張娟，孫宇，徐曉琴，卿德剛

新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002

結(jié)腸是人體腸道的一部分，維持著消化系統(tǒng)的平衡。結(jié)腸上皮屏障功能障礙會引起消化不良、便秘、排便混亂等一系列癥狀[1]，因此，緩解結(jié)腸屏障功能損傷有利于消化道疾病的治療。研究證明，黃酮類成分可以通過抑制炎癥或者直接調(diào)節(jié)屏障功能，發(fā)揮改善腸道屏障功能的作用[2-4]。流行病學(xué)研究也表明，攝入黃酮類成分可以預(yù)防腸道炎癥，從而降低炎癥性腸病、結(jié)腸癌、2 型糖尿病、非酒精性肝炎等多種疾病的風(fēng)險[3,5]。甘草黃酮臨床上用于治療胃及十二指腸球部潰瘍，同時對炎癥性腸病和結(jié)腸癌也有預(yù)防作用[6-8]，但是，現(xiàn)有研究并未完全闡明甘草黃酮中的活性成分，臨床用藥中無法實現(xiàn)對其質(zhì)量的有效控制。本實驗制備大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6 炎癥模型，從甘草黃酮中篩選出抗炎活性亞組分，進(jìn)一步考察活性亞組分及其主要成分對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2 腸上皮屏障損傷模型的細(xì)胞因子分泌和屏障功能改變的影響，探討兩者對腸道屏障的保護(hù)作用和可能通路，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

IEC-6細(xì)胞來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫；Caco-2 細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。

1.2 試藥

甘草黃酮購自新農(nóng)甘草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司（批號：2015H001，純度＞45%）；胎牛血清（FBS，ExcellBio公司）；DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗（PS，10 000 U）和胰蛋白酶（0.25%Trypsin-EDTA）均購自Gibco 公司；重組人胰島素（Solarbio 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；Transwell小室（Corning公司）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-8酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；TNF-α（PeproTech 公司）；閉合小環(huán)蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、肌動蛋白（β-actin）抗體（Abcam 公司）；二甲基亞砜（DMSO）和柳氮磺胺吡啶（SASP）均購自Sigma 公司；異硫氰酸熒光素-右旋糖酐-40（FD-40）和甘草黃酮C（licoflavone C，LicoC）均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器

SmartCellHF-90 型二氧化碳培養(yǎng)箱、HF1200LC型生物安全柜（上海力康儀器有限公司）；DK-80型臺式低速離心機(jī)（上海飛鴿儀器有限公司）；EclipseTS100-F 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；xMark 型酶標(biāo)儀、Mini-PROTEAN Tetra system型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；FLUO star OPTIMA型熒光酶標(biāo)儀（德國BMG 公司）；Millicell-ERS 型電阻測定儀（美國Millipore 公司）；DYCZ-24DN 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 甘草黃酮亞組分制備

取甘草黃酮140 g以水混懸，乙酸乙酯等體積萃取3 次，揮干溶劑得到浸膏112 g。浸膏以硅膠柱色譜進(jìn)一步分離，石油醚-丙酮梯度洗脫（100∶0、100∶5、10∶1、9∶1、8∶1、6∶1、4∶1）制備亞組分，最終收集了74 個亞組分，以薄層色譜法檢識，選擇組成有差異且相對單一的20 個亞組分（GCH1～GCH20）繼續(xù)后續(xù)實驗，見圖1、表1。

表1 甘草黃酮亞組分信息

圖1 甘草黃酮亞組分制備流程

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與單層細(xì)胞模型制備

IEC-6 細(xì)胞以培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%PS+100 μg·mL-1insulin），37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。待融合率達(dá)90%時，胰酶消化，制備成5×104個/mL 的單細(xì)胞懸液。Caco-2 細(xì)胞以培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+1% PS），37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。待融合率達(dá)80%時，胰酶消化。取指數(shù)期Caco-2細(xì)胞以5×104個/mL 接種于Transwell小室常規(guī)培養(yǎng)，2 d 更換1 次培養(yǎng)基，以電阻儀測定單層細(xì)胞跨上皮電阻（TEER）監(jiān)測單層細(xì)胞形成情況，待TEER 穩(wěn)定后，體外腸上皮單層細(xì)胞模型制備成功。

2.3 甘草黃酮亞組分對IEC-6細(xì)胞存活率的影響

取IEC-6單細(xì)胞懸液接種至96孔板（100 μL/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞貼壁。分設(shè)空白組、對照組、甘草黃酮各亞組分組（100 μL，20μg·mL-1溶液），根據(jù)分組以各亞組分干預(yù)，培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入10%CCK-8 溶液100 μL，繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度（A），根據(jù)公式（1）計算細(xì)胞存活率。

2.4 甘草黃酮亞組分對TNF-α 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞IL-6 分泌的影響

IEC-6 細(xì)胞參照2.3 項下方法接種。設(shè)對照組、TNF-α模型組（100 ng·mL-1）、陽性對照組（SASP，2 mmol·L-1）和甘草黃酮各亞組分組（20 μg·mL-1），根據(jù)分組加入陽性藥和亞組分提前干預(yù)2 h，之后加入TNF-α培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測各組IL-6水平。

2.5 GCH15化學(xué)成分分析

采用高效液相色譜分析篩選獲得的抗炎活性組分GCH15的化學(xué)成分并測定其含量[9-10]。

2.6 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞IL-6和IL-8分泌的影響

取Caco-2單細(xì)胞懸液接種至96孔板（100 μL/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞貼壁。分設(shè)對照組、TNF-α模型組（100 ng·mL-1）、陽性藥對照組（SASP，2 mmol·L-1）組、GCH15低、中、高劑量（GCH15-L、GCH15-M、GCH15-H，5、10、20 μg·mL-1）組和LicoC低、中、高劑量（LicoC-L、LicoC-M、LicoC-H，5、10、20 μmol·mL-1）組。根據(jù)分組加入陽性藥和亞組分提前干預(yù)2 h，之后加入TNF-α培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書方法檢測各組IL-6和IL-8水平。

2.7 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 單層細(xì)胞通透性的影響

參照2.2 項下方法，將Caco-2 細(xì)胞接種于Transwell小室，待TEER值穩(wěn)定后，按2.6項下方法分組處理細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)48 h，分別檢測處理前后TEER值。在Transwell小室頂端腔內(nèi)加入HBSS溶液100 μL（含F(xiàn)D-40 1 mg·mL-1），37 ℃培養(yǎng)2 h，收集腔內(nèi)溶液，熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長530 nm），實驗組與對照組的FD-40 熒光值之比計為FD-40相對通過水平。

2.8 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞Occludin、ZO-1及MLCK蛋白表達(dá)的影響

設(shè)對照組、TNF-α模型組（100 ng·mL-1）、GCH15 組（20 μg·mL-1提前干預(yù)2 h）和LicoC 組（20 μmol·mL-1提前干預(yù)2 h），培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，3% 脫脂奶粉封閉1 h，加入ZO-1、Occludin、MLCK 和β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，再加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL顯影，考察目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 甘草黃酮亞組分對IEC-6細(xì)胞存活率的影響

甘草黃酮有一定毒性，因此，基于預(yù)試驗篩選結(jié)果，比較了20 個亞組分在質(zhì)量濃度為20μg·mL-1時對正常IEC-6 細(xì)胞存活的影響。結(jié)果表明，除了GCH1、GCH5、GCH9、GCH13、GCH15 和GCH16，多數(shù)亞組分在該質(zhì)量濃度下都會抑制IEC-6 細(xì)胞存活，見圖2。

圖2 甘草黃酮各亞組分對細(xì)胞存活率的影響（,n=3）

3.2 甘草黃酮亞組分對TNF-α 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞IL-6 分泌的影響

結(jié)果表明，以TNF-α刺激IEC-6 細(xì)胞，能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-6（P＜0.05）。結(jié)果顯示，各亞組分在質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1時均可抑制IL-6 分泌，并以GCH2、GCH4、GCH8、GCH15和GCH19的抑制效果最為顯著（P＜0.05），見圖3。綜合各亞組分對正常IEC-6 細(xì)胞存活率的影響結(jié)果，選擇GCH15進(jìn)一步研究。

圖3 甘草黃酮各亞組分對TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞IL-6分泌的影響（,n=3）

3.3 GCH15化學(xué)成分分析

為了明確GCH15中的活性成分，采用HPLC分析GCH15，并通過對照品比對，確認(rèn)LicoC是GCH15的主要成分之一，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.3%，見圖4。

圖4 GCH15和LicoC的HPLC圖及LicoC結(jié)構(gòu)式

3.4 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞IL-6和IL-8分泌的影響

ELISA 結(jié)果顯示，以TNF-α刺激Caco-2 細(xì)胞，能夠明顯誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子IL-6 和IL-8 的分泌（P＜0.01）。以GCH15 5、10、20 μg·mL-1和LicoC 5、10、20 μmol·mL-1提前干預(yù)則能顯著降低Caco-2 細(xì)胞中IL-6 和IL-8 水平，并呈一定的劑量相關(guān)性，說明LicoC是GCH15中的抗炎活性成分，見圖5。

圖5 GCH15和LicoC對TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎性因子分泌的影響（,n=3）

3.5 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導(dǎo)的Caco-2 單層細(xì)胞通透性的影響

與對照組比較，TNF-α刺激Caco-2 單層細(xì)胞可引起TEER值降低（P＜0.01）和FD-40相對通過水平升高（P＜0.01），表明單層細(xì)胞通透性增加，屏障功能紊亂。與模型組比較，以GCH15 5、10、20 μg·mL-1和LicoC 5、10、20 μmol·mL-1提前干預(yù)能提高TEER值，降低FD-40相對通過水平，并呈一定的劑量相關(guān)性，說明兩者有利于保護(hù)腸道屏障完整性，對TNF-α誘導(dǎo)的屏障功能損傷具有保護(hù)作用，見圖6～7。

圖6 GCH15和LicoC對TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2單層細(xì)胞TEER的影響（,n=3）

圖7 GCH15和LicoC對TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞FD-40通過水平的影響（,n=3）

3.6 GCH15和LicoC對ZO-1和Occludin表達(dá)的影響

TEER值下降和FD-40相對通過水平升高，提示緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，故以免疫印跡法（Western blot）檢 測GCH15 和LicoC 對ZO-1 和Occludin 表 達(dá)的影響。結(jié)果表明，TNF-α的刺激可使Caco-2 細(xì)胞ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）。以GCH15 20 μg·mL-1和LicoC 20 μmol·mL-1提前干預(yù)則能逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01），說明兩者可以通過保護(hù)緊密連接結(jié)構(gòu)維持腸道屏障功能，見圖8。

圖8 GCH15和LicoC對TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的影響（,n=3）

3.7 GCH15和LicoC對MLCK表達(dá)的影響

TNF-α刺激Caco-2 單層細(xì)胞，可以明顯促進(jìn)MLCK 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。以GCH15 20 μg·mL-1和LicoC 20 μmol·mL-1提前干預(yù)，則能逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的MLCK 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），說明兩者可能通過調(diào)節(jié)MLCK，防止腸道屏障緊密連接功能紊亂，見圖9。

圖9 GCH15和LicoC對TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞MLCK蛋白表達(dá)的影響（,n=3）

4 結(jié)論

腸上皮細(xì)胞和封閉細(xì)胞旁間隙的連接復(fù)合體是腸道屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其中緊密連接對調(diào)節(jié)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運和維持屏障完整性至關(guān)重要[11]。緊密連接由50多個前蛋白組成，包括ZO-1、ZO-2 和ZO-3 等細(xì)胞質(zhì)外周膜蛋白，以及Occludins 和Claudins 等跨膜蛋白[12]。ZO-1 在緊密連接功能中起著直接和間接的中心作用，不僅能夠連接跨膜蛋白（Occludins 和Claudins）和其他緊密連接蛋白、肌動蛋白骨架，而且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通道[13]。炎性刺激和其他內(nèi)源性細(xì)胞因子通過減少緊密連接蛋白的定位與表達(dá)直接影響腸上皮屏障，腸上皮屏障通透性增加又會促使內(nèi)毒素和促炎因子更易移位于組織內(nèi)部，導(dǎo)致慢性炎癥持續(xù)存在。因此，維持細(xì)胞間結(jié)構(gòu)完整、改善腸上皮屏障功能，有助于改善消化道疾病引起的炎癥反應(yīng)。

TNF-α是引起腸道屏障損傷的重要啟動因子，不僅可以通過MLCK 通路重塑細(xì)胞骨架，引起緊密連接前的肌動球蛋白環(huán)收縮和緊張性增加，促使ZO-1 和Occludin 等緊密連接蛋白和周圍細(xì)胞骨架蛋白重新分布、緊密連接結(jié)構(gòu)移位、細(xì)胞旁通路開放、腸道通透性增加，而且還會誘導(dǎo)IL-6 和IL-8 等細(xì)胞因子分泌，推動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加劇緊密連接結(jié)構(gòu)的損傷[14-16]。本實驗首先利用TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6炎癥細(xì)胞模型，從甘草黃酮中篩選出抗炎活性亞組分GCH15，并通過HPLC 對照品指認(rèn)法確認(rèn)其主要成分是LicoC。進(jìn)而，以TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2腸道屏障損傷細(xì)胞模型，考察GCH15 和LicoC 對炎癥反應(yīng)的抑制作用和對屏障功能的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，以TNF-α刺激可以促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞分泌IL-6和IL-8，降低單層細(xì)胞TEER值，提高FD-40相對通過水平，GCH15 和LicoC 則能明顯逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞屏障功能紊亂，兩者均以劑量依賴的方式抑制IL-6 和IL-8 分泌，增加單層細(xì)胞TEER 值，降低細(xì)胞間通透性，即能夠通過抗炎和維持屏障完整性發(fā)揮對腸道屏障功能的保護(hù)作用。TNF-α可以促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞MLCK 表達(dá)，而MLCK過表達(dá)可以誘導(dǎo)肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，從而調(diào)節(jié)肌動蛋白收縮、細(xì)胞骨架重塑[17]，引起ZO-1和Occludin 等緊密連接蛋白表達(dá)與分布的變化，弱化緊密連接屏障功能，升高屏障通透性[18]。有研究證實，以MLCK 抑制劑抑制MLCK 信號通路的激活，可以改善結(jié)腸炎小鼠的腸黏膜屏障功能[19]。因此，進(jìn)一步以Western blot檢測了GCH15 和LicoC 對緊密連接蛋白和MLCK表達(dá)的影響。結(jié)果，以TNF-α刺激Caco-2 細(xì)胞，ZO-1 和Occludin 表達(dá)明顯下降，MLCK 表達(dá)明顯升高，提示MLCK 通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白參與了屏障功能的改變，以高劑量的GCH15和LicoC 提前干預(yù)Caco-2 細(xì)胞，則可以逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的ZO-1 和Occludin 表達(dá)下降、MLCK 表達(dá)升高，說明兩者可能是通過MLCK 調(diào)節(jié)緊密連接，從而維持腸道屏障完整性的。

甘草黃酮雖已應(yīng)用于臨床，但是受研究深度的限制，其中的活性成分并未被完全闡明，目前僅以總黃酮含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。本實驗通過體外實驗篩選出甘草黃酮中的活性成分LicoC，進(jìn)行單體層次上的活性評價，為闡明甘草黃酮活性成分、有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并且，一定程度上拓展了對甘草保護(hù)胃腸道的認(rèn)識。但是，本實驗只是體外考察，后續(xù)還需要進(jìn)行體內(nèi)驗證，并應(yīng)深入、細(xì)化篩選，以明確甘草黃酮中的活性物質(zhì)組，為闡釋甘草黃酮組效關(guān)系提供更充分的依據(jù)。