田原野 康非吾

骨是血管化程度較高的組織,骨內有豐富的血供來維持其營養(yǎng)和氧濃度，其血供大約占心排血量的10%，但由于閉合性骨折、炎癥、感染、腫瘤等許多局部或全身性因素可以造成骨組織內血流中斷或減少,從而引發(fā)組織缺氧[1]。缺氧作為閉合性骨折后微環(huán)境改變的特征之一，其成因主要為供應血管破損、正常的血液供應受到阻斷、血液快速凝固成血凝塊或血腫[2]；骨創(chuàng)傷部位無法獲得足夠的氧氣以及營養(yǎng)物質供應，逐步變成缺氧狀態(tài)[3]。如正頜手術LefortI 型截骨手術后鼻腭動脈、腭降動脈被切斷，廣泛的黏骨膜瓣切開翻起等使骨創(chuàng)傷區(qū)域氧分壓顯著降低至0～10mmHg，其骨折中心區(qū)氧分壓可降至0mmHg[4]。骨組織在缺氧下會產(chǎn)生一系列代償反應,如血流再分配、無氧代謝增加等以適應缺氧微環(huán)境[5]，作為對局部氧環(huán)境進行感受和應答的核心分子，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α 在骨愈合過程中的骨生成、骨吸收以及骨內血管的生成中均發(fā)揮著一定作用。

1.缺氧誘導因子-1α

1.1 缺氧誘導因子-1α 的結構及功能 人體有多種強大的機制來解決組織中缺氧狀態(tài)下氧氣利用率的降低；如(1)增加心輸出量和通氣量；(2)改善血管生成；(3)提高血液中氧氣的承載能力；(4)將有氧呼吸轉換為無氧呼吸。在細胞水平上，HIF轉錄因子家族驅動著骨組織內細胞對缺氧微環(huán)境的適應[6]；骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、成骨細胞以及破骨細胞的分化和功能與缺氧誘導因子密切相關。缺氧誘導因子家族包括3 種α 亞單位：HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α，這三種α 亞 單位通過與HIF-1β 組成異二聚體來發(fā)揮其調控作用[7]。其中HIF-1α 和HIF-2α 作為轉錄活性因子，主要與血管生成相關，但缺氧狀態(tài)下HIF-2α 的穩(wěn)定性不如HIF-1α；HIF-3α 則是具有負向調控作用的調節(jié)因子[8]，然而這兩種HIF 亞單位在骨折愈合過程中的作用尚缺乏深入研究。HIF-1α 包括4 個結構域：其中C 端包括TAD-N 和TAD-C 兩個反式激活結構；中間段為受氧依賴調控的降解結構域ODDD；N 末端包括bHLH 域和PAS 域，這兩個結構域主要與HIF-1β 的二聚化以及靶基因的結合有關[9]。在常氧條件下，ODDD 結構域中的脯氨酸能夠被脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase,Phd)羥基化，被Phd 羥基化后能與Von Hippel-Lindau(VHL)連接；VHL 再將HIF-1α 進行泛素化修飾，經(jīng)過泛素化修飾之后的HIF-1α 將被水解而失去功能[10]。氧分壓降低后，脯氨酸的羥基化作用受到抑制，使得HIF-1α 蛋白能與HIF-1β 形成二聚體，從而啟動其下游基因表達。此外HIF-1α 也可被一些金屬離子(如Mg2+、Ni2+、Cu2+等)、物理因素如超聲波和一些細胞因子，包括白細胞介素-1、腫瘤壞死因子和成纖維細胞生長因子等調節(jié)[11]。HIF-1α的下游靶基因約有100 多種，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、促紅細胞生成素、血紅素氧合酶-1、葡萄糖轉運蛋白1、內皮素1、轉鐵蛋白等，這些分子在調節(jié)組織內氧的穩(wěn)態(tài)以及恢復細胞內微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。

1.2 缺氧誘導因子-1α 在骨內的調控機制 現(xiàn)階段普遍認為的缺氧誘導因子調節(jié)骨的代謝機制主要為HIF/ VEGF 通路及HIF/ Wnt 通路。HIF/VEGF 通路調控血管生成與骨的代謝主要涉及成骨細胞和血管內皮細胞的相互信號傳遞：內皮細胞分泌骨形成蛋白2 促進骨形成，成骨細胞分泌VEGF增強血管生成[12]。在體內實驗中，上調成骨細胞中的Phd、VHL 或HIF 可以增加VEGF 和血管生成[13]，敲除成熟成骨細胞中的HIF-1α 會等效地降低VEGF 的表達和血管體積，HIF-1α 高表達可以相應地增加VEGF。在骨組織生物學中，Wnt 信號的轉導發(fā)生在骨形成過程中[14]，是進行新骨沉積所必需的。已有體內外實驗證實HIF-1α 與Wnt信號傳導之間的相關性，敲除HIF-1α 的小鼠能通過Wnt/ β-catenin 通路上調骨生成，而VHL和HIF-1α 能協(xié)同降低Wnt 信號傳導[15]。另有學者發(fā)現(xiàn):低氧或低氧模擬物會增加骨組織中的Wnt信號[16]，HIF-1α 與β-catenin 結合可以阻止Wnt靶基因的轉錄[17]。盡管這些研究確定了缺氧對Wnt信號的影響，但這也可能是成骨細胞的表觀遺傳修飾改變所造成的,因此尚需進一步研究。

2.骨折愈合

骨折的愈合過程是斷端骨組織的修復再生反應,主要由骨生成相關的成骨細胞、軟骨細胞、骨細胞，骨吸收相關的破骨細胞和骨血管新生相關的血管內皮細胞共同參與。骨折愈合過程可分為：①血腫機化期②纖維骨痂形成期③骨性骨痂形成期。血腫機化期主要是骨折兩周以內，局部因為骨折出血而形成血腫，然后引起無菌性的反應，形成肉芽組織，并逐漸轉為纖維組織，HIF-1α 此時主要引起血管的生成。纖維骨痂形成期，骨內膜及骨外膜形成內、外的原始骨痂逐漸的鈣化、骨化，形成環(huán)狀骨痂及髓腔內骨痂，HIF-1α 此時主要引起大量的成骨細胞在局部聚集，逐漸的形成骨痂。骨性骨痂形成期，在引力的作用下骨痂改造塑形，恢復骨的原形，此時HIF-1α 主要引起破骨細胞和成骨細胞的偶連代謝。缺氧誘導因子-1α 在骨愈合過程中的主要通過與骨生成、骨吸收以及骨內血管的關系來影響骨折愈合。

2.1 骨生成與缺氧誘導因子-1α 的關系 HIF-1α 驅動的信號主要通過成骨細胞、軟骨細胞、骨細胞適應缺氧環(huán)境來調節(jié)及參與骨組織的形成。HIF-1α 可以促進BMSCs 的聚集和骨發(fā)育，通過增加Sox9 基因的表達來調節(jié)軟骨生成[18]。在軟骨細胞內敲除HIF-1α 上游的Phd2 或Vhl 的小鼠中[19]，其軟骨分化能力增強，二次骨形成的量增加，這可能是由于肥大軟骨細胞向成骨細胞分化所以產(chǎn)生了骨量升高的表型。骨祖細胞中Phd1/ 2/ 3基因的個別缺失未能產(chǎn)生骨骼表型，而Phd1/ 2/ 3基因的聯(lián)合缺失增加了靶基因HIF-1α 表達，血管生成增加、骨小梁密度及微結構發(fā)生變化[13]。在敲除Phd2 的前成骨細胞或敲除HIF-1α 的成熟成骨細胞中觀察到骨骼的發(fā)育畸形或骨密度降低的現(xiàn)象[20]。成熟成骨細胞中的VHL 缺失會導致骨密度升高的表型，可能與增加的血管密度以及成骨速率增加有關。骨細胞內HIF-1α 缺失的小鼠在表型上與野生型對照相似,而敲除骨細胞中Phd2 或Vhl 會使小鼠骨組織中骨量升高[21]。

骨折后缺氧環(huán)境中的HIF-1α 將招募BMSCs，并上調其向成骨細胞方向的分化能力[22]。軟骨細胞所產(chǎn)生的HIF-1α 能刺激纖維骨痂內的血管新生和軟骨基質分泌[23]。在骨折愈合過程中如果出現(xiàn)血管形成異常，成骨細胞將不能正常替代軟骨細胞，從而影響軟骨基質向骨基質的礦化，骨組織無法正常愈合[24]。HIF/ VEGF 通路主要經(jīng)由血管生成來影響骨的愈合，也能促進BMSCs 的增殖和遷移，缺氧預處理能夠抑制BMSCs 的凋亡，維持BMSCs 的干性[25]。而HIF/ Wnt 通路主要能夠調控BMSCs向成軟骨方向分化，抑制成骨細胞凋亡，促進其成骨能力[26]。骨細胞在缺氧環(huán)境下高表達HIF-1α[27]，并通過JNK 通路上調核因子受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)的分泌，誘導破骨向分化，影響骨的代謝。這些研究結果提示，HIF-1α 可以通過調節(jié)骨生成相關細胞來調節(jié)骨愈合中的骨生成過程。

2.2 骨吸收與缺氧誘導因子-1α 的關系 破骨細胞在骨吸收和骨重塑中起作用，其功能異常會引起許多骨骼疾病[28]。破骨細胞由髓樣造血干細胞融合而成，最主要的調控因子為巨噬細胞集落刺激因子(myeloid colony-stimulating factors,M-CSF)及RANKL，在兩者作用下髓樣單核細胞附著于骨表面逐漸分化成熟，表達組織蛋白酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、基質金屬蛋白酶等，進而行使骨吸收功能[29]。成熟的破骨細胞在行使骨吸收功能時，細胞骨架重排，裙皺緣上的質子泵分泌帶H+的酸來降解骨組織[30]。破骨細胞由血氧濃度飽和的骨髓中發(fā)育而來，逐漸逆氧濃度梯度，在氧分壓較低的骨表面或者骨折斷端逐漸分化成熟。隨著氧分壓的逐步降低,抗酒石酸鹽染色陽性的多核巨細胞數(shù)量明顯增加，而且骨吸收陷窩也相對增多,在氧分壓達到2%～5%時，破骨細胞前體細胞分化成熟達到最大值，能融合成比常氧狀態(tài)下體積更大，細胞核數(shù)量更多的破骨細胞[31]。缺氧狀態(tài)下破骨細胞分化成熟和骨吸收能力的增強可能與破骨細胞體積的增加、核數(shù)量增多、基因及蛋白表達量升高有關。缺氧可以改變細胞外酸性環(huán)境，缺氧組織中的無氧呼吸所產(chǎn)生的酸也能與缺氧相互協(xié)同作用[32],共同促進破骨細胞的分化，影響骨的吸收。

在骨折愈合時，HIF-1α 所募集的破骨細胞啟動骨痂的重塑，纖維骨痂逐漸被編織骨替代[33]，加快骨痂吸收和重塑可在一定程度上促進骨折愈合。激活HIF-1α 既能增加破骨細胞的數(shù)量又能增加其活性，使破骨細胞分泌更多的基質金屬蛋白酶和組織蛋白酶等，提高破骨細胞在吸收死骨和骨重塑的效率。骨的吸收是一個耗能過程，HIF-1α 的表達能夠通過增加葡萄糖和谷氨酰胺載體的轉錄、增加糖酵解和谷氨酰胺的分解并產(chǎn)生ATP[34]，這也可能是HIF-1α 調節(jié)破骨細胞活性的機制之一。此外，HIF-1α 能夠上調趨化因子及其受體的表達，趨化因子及其受體可以促進骨祖細胞與破骨細胞的募集、維持骨祖細胞與破骨細胞之間的黏附作用及生理穩(wěn)態(tài)[35]。以上研究提示，骨折修復過程中，HIF-1α 和相關因子將募集破骨細胞，調節(jié)骨細胞的骨吸收能力，起到調節(jié)骨折愈合的作用。

2.3 骨內血管生成與缺氧誘導因子-1α 的關系 骨折部位的機械刺激、炎癥信號以及由于氧和營養(yǎng)的供應被中斷所導致的缺氧環(huán)境將啟動骨的修復，當血管形成異常，骨組織將無法正常愈合，出現(xiàn)骨不連、骨壞死、骨折愈合延遲等情況[36]。氧氣和營養(yǎng)供應的中斷可以使HIF-1α 蓄積，這對刺激血管和新骨形成有重要意義。在骨折的早期階段，HIF-1α 在骨折斷端表達升高，骨折10d 達到峰值。牽張成骨模型中，骨切開后HIF-1α/ VEGF被激活，VEGF 促進血管內皮細胞增殖分化，維持骨痂內的血氧供應，保障骨愈合的正常進行[37]；在骨的牽張期間上調HIF-1α 能刺激更多的血管和新骨形成，血管和骨質密度明顯升高；而在特異性HIF-1α 基因敲除鼠中，牽張成骨的部位血管數(shù)量減少、骨密度降低，出現(xiàn)編織骨無法正常替代纖維骨痂，出現(xiàn)骨折愈合延遲[38-39]。利用缺氧模擬物(去鐵胺)能夠抑制脯氨酸羥化酶，從而阻止脯氨酸羥化酶對HIF 的降解，使HIF-1α 蓄積激活缺氧相關通路，可以有效地刺激新生血管形成提高牽張成骨中的骨質密度[40]。以上研究提示，骨折愈合時HIF-1α 通過刺激VEGF 來調控骨內血管的生成，保證新生骨的血氧和營養(yǎng)物質供應，保障骨愈合正常進行。

3.結語

迄今的大量研究已經(jīng)證明骨組織中的缺氧信號對于骨折的修復至關重要；HIF-1α 可以影響骨內的成骨相關細胞、破骨細胞以及骨內的血管生成，HIF-1α 相關信號通路的異常會導致骨折的愈合障礙。雖然骨折的愈合是一個緩慢而復雜的過程，但是有望通過藥理學手段調控HIF/ VEGF 通路及HIF/ Wnt 通路改變骨折愈合進程，加速骨折修復。總之,在骨折的愈合過程中，缺氧誘導因子起到了一定的作用，調節(jié)骨折內的缺氧代謝環(huán)境或缺氧誘導因子有望成為一種新的促進骨折愈合的方法。