié)果

3 分析與討論

3.1 性狀及顯微結(jié)果分析

川銀花（淡紅忍冬）花蕾呈短棒狀，疏被毛；金銀花（忍冬）花蕾呈棒槌形，上粗下細，密被短絨毛；山銀花（灰氈毛忍冬）花蕾呈棒狀稍彎曲，無毛?；ɡ兕伾铣ㄣy花（淡紅忍冬）為棕褐色外，其余2 種多為淡黃綠色和黃綠色。光學顯微結(jié)果顯示，未在川銀花（淡紅忍冬）中發(fā)現(xiàn)腺毛，常見厚壁非腺毛，薄壁非腺毛以及草酸鈣簇晶較為少見；金銀花（忍冬）中有2 種腺毛，分別是頭部倒圓錐形及頭部類圓形，這與《中藥顯微鑒定圖典》中金銀花項下的顯微鑒別一致[10]；山銀花（灰氈毛忍冬）中腺毛較少，其頭部多數(shù)為圓盤形，常見厚壁非腺毛和花粉粒。以三者的共有種類非腺毛、草酸鈣簇晶和花粉粒為鑒別點進行比較，金銀花（忍冬）的厚壁非腺毛最長，其次是川銀花（淡紅忍冬），最后為山銀花（灰氈毛忍冬），其中山銀花（灰氈毛忍冬）基部似三角狀，而金銀花（忍冬）較為平坦，草酸鈣簇晶和花粉粒未見有明顯差異，實驗通過性狀和顯微鑒別研究對其進行初步的判別。

3.2 指紋圖譜結(jié)果分析

通過對照品保留時間和紫外吸收光譜共指認了9個色譜峰，其中6個為酚酸類成分，說明藥材中主要為酚酸類化學成分，具有清熱、抗菌、抗病毒、抗炎等功效[11-13]。本實驗研究建立同一個UPLC 指紋圖譜方法，對川銀花和金銀花、山銀花進行快速鑒別區(qū)分，通過3 者共有峰數(shù)目差異進行分析，峰6、8、10 可作為川銀花和金銀花的鑒別區(qū)分，峰5、7、13 作為山銀花和川銀花的鑒別區(qū)分，峰1～5、7、9、11～14作為川銀花UPLC指紋圖譜的特征峰。相似度比較結(jié)果顯示，與種內(nèi)藥材比較，不同種間藥材相似度較低，其中以川銀花和山銀花相似度最高為0.97，最低為0.87。結(jié)合指紋圖譜和相似度結(jié)果分析，說明不同種間藥材在化學成分上存在差異。

3.3 聚類及主成分結(jié)果分析

聚類分析結(jié)果顯示，36 批藥材樣品分為3 類，表明同基原藥材具有高度相似度，不同種的藥材具有明顯差異。文獻報道，綠原酸在酸性pH條件下十分穩(wěn)定，但在中性和堿性pH及在加熱情況下，容易生成新綠原酸和隱綠原酸[14]。聚類分析和主成分得分圖結(jié)果顯示，H7號樣品被單獨分在一類，12批樣品中，H7號樣品綠原酸峰面積為新綠原酸33倍，為隱綠原酸22 倍，與剩余11 批樣品比較，H7 號樣品綠原酸和新綠原酸峰面積比值差異最大，綠原酸和隱綠原酸峰面積比值則相差不大，分析H7號樣品分類和排名與新綠原酸有關(guān)，推測為綠原酸受熱分解不夠，影響新綠原酸的轉(zhuǎn)化，導致H7號樣品單獨分在一類。采取系統(tǒng)聚類分析首先可以判定品種的分類，為不同種間樣品差異提供化學計量分析。應(yīng)用PCA，篩選出共有的特征性成分，本次得到兩大主成分，主成分1 主要為峰2、4、11、12、14 對整體的方差貢獻率較高，說明這5 個成分為川銀花、金銀花、山銀花的主要成分群組，而峰9 則為另一成分組。通過2個主成分得分值的比較得知，主成分1中，川銀花得分值均為正值，得分最高，主成分2中山銀花為最大值，而金銀花在2 個主成分中均為最低值。此外，3 者的峰面積差異顯著，川銀花中隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積為最大值，與主成分1 得分值為正值結(jié)果一致，說明3 種藥材中，川銀花的酚酸類成分占比最大；川銀花和山銀花的差異主要體現(xiàn)在主成分2，川銀花為得分負值，山銀花則為正值，且載荷較高的峰9峰面積僅為山銀花的一半，得分值與峰面積相匹配；金銀花不僅2個主成分得分值幾乎為負值，而且峰面積也是最低值，得分值和峰面積與川銀花差異明顯。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，不同種間藥材成分存在差異。

本研究對川銀花、金銀花和山銀花藥材進行性狀和顯微鑒別研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種藥材的鑒別特征存在差異，建立的UPLC 指紋圖譜方法可以將川銀花與金銀花和山銀花藥材進行鑒別，利用系統(tǒng)聚類分析和PCA 對36 批藥材進行分析，結(jié)果顯示，3種忍冬藥材存在成分差異，實驗結(jié)果為忍冬屬藥材的進一步研究提供了一定的依據(jù)。