孫峰 楊建中 劉雪梅 燕存子 周晨亮

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)自2019年12月以來呈全球暴發(fā)流行趨勢(shì)，已成為危害全球人民健康的重大傳染性疾病。COVID-19是病毒性肺炎的一種，機(jī)體的免疫狀態(tài)對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展有重要影響，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，外周血CD4、CD8細(xì)胞計(jì)數(shù)水平越低，患COVID-19的風(fēng)險(xiǎn)性越大[1]，且與嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。然而對(duì)于細(xì)胞免疫指標(biāo)在整個(gè)病程中的動(dòng)態(tài)演變過程及其對(duì)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的影響，尚未見報(bào)道。本研究回顧性收集確診COVID-19患者的臨床資料，分析從發(fā)病到核酸轉(zhuǎn)陰整個(gè)病程中細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)的變化過程，期望闡述新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)的影響及與病毒核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的關(guān)系，為加快病毒肅清、縮短病程尋找治療方向。

資料與方法

一、研究對(duì)象

通過電子病歷系統(tǒng)回顧性收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院東院收治且于2020年2月20日至2020年3月15日好轉(zhuǎn)出院的確診COVID-19患者，根據(jù)病歷資料及實(shí)驗(yàn)室檢查，評(píng)估臨床分型。診斷標(biāo)準(zhǔn)、出院標(biāo)準(zhǔn)及臨床嚴(yán)重程度分型參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不全或首發(fā)癥狀不典型，不能明確發(fā)病時(shí)間者；②未完成細(xì)胞免疫檢測(cè)者。

二、研究方法

回顧性收集的所有患者多次免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)不均衡，故本研究以發(fā)病時(shí)間(即出現(xiàn)癥狀日期)為起點(diǎn)，按照發(fā)病0～4 d(P0)、5～7 d(P1)、8～10 d(P2)、11～14 d(P3)、15～21 d(P4)、22～28 d(P5)、29～35 d(P6)、36 d以上(P7)分為8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將所有免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo)歸入各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分組比較。按照核酸轉(zhuǎn)陰距離發(fā)病時(shí)間分為兩組：A組，核酸轉(zhuǎn)陰距發(fā)病時(shí)間≤30d；B組，核酸轉(zhuǎn)陰距發(fā)病時(shí)間>30d。發(fā)病時(shí)間以電子病歷中記錄的首次出現(xiàn)COVID-19典型臨床表現(xiàn)(發(fā)熱或呼吸道癥狀)的日期為準(zhǔn)。研究終點(diǎn)：連續(xù)兩次呼吸道分泌物檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陰性(采樣時(shí)間間隔24h以上)。核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間，以連續(xù)兩次呼吸道分泌物檢測(cè)核酸陰性時(shí)的首次核酸陰性日期為準(zhǔn)。同時(shí)記錄病程中是否有使用糖皮質(zhì)激素的情況。

三、新型冠狀病毒核酸檢測(cè)及判讀

病毒核酸檢測(cè)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)室完成，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，2019nCov核殼蛋白基因和開放閱讀編碼框1ab同時(shí)陽性者判讀為陽性，同時(shí)陰性者判讀為陰性，某一項(xiàng)為陽性者判讀為可疑，需重新采樣復(fù)查。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般資料

本研究共檢出COVID-19患者135例，其中12例因病史資料中缺乏COVID-19典型癥狀無法確定發(fā)病日期而剔除，另有7例因未完成細(xì)胞免疫檢測(cè)而剔除。最終本研究納入病歷116例，其中男性60例(50.9%)，女性56(49.1%)，年齡25～83歲，中位數(shù)年齡59.5歲。普通型38例，重型72例，危重型6例。主要的臨床首發(fā)癥狀包括：發(fā)熱102例(87.9%)，咳嗽77例(66.4%)，咯血7例(6%)，呼吸困難(包括胸悶、氣促、氣短)53例(45.7%)，腹瀉17例(14.7%)，惡心嘔吐7例(6%)，胸痛9例(7.8%)。有基礎(chǔ)疾病者共61例(52.9%)，其中較常見的有高血壓33例(28.4%)，糖尿病15例(12.9%)。發(fā)病日期從2020年1月6日到2月17日，核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間12～51d，平均30.79±8.48d，中位時(shí)間33d。A組與B組分別有患者37例、79例，兩組基線資料比較(見表1)，性別、年齡、嚴(yán)重程度分型、合并高血壓、合并糖尿病比例兩組間無顯著差異(P>0.05)。

表1 A、B兩組基線資料比較

用廣義線性混合模型分析細(xì)胞免疫指標(biāo)的動(dòng)態(tài)演變：共收集來自116例COVID-19患者在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果238份，廣義線性混合模型分析結(jié)果(見表2)。CD3、CD4、CD8、CD19計(jì)數(shù)組間有顯著性差異(P<0.05)，動(dòng)態(tài)變化(見圖1)所示，各指標(biāo)P0點(diǎn)均在正常范圍，隨時(shí)間逐漸下降，CD3、CD4、CD8、CD19在P2降至最低，CD3、CD4、CD8平均值明顯低于正常值，P3時(shí)開始恢復(fù)。CD19、CD16+/56+的平均值在全程中均在正常范圍內(nèi)。CD4/CD8各組無顯著性差異(P>0.05)。年齡對(duì)CD8和CD16+/56+變化有影響，隨年齡增高，CD8計(jì)數(shù)下降，CD16+/56+計(jì)數(shù)升高。合并糖尿病者CD3、CD4、CD16+/56+計(jì)數(shù)下降。疾病嚴(yán)重程度分型可以影響CD3、CD4變化。甲強(qiáng)龍使用僅影響CD16+/56+計(jì)數(shù)，使其計(jì)數(shù)下降。

表2 ROC曲線評(píng)估免疫指標(biāo)對(duì)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖1 細(xì)胞免疫的動(dòng)態(tài)變化

表2 細(xì)胞免疫指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的廣義線性混合模型

細(xì)胞免疫指標(biāo)與核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的關(guān)系：A組、B組分別有細(xì)胞免疫樣本60份、178份，其中CD3、CD4、CD8在P3點(diǎn)組間有顯著性差異(P<0.05)，CD8在P0、P3兩點(diǎn) B組CD8計(jì)數(shù)分別為165.25±120.39、179.23±143.61，顯著低于A組(463.50±119.50、426.68±286.47)，明顯低于正常范圍220～1129，(P<0.05)。發(fā)病初期B組CD19較A組更低，尤其在P3點(diǎn)，B組和A組CD19計(jì)數(shù)分別為141.94±60.24、244.89±183.21(P=0.136)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能與病例數(shù)少有關(guān)(B組17例、A組9例)。細(xì)胞免疫在組間與組內(nèi)差異(見圖2)。

圖2 AB組間細(xì)胞免疫指標(biāo)的比較

甲強(qiáng)龍對(duì)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的影響 116例患者，使用糖皮質(zhì)激素治療的有66例，未使用的有50例，所有使用糖皮質(zhì)激素的病例均使用甲強(qiáng)龍，且每日劑量不超過160 mg，總療程不超過20d。兩組的核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間分別為33.42±8.509d、33.36±8.268d，兩組間無顯著性差異(P>0.05)。A組與B組甲強(qiáng)龍使用病例分別為21例(56.8%)、45例(57%)，兩組無顯著差異(P>0.05)(見表1)。

采用ROC曲線評(píng)估免疫指標(biāo)對(duì)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的預(yù)測(cè)價(jià)值 P3點(diǎn)共納入26例病例，分別以CD3、CD4、CD8為檢驗(yàn)變量，以核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間分組為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，結(jié)果(見表3，圖3)。結(jié)果顯示P3點(diǎn)CD3、CD4、CD8下降可預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長(P<0.05)。

圖3 各指標(biāo)預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的ROC曲線

討 論

COVID-19正在全球范圍蔓延，傳染性比2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)和2013年的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)更強(qiáng)[4]，嚴(yán)重威脅全球各國人民的生命健康。SARS-CoV-2進(jìn)入人體，與呼吸道、消化道黏膜上ACE2受體結(jié)合，不斷復(fù)制增殖[5]，肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞會(huì)釋放大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子，啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可有效抑制病毒的復(fù)制，也可導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，引起多臟器功能衰竭，這與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能與COVID-19的發(fā)生及疾病嚴(yán)重程度的有關(guān)[1-2]，但之前的研究都只針對(duì)患者發(fā)病初期的一次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，而本研究共納入116例確診COVID-19患者238份細(xì)胞免疫結(jié)果，是首次從出現(xiàn)癥狀到呼吸道分泌物病毒核酸轉(zhuǎn)陰，分8個(gè)時(shí)間點(diǎn)探究細(xì)胞免疫功能的演變過程，為闡明整個(gè)病程中機(jī)體的免疫狀態(tài)提供依據(jù)。本研究納入患者核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間平均值為30.79±8.48d，比同類研究更長，可能由于入組患者為2020年2月20日至2020年3月15日出院的武漢地區(qū)患者，屬于武漢疫情終末階段，大多病程較長。以平均值為截點(diǎn)，將核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間分為A組(≤30d)和B組(>30d)，分析影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的因素。

本研究中細(xì)胞免疫主要檢測(cè)CD3計(jì)數(shù)、CD4計(jì)數(shù)、CD8計(jì)數(shù)、CD19計(jì)數(shù)及CD16+/56+計(jì)數(shù)，其中CD3是成熟T淋巴細(xì)胞表面的標(biāo)志；CD4是輔助性T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染作用和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，是SARS-CoV-2感染的肺泡中浸潤的主要淋巴細(xì)胞[6]；CD8是抑制/殺傷T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，是特異性直接殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)T細(xì)胞，在對(duì)SARS的研究中發(fā)現(xiàn)CD8T淋巴細(xì)胞可以清除被病毒感染的細(xì)胞，且CD8記憶T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)至少6年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過病毒特異性抗體IgG的保護(hù)作用[7]；CD19是B淋巴細(xì)胞表面特有的，可通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖活化介導(dǎo)體液免疫；CD16和CD56代表自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，是機(jī)體抗感染的重要免疫因素。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病0～4d細(xì)胞免疫指標(biāo)平均值均在正常范圍內(nèi)，隨著疾病發(fā)展，CD3、CD4、CD8明顯下降，至發(fā)病8～10d降至最低點(diǎn)，隨后逐漸恢復(fù)，至發(fā)病22～28d恢復(fù)至較高水平。且CD3、CD4、CD8均與核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間有關(guān)，A組CD3、CD4、CD8最低點(diǎn)均在發(fā)病8～10d，而B組在發(fā)病8～10d后CD3、CD4、CD8細(xì)胞會(huì)繼續(xù)減少，直至發(fā)病11～14d后才逐漸恢復(fù)。ROC曲線結(jié)果顯示11～14d CD3、CD4、CD8可預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長，這說明T淋巴細(xì)胞的持續(xù)減少可能預(yù)示著核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的延長。

本研究采用廣義線性混合模型分析各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞免疫指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，年齡、糖尿病和疾病嚴(yán)重程度是影響細(xì)胞免疫指標(biāo)的變化的危險(xiǎn)因素，尤其對(duì)T淋巴細(xì)胞影響顯著。年齡越高，CD8計(jì)數(shù)越低。糖尿病患者CD3、CD4計(jì)數(shù)下降。這可能是老年患者及合并糖尿病患者是新冠肺炎高危人群的原因之一。本研究A組和B組患者年齡及合并糖尿病比例無顯著差異，說明核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長與新冠病毒感染導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞減少有關(guān)。

COVID-19患者治療中糖皮質(zhì)激素的使用一直存在較大分歧，本研究發(fā)現(xiàn)甲強(qiáng)龍使用僅影響CD16+/56+計(jì)數(shù)，而對(duì)CD3、CD4、CD8、CD19無顯著影響，說明甲強(qiáng)龍的使用對(duì)T淋巴細(xì)胞影響較小。同時(shí)甲強(qiáng)龍的使用不會(huì)影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間。有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)COVID-19并發(fā)ARDS的患者中甲強(qiáng)龍的使用可以降低死亡率。把握好適應(yīng)癥、適量使用甲強(qiáng)龍可能改善COVID-19患者預(yù)后。

本研究認(rèn)為SARS-CoV-2感染機(jī)體后會(huì)導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CD3、CD4、CD8的變化可以預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間，發(fā)病14d后CD3、CD4、CD8計(jì)數(shù)減少可能預(yù)示核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長。但本研究各時(shí)間點(diǎn)納入樣本量不均衡，缺乏同一患者動(dòng)態(tài)隨訪資料，尚需進(jìn)一步研究SARS-CoV-2與T淋巴細(xì)胞的相互作用，闡明COIVD-19的免疫損傷機(jī)制，為尋找可能的干預(yù)手段，指導(dǎo)COVID-19的臨床治療提供思路。