孫晨 汪碩敏 夏云紅

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)為死亡率最高的病理分型，是威脅人們身心健康的重要腫瘤類公共健康問題[1]。隨著醫(yī)療水平的提高，以程序性死亡受體/配體1 (programmed death 1/ligand 1, PD-1/L1)[2-4]等為靶點的綜合治療方式一定程度上提高了NSCLC患者的生存質(zhì)量和時間，但多數(shù)患者預后仍然較差[5]。X抗原家族成員1A(X antigen family member 1a, XAGE1A)是癌癥/睪丸(Cancer/testis, CT)抗原家族的成員[6-8]，其介導的免疫保護作用有利于免疫療法的實施[9-10]。伴隨免疫治療的快速發(fā)展，作用于PD-1/PD-L1的免疫檢查點抑制劑成為晚期NSCLC的有效治療方法[11-12]，但國內(nèi)外關于XAGE1A與PD-L1在NSCLC患者中的表達特征及相關性研究尚未有報道，因此探討XAGE1A與PD-L1的關系，尋找NSCLC診療的潛在分子標志物具有重要意義。

資料與方法

一、樣本來源

選擇安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院腫瘤科2017年01月至2020年01月的NSCLC患者75例，納入標準：①納入研究的患者經(jīng)病理切片診斷均證實為NSCLC；②患者為初診病例，術前均未接受放化療、靶向治療或免疫治療等其它治療；③患者一般資料完整，且入組前均已簽署知情同意書；④患者在手術治療后均可配合門診或電話隨訪。根據(jù)患者入院早晚隨訪時間為5～36月不等，中位隨訪時間為24個月。患者臨床資料如下：患者年齡57.31±6.45歲；女性35例(46.67%)，男性40例(53.33%)；脈管侵犯56例(74.67%)，無脈管侵犯19例(25.33%)；低分化21例(28%)，中高分化54例(72%)；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期52例(69.33%)，Ⅲ～Ⅳ期23例(30.67%)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例(20%)；腫瘤直徑以5 cm為界，大于5 cm共40例(53.33%)，小于5 cm 共35例(46.67%)；有遠處轉(zhuǎn)移者8例(10.37%)，無遠處轉(zhuǎn)移者67例(89.33%)；選取75例NSCLC患者病理標本中，取距腫瘤組織≥5 cm的非腫瘤組織作為癌旁組織，癌旁組織經(jīng)病理組織學檢查均未發(fā)現(xiàn)癌細胞。

二、主要試劑

DAB顯色試劑盒(36303ES01)和免疫組化試劑盒(36312ES75)均購自上海翊圣生物科技有限公司，兔抗人XAGE1A多克隆抗體(PRO-1256)購自艾美捷科技公司，PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和熒光定量PCR試劑盒(RR820A)均購自大連TAKARA公司，RNA裂解液(TRIzol)購自美國Invitrogen公司等。

三、RT-qPCR

取50～100 mg組織樣本加RNA裂解液1 mL，搖勻消化3～5 min后加入氯仿約200 μL在4℃ 12000 g離心15 min。上清液混入0.5 mL異丙醇， 4℃ 12000 g離心10 min，無酶水溶解后測RNA濃度。根據(jù)Takara試劑盒進行反應體系的配置，去除基因組DNA反應為42℃、2 min，反轉(zhuǎn)錄反應為37℃、15 min轉(zhuǎn)85℃、5 s。反轉(zhuǎn)錄樣本行qPCR反應體系配置，按預變性95℃、30 s，擴增40個循環(huán)，條件設置為95℃、5 s轉(zhuǎn) 60℃、30 s。XAGE1A forward primer, 5′-CCCAGGAGCCCAGTAATGGAGAG-3′; XAGE1A reverse primer, 5′-TCTGTCTGCTGCCC AGGTGTAG-3′; PD-L1 forward primer, 5′-GCTGCAC TAATTGTCTATTGGG-3′; PD-L1 reverse primer, 5′-CA CAGTAATTCGCTTGTAGTCG-3′; GAPDH forward primer, 5′-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′; GAPDH reverse primer, 5′-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3′。

四、免疫組織化學染色

取75例NSCLC患者手術切除樣本，經(jīng)包埋后制成石蠟塊，并用切片機切成4 μm厚的薄片。采用免疫組化(SP法)測定NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及淋巴結(jié)(距離腫瘤組織5 cm以上)標本中XAGE1A蛋白表達。簡要操作如下：切片二甲苯-梯度酒精脫蠟至水，洗凈和抗原修復后，加入雙氧水阻斷過氧化物酶，封閉15 min，再用Ultra V Block封閉背景，洗凈后加入XAGE1A抗體(1 ∶100 稀釋)孵育過夜，繼以一抗增強劑和二抗孵育，DAB顯色。顯微鏡下見黃褐色斑時加入ddH2O充分沖洗停止顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，烘干后鏡下觀察。

五、結(jié)果判斷

按照既往報道，XAGE1A為癌癥/睪丸抗原家族成員，故將胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色染色顆粒的細胞視為陽性。XAGE1A蛋白表達水平定性分析根據(jù)細胞染色強度和染色細胞所占面積的乘積計算。染色面積：陽性范圍≤10%計1分，10%～50%計2分，50%～80%計3分，80%以上計4分。染色強度：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。上述免疫組化評分，由2名病理科醫(yī)師采取雙盲方式進行，并綜合結(jié)果進行評判。

六、統(tǒng)計學分析

使用SPSS 25.0 軟件進行分析。RT-qPCR中腫瘤組織與癌旁組織的XAGE1A或PD-L1相對表達量輸入SPSS 25.0軟件數(shù)據(jù)庫，計量資料表示為均值±標準差，均為雙側(cè)檢測，數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，經(jīng)正態(tài)性檢驗數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用t檢驗分析；XAGE1A與臨床病理特點關系采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法并經(jīng)Log-Rank 檢驗，腫瘤組織與癌旁組織的XAGE1A與PD-L1免疫組化評分使用Kruskal-Wallis秩和檢驗；XAGE1A與PD-L1表達量關系使用pearson相關性分析。P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、XAGE1A mRNA在NSCLC腫瘤(tumor)組織和癌旁(para-tumor)組織中的表達

獲取75例NSCLC患者腫瘤與癌旁組織檢測XAGE1A表達水平并進行配對比較，RT-qPCR結(jié)果顯示，XAGE1A mRNA在NSCLC組織中平均表達水平高于癌旁組織(見圖1a)。

二、XAGE1A 與PD-L1 mRNA在NSCLC組織中的表達關系

對75例NSCLC患者的腫瘤組織進行XAGE1A 與PD-L1 mRNA檢測，RT-qPCR結(jié)果顯示，XAGE1A 與PD-L1mRNA表達水平存在正相關關系，相關系數(shù)R=0.2647(見圖1b)。

圖1 XAGE1A和PD-L1在NSCLC不同類別組織中的mRNA表達及相關性。a： 分別為XAGE1A和PD-L1在癌旁組織與腫瘤組織中的mRNA表達；b： 為75例患者腫瘤組織中XAGE1A和PD-L1表達相關性。注：**P<0.01

三、NSCLC腫瘤及其癌旁組織中XAGE1A和PDL1蛋白表達情況

免疫組化結(jié)果顯示，XAGE1A 蛋白在腫瘤組織、癌旁組織中均定位于細胞核，陰性表達不著色，陽性表達呈淡黃、棕黃至棕褐色(見圖2a、b)；此外，XAGE1A蛋白在PD-L1(-)組織中細胞核基本不著色，多為低表達，PD-L1(+～)組織中細胞核出現(xiàn)棕黃至棕褐色顆粒，表達為陽性(見圖2c、d)。NSCLC組織中XAGE1A 蛋白總陽性數(shù)為64例(85.3%)高于癌旁組織22例(29.3%)(P<0.001)；XAGE1A 蛋白在PD-L1陰性表達的NSCLC腫瘤組織中總陽性數(shù)為18例(66.7%)，低于PD-L1陽性表達的NSCLC腫瘤組織的46例(95.8%)(P<0.001)(見表1,2)。

表1 XAGE1A在NSCLC不同類型組織中的蛋白表達

表2 XAGE1A與PD-L1在配對腫瘤組織中的蛋白表達

圖2 XAGE1A在NSCLC不同類別組織中的蛋白表達 a為癌旁組織，XAGE1A無明顯表達，b為NSCLC腫瘤組織，XAGE1A在結(jié)腸癌細胞胞核中呈強陽性表達，c為PD-L1(-)的腫瘤組織，XAGE1A無明顯表達，d為PD-L1(+)的腫瘤組織，XAGE1A在部分腺體腫瘤細胞胞核中呈強陽性表達(放大倍數(shù)均為400×)。

四、XAGE1A 蛋白與NSCLC臨床病理特點的關系

XAGE1A蛋白表達與患者的TNM 分期、分化程度、吸煙史和遠處轉(zhuǎn)移有關，其中TNM Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有吸煙史、遠處轉(zhuǎn)移患者XAGE1A蛋白陽性率高于所對應項目的非上述分類陽性率(P<0.05)；而XAGE1A蛋白表達與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理類型無關(P>0.05)。PD-L1蛋白表達水平與NSCLC臨床病理特點的關系與XAGE1A蛋白表達情況相同，也與患者的TNM 分期、分化程度、吸煙史和遠處轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)(見表3)。

表3 XAGE1A蛋白與NSCLC臨床病理特點的關系

五、NSCLC組織中XAGE1A 蛋白表達與預后的關系

納入研究的75名NSCLC患者的3年總生存率為21.78%(95%CI: 2.12～4.25%)，XAGE1A 陽性表達患者的3年生存率為26.35%(95%CI: 2.11～4.09%)，XAGE1A陰性表達患者的3年生存率為8.27%(95%CI: 2.44～4.87%)，XAGE1A 陰性表達患者的生存時間低于XAGE1A 陽性表達患者(P=0.0264)。隨訪3年中，兩組患者的生存曲線(見圖3)，XAGE1A 陽性患者生存率明顯高于陰性患者，且XAGE1A 陽性表達患者生存期明顯長于陰性表達者，表明XAGE1A的表達水平可作為NSCLC患者的重要預后監(jiān)測指標(見圖3)。

圖3 XAGE1A陽性(High)和陰性(Low)表達患者的生存曲線

討 論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因。非小細胞肺癌是肺癌主要類型，其包括多種組織學亞型，包括腺癌、支氣管肺泡癌、鱗癌、間變性和大細胞癌[13]。盡管過去幾十年來在肺癌治療方面取得了技術上的進步，但診斷后的五年總生存率仍為20%。以PD-L1為靶點的免疫治療是近二十年來肺癌領域發(fā)展最快的治療方法之一，其有效延長了患者OS，但不適用于少數(shù)PD-L1低表達、耐藥患者，因此探索免疫治療合適的協(xié)同診療靶標是提高免疫治療療效的重要問題。XAGE1A作為癌癥/睪丸抗原(CTAs)基因家族成員，在多種腫瘤中存在表達，例如尤因氏肉瘤、黑素細胞瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺泡橫紋肌肉瘤和某些上皮腫瘤中[9, 11, 14-15]。XAGE1A位于X染色體上，其在某些癌癥患者中還觀察到了針對XAGE1A的血清反應性[16]，這表明XAGE1具有免疫原性。XAGE1高表達誘導的CD4和CD8 T細胞反應，促使患者產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫[17]，故有學者指出XAGE1有望作為靶向免疫治療的潛在標志物和作用靶點用于NSCLC和前列腺癌的治療當中。目前關于XAGE1相關研究國內(nèi)外多集中在轉(zhuǎn)錄本XAGE1B上，周清等[18]發(fā)現(xiàn)30例肺癌組織中，XAGE1B基因表達陽性率為40%(12/30)，而30例癌旁正常肺組織不表達該基因；腺癌中基因表達陽性率明顯高于其他病理類型(61.1%vs 8.3%,P=0.015)，可優(yōu)先選擇該基因作為肺腺癌免疫治療靶點。周清等[19]發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中VEGFR-2與XAGE1B基因表達呈正相關，XAGE1B表達陽性并且VEGFR-2高表達的患者可能是免疫療法與抗血管生成療法聯(lián)合治療的合適人群。但國內(nèi)關于XAGE1A在NSCLC患者樣本中表達水平及其與PD-L1表達關系尚未有文獻報道。

本文通過對院內(nèi)2017年到2020年75例NSCLC患者進行研究，發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤組織相較癌旁組織中XAGE1A與PD-L1 mRNA與蛋白表達率均升高，且二者表達存在正相關性。XAGE1A和XAGE1D蛋白分別由81和69個氨基酸組成，它們共有相同的氨基酸末端，最高至32個氨基酸。一些報道表明[20]，來自肺癌患者的血清與XAGE1A反應，提示XAGE1即含有核定位信號，也存在于細胞外空間。本研究經(jīng)免疫組織化學染色法，發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中XAGE1A 蛋白總陽性數(shù)為64例(85.3%)高于癌旁組織22例(29.3%)；XAGE1A 蛋白在PDL1陰性表達的NSCLC腫瘤組織中總陽性數(shù)為18例(66.7%)，低于PDL1陽性表達的NSCLC腫瘤組織的46例(95.8%)。通過病理特征分析，發(fā)現(xiàn)XAGE1A與PD-L1蛋白在TNM Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有吸煙史、遠處轉(zhuǎn)移的患者中陽性表達率更高，但與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理類型無顯著關系。已有研究證明，XAGE1可增強腫瘤細胞對腫瘤抗原的加工和呈遞過程，增加MHC-I分子的產(chǎn)生水平，從而直接激活腫瘤特異性T細胞應答[21]；通過構(gòu)建過表達XAGE1基因的小鼠腫瘤模型，Xie等[22]發(fā)現(xiàn)IFN-γ分泌增加、IL-6分泌減少，樹突狀細胞增加且特異性T細胞免疫活性增強，上述表現(xiàn)可能是NSCLC中XAGE1A高表達促進患者自身免疫激活的原因之一。進一步生存分析結(jié)果則提示XAGE1A 在NSCLC腫瘤組織陽性表達患者的生存時間高于XAGE1A 陰性表達患者。鑒于XAGE1A與PD-L1存在顯著相關性，本研究結(jié)果有利于指導XAGE1A作為PD-L1治療的判斷標準和協(xié)同治療的靶標之一，有望用于NSCLC治療。

綜上所述， XAGE1A與PD-L1在NSCLC腫瘤組織表達均升高，但與NSCLC病理類型無顯著關系，XAGE1A陽性率與PD-L1陽性率呈正相關。XAGE1A 呈高表達患者的生存時間越長，提示XAGE1A 對NSCLC可能存在保護作用，有望成為NSCLC的免疫治療潛在分子靶點。