馮玲 熊佳麗 易榮 劉毅

肺部感染是臨床常見(jiàn)的呼吸道疾病，發(fā)病率高，是我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)感染相關(guān)性疾病死亡的主要原因[1]。尤其隨著臨床上癌癥治療、器官移植中免疫抑制劑的使用以及艾滋病等疾病導(dǎo)致的免疫受損患者增多，肺部感染有增加趨勢(shì)，早期針對(duì)性的抗病原學(xué)治療，是患者獲得有效治療的前提。但常規(guī)檢測(cè)方法的陽(yáng)性率不高，加上臨床上經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，使得其陽(yáng)性率進(jìn)一步降低，顯然不能滿(mǎn)足臨床的需求，從而為肺部感染的診斷及治療帶來(lái)了難題[2-3]。宏基因組二代測(cè)序(Metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是新興的一種病原體檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)標(biāo)本中的所有微生物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)不同微生物的序列數(shù)，進(jìn)行結(jié)果判讀，有效識(shí)別致病病原體，具有覆蓋面廣、周期相對(duì)短等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)吸引了眾多研究者的目光[4]。本研究以住院期間完善了mNGS檢查的肺部感染患者為研究對(duì)象，回顧性分析患者的臨床資料，從不同患病人群、不同病原體等層面出發(fā)，旨在探究mNGS在肺部感染病原學(xué)診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

本研究收集2018年1月至2020年7月在株洲市中心醫(yī)院住院期間行mNGS檢查的59例肺部感染患者的臨床資料。其中男43例(72.88%)，女16例(27.12%)，年齡15～91歲，平均年齡61.90±18.44歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷為肺部感染，診斷標(biāo)準(zhǔn)：1.肺炎相關(guān)臨床表現(xiàn)：1)新近出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；2)發(fā)熱；3)肺實(shí)變體征和/或聞及濕性啰音；4)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10×109/L或<4 ×109/L，伴或不伴細(xì)胞核左移。2.胸部影像學(xué)檢查顯示新出現(xiàn)的斑片狀浸潤(rùn)影、葉或段實(shí)變影、磨玻璃影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。符合第1條中任何1項(xiàng)及第2條[5]。(2)住院期間完善BALF-mNGS，送檢標(biāo)本符合mNGS要求，同時(shí)還使用了常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn):臨床資料不完整。

二、研究方法

1 臨床資料收集：通過(guò)我院電子病歷系統(tǒng)收集入選患者的一般信息(姓名、性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、既往用藥史)、住院期間BALF-mNGS及其他病原學(xué)檢測(cè)方法的結(jié)果(如：培養(yǎng)、涂片、G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)、免疫學(xué)檢測(cè)等)，治療前后的臨床癥狀、影像學(xué)檢查及炎癥指標(biāo)(血常規(guī)、血沉、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原)。

2 mNGS檢測(cè)方法：臨床采集的標(biāo)本，均送至華大基因公司進(jìn)行檢測(cè)，基于宏基因二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)樣本中微生物核酸序列進(jìn)行分析，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有微生物的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。檢測(cè)過(guò)程包括：核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序、信息分析、報(bào)告解讀等。

3 致病原確定方法：(1)常規(guī)方法致病原確定方法：細(xì)菌、真菌、結(jié)核等菌體的致病原檢查診斷金標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)；病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)：核酸檢測(cè)陽(yáng)性。(2)mNGS致病原確定方法：mNGS的致病原確定方法：① 對(duì)于細(xì)菌(不包括分枝桿菌)、病毒和寄生蟲(chóng)：mNGS鑒定出物種水平的覆蓋率比其他任何微生物高出10倍；② 真菌：mNGS鑒定出的微生物其覆蓋率比其他任何真菌高5倍，對(duì)于曲霉菌，以屬?lài)?yán)格序列數(shù) (SMRNG)或種嚴(yán)格序列數(shù)(SMRN)≥2 為陽(yáng)性；③ 結(jié)核分枝桿菌當(dāng)至少1個(gè)序列被映射到物種或?qū)偎綍r(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性的[6-7]。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意(批號(hào)：(2019)倫審(科)第(08045)號(hào))。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般資料

符合入組標(biāo)準(zhǔn)的肺部感染患者共計(jì)59例，其中男43例，女16例，平均年齡61.90±18.44歲。無(wú)基礎(chǔ)疾病組的男性16例，女性9例，有基礎(chǔ)疾病的男性27例，女性7例，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.188)。無(wú)基礎(chǔ)疾病組的年齡58.40±21.79歲，有基礎(chǔ)疾病組的年齡64.47±15.36歲，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.240)(見(jiàn)表1)。

表1 入選患者基礎(chǔ)疾病情況

二、mNGS與常規(guī)方法陽(yáng)性率比較

在59個(gè)病例中，BALF-mNGS檢測(cè)陽(yáng)性59例(100%)，常規(guī)方法檢測(cè)陽(yáng)性43例(72.88%)，BALF-mNGS的陽(yáng)性率明顯較常規(guī)方法高(P<0.001)。并且無(wú)論是有基礎(chǔ)疾病，還是無(wú)基礎(chǔ)疾病，mNGS均較多種常規(guī)方法聯(lián)合(如痰涂片、痰培養(yǎng)、BALF培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)以及一些抗原、抗體檢測(cè))的檢出陽(yáng)性率高(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 BALF-mNGS和常規(guī)方法的檢出總陽(yáng)性率比較[n(%)]

進(jìn)一步我們對(duì)比了BALF-mNGS和BALF培養(yǎng)陽(yáng)性率差別，BALF-mNGS的陽(yáng)性率顯著高于BALF培養(yǎng)(P<0.001)，進(jìn)一步分析無(wú)基礎(chǔ)疾病與有基礎(chǔ)疾病組的差別，發(fā)現(xiàn)兩組BALF-mNGS的陽(yáng)性率均顯著高于BALF培養(yǎng)(P<0.001)(見(jiàn)表3)。

表3 BALF-mNGS和BALF培養(yǎng)陽(yáng)性率比較[n(%)]

三、mNGS及常規(guī)方法的臨床采信率比較

在BALF-mNGS檢測(cè)陽(yáng)性的59例中，其中采信的42例，mNGS結(jié)果未被采納的：其中11例病原體檢出序列數(shù)少，無(wú)法充分支持其為致病原；6例因病原種類(lèi)多且分散，再結(jié)合臨床(病史、影像、癥狀等)，無(wú)法分辨致病菌、定植菌、污染菌。常規(guī)檢測(cè)方法陽(yáng)性43例，臨床采信的21例；BALF-mNGS的臨床采信率高于常規(guī)方法(P<0.05)。聯(lián)合兩種方法采信的有47例，與單用常規(guī)方法檢測(cè)，采信率顯著高(P<0.01)，但與單用BALF-mNGS相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 BALF-mNGS和常規(guī)方法的采信率比較

隨后，我們對(duì)比了無(wú)基礎(chǔ)疾病及有基礎(chǔ)疾病組的BALF-mNGS的采信率，有基礎(chǔ)疾病組陽(yáng)性例數(shù)有34例，其中采信的占25例，無(wú)基礎(chǔ)疾病的陽(yáng)性例數(shù)25例，其中采信的17例，兩組之間采信率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

四、mNGS對(duì)不同病原體的診斷價(jià)值

在59例肺部感染患者中，聯(lián)合BALF-mNGS和常規(guī)方法最后明確病原的有47例，其中診斷為細(xì)菌性肺炎的24例，病毒性肺炎0例，非典型病原體感染1例(肺炎支原體)；肺結(jié)核13例；真菌性肺炎3例(念珠菌2例，曲霉菌1例)；混合性肺部感染6例(細(xì)菌+真菌感染5例，病毒+真菌1例)。BALF-mNGS對(duì)細(xì)菌性肺炎的檢出率顯著高于常規(guī)方法(P<0.05)，但真菌、結(jié)核菌及混合性感染檢出率兩者間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。此外，在混合性肺部感染中，聯(lián)合mNGS和常規(guī)方法的檢測(cè)完整率較單用常規(guī)方法顯著高(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 BALF-mNGS和常規(guī)方法的不同病原體檢出率比較[n(%)]

討 論

肺部感染是好發(fā)于各年齡階段的呼吸道疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，近年來(lái)呼吸道感染性疾病病原學(xué)的流行病學(xué)也發(fā)生了變遷，主要表現(xiàn)為：1)發(fā)病率增加2)主要菌種分布改變3)新型病原體出現(xiàn)4)耐藥率的增加；有些甚至出現(xiàn)混合性肺部感染，因此針對(duì)性的抗病原學(xué)治療，無(wú)疑是獲得有效治療的前提[8]。近年來(lái)關(guān)于mNGS的研究有許多，但作為一種新技術(shù)，其是否能替代常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)方法，仍具有爭(zhēng)議[9]。

首先，我們初步評(píng)估了BALF-mNGS在肺部感染中的檢測(cè)陽(yáng)性率及臨床采信率。目前國(guó)內(nèi)外有研究證實(shí)了mNGS較培養(yǎng)、PCR等檢測(cè)方法的敏感性及特異性高[10-13]。我們的研究數(shù)據(jù)表明，BALF-mNGS陽(yáng)性率高于BALF培養(yǎng)，并且其陽(yáng)性率及采信率均較多種常規(guī)方法聯(lián)合高。此外，mNGS在有基礎(chǔ)疾病組及無(wú)基礎(chǔ)疾病組間的陽(yáng)性率及采信率差別不大。實(shí)際上，mNGS往往多被用于有基礎(chǔ)疾病人群，尤其是合并免疫致?lián)p疾病的，因?yàn)橥庖吡Φ拖禄颊叻尾扛腥局虏≡鼜?fù)雜、合并罕見(jiàn)病原體的幾率相對(duì)更大，治療難度也大。而mNGS能通過(guò)比較不同病原的相對(duì)序列數(shù)，幫助盡早篩選出可能的致病菌，早期識(shí)別混合性感染、罕見(jiàn)病原體以及新型病原體[6,14-15]。對(duì)于無(wú)基礎(chǔ)疾病組，盡管我們的數(shù)據(jù)顯示常規(guī)方法的陽(yáng)性率不及mNGS，但該類(lèi)患者大多為常見(jiàn)病原體、或者對(duì)經(jīng)驗(yàn)性治療佳，mNGS對(duì)于常見(jiàn)病原體的優(yōu)勢(shì)并不顯著，并且不及常規(guī)檢測(cè)方法經(jīng)濟(jì)。

其次，我們探討了mNGS對(duì)不同病原的診斷價(jià)值，綜合多項(xiàng)研究，mNGS對(duì)于常見(jiàn)菌的檢測(cè)效果較培養(yǎng)相比無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于少見(jiàn)病原體、病毒、結(jié)核菌、真菌、混合性肺部感染的作用更可觀(guān)[4,16-17]。我們的數(shù)據(jù)表明：mNGS檢出細(xì)菌的陽(yáng)性率較常規(guī)方法高，對(duì)于真菌、結(jié)核分枝桿菌及混合性感染兩種方法檢出率相當(dāng)，但對(duì)于混合性肺部感染，mNGS與常規(guī)方法聯(lián)合檢測(cè)更全面。這與他人的研究存在差異，綜合多因素考慮：1) 真菌及結(jié)核分枝桿菌在經(jīng)試劑處理后，核酸的釋放量相對(duì)低，因此限制了mNGS的檢測(cè)效力；2) 結(jié)核分枝桿菌、真菌及混合性肺部感染檢出例數(shù)相對(duì)較少，不能全面的反映mNGS的檢測(cè)效率。綜合考慮，mNGS的病原體檢測(cè)能力較常規(guī)方法更可觀(guān)。但無(wú)論如何，mNGS對(duì)于真菌及結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的總體陽(yáng)性率低，后期如何更進(jìn)一步提高這種微生物的檢測(cè)陽(yáng)性率，值得深入研究。

綜上所述，mNGS在肺部感染中能有效提高病原體的檢出陽(yáng)性率及采信率，能早期較直觀(guān)的識(shí)別出致病原，對(duì)于混合性肺部感染，可將mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法聯(lián)合，從而增加診斷的精準(zhǔn)度。

本研究的不足：該研究為回顧性研究，樣本量有限，各組的樣本量相對(duì)不均衡，需擴(kuò)大樣本量，同時(shí)盡量保持組間樣本量均衡，增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。