殷悅，王雅梅

(首都醫(yī)科大學(xué) a.2017級臨床醫(yī)學(xué)“5+3”一體化專業(yè)三班,b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)系，北京 100069)

白血病是由造血干細(xì)胞惡性增殖、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制引起的血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病。近年來，白血病的發(fā)病率呈上升趨勢，在我國各種惡性腫瘤致死率中居第六位(男性)和第八位(女性)，在兒童和青少年的惡性腫瘤中居第一位[1-3]。由于白血病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，而其隱匿性、異質(zhì)性和復(fù)雜性[4]，增加了早期診斷的難度，致使一些患者錯過最佳的治療時機(jī)；盡管通過放療、化療、骨髓移植以及免疫學(xué)療法治療可以提高白血病患者的生存率，但停止治療后由耐藥引起的復(fù)發(fā)也成為臨床治療的難題[5]。

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，高通量測序技術(shù)的突破性發(fā)展推動了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的到來。高通量測序技術(shù)為臨床腫瘤學(xué)的研究開拓了新思路，提供了解決難題的有效方法[6]。目前，高通量測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于白血病的臨床研究，在白血病相關(guān)突變基因的篩查、尋找新的治療靶點(diǎn)、個性化治療以及預(yù)后監(jiān)測方面均顯示出巨大的優(yōu)勢[7]?，F(xiàn)主要介紹高通量測序技術(shù)在白血病臨床診斷、患者風(fēng)險分層、治療、預(yù)后分析中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 高通量測序技術(shù)概述

1.1高通量測序技術(shù)的發(fā)展 繼Sanger測序?yàn)榇淼牡谝淮鷾y序技術(shù)問世以來，基因測序技術(shù)不斷發(fā)展。2005年，隨著瑞士Roche公司的焦磷酸測序技術(shù)、美國Illumina公司的Solexa和美國ABI的SOLiD等測序平臺的出現(xiàn)，標(biāo)志著第二代測序技術(shù)即高通量測序時代的到來。此后，高通量測序技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，出現(xiàn)并行單分子合成測序技術(shù)、單分子實(shí)時合成測序技術(shù)、納米孔單分子測序技術(shù)、基于熒光共振能量傳遞的測序技術(shù)等第三代測序技術(shù)[8]。目前，高通量測序技術(shù)可以同時對幾百萬甚至數(shù)億條DNA序列進(jìn)行測序[9]。第三代測序技術(shù)彌補(bǔ)了第二代測序技術(shù)的缺陷，具有通量更高、測序時間更短、數(shù)據(jù)讀取速度更快的特點(diǎn)，可提高測序的精確度、降低測序反應(yīng)的成本，真正實(shí)現(xiàn)了單分子測序，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的重要技術(shù)手段。

1.2高通量測序技術(shù)的應(yīng)用 高通量測序技術(shù)以大數(shù)據(jù)、多維度的研究模式提高了醫(yī)學(xué)研究的效率，改變了人們對疾病的認(rèn)識。全基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳組學(xué)的高通量測序分析在揭示腫瘤異質(zhì)性、追蹤細(xì)胞譜系、探索腫瘤克隆演變的復(fù)雜機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用[10]。在白血病的臨床檢測中，國際指南已將越來越多的基因突變列為預(yù)后指標(biāo)，建議利用高通量測序技術(shù)篩查多基因突變進(jìn)行預(yù)后評估[11]。高通量測序技術(shù)與經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的有效融合使人類對白血病的生物學(xué)、遺傳學(xué)基礎(chǔ)有了更深入的了解[12]。

2 高通量測序技術(shù)在白血病臨床研究中的應(yīng)用

2.1在白血病診斷中的應(yīng)用 白血病是造血干細(xì)胞異?？寺⌒约膊?，具有高度的異質(zhì)性，受外界環(huán)境因素影響，血液腫瘤細(xì)胞會發(fā)生動態(tài)的基因突變和克隆演變。這種復(fù)雜的基因改變是傳統(tǒng)技術(shù)無法全面檢測的，而高通量測序技術(shù)可一次檢測多種基因變異，有效識別亞克隆，且靈敏度更高，在探索白血病基因突變、腫瘤克隆演變的復(fù)雜機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用。

2.1.1混合譜系白血病的診斷 混合譜系白血病是一類惡性程度高、預(yù)后差、治療難度大的急性白血病，因具有獨(dú)特的臨床和生物學(xué)特征而引起廣泛關(guān)注?；旌献V系白血病以基因重排為特征，常規(guī)的臨床診斷方法包括細(xì)胞遺傳學(xué)和熒光原位雜交，在許多患者中無法檢測到混合譜系白血病易位伴侶基因。長距離反向聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是混合譜系白血病臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但長距離反向PCR技術(shù)受DNA酶解程度、酶解片段自身環(huán)化效率的制約，環(huán)化易產(chǎn)生多聯(lián)體且需要大量的基因組DNA樣本。為了克服該技術(shù)的局限性，研究人員采用高通量測序的方法，只需要微量RNA樣本，結(jié)合錨定復(fù)合PCR富集快速識別患者標(biāo)本中廣泛的混合譜系白血病融合，采用美國Illumina公司Archer FusionPlex Heme(血紅素)和Myeloid(髓樣)試劑盒制備的文庫，在Illumina平臺進(jìn)行測序。與長距離反向-PCR相比，Archer FusionPlex錨定復(fù)合PCR富集高通量測序方法是檢測混合譜系白血病基因重排的相對簡單而有效的技術(shù)[13]。因此，對于混合譜系白血病的臨床診斷，Archer FusionPlex錨定復(fù)合PCR富集高通量測序有望成為新的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2急性髓細(xì)胞性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)的診斷 全基因組重測序使得大量臨床相關(guān)基因可以在一個單一的試驗(yàn)中同時進(jìn)行評估，快速、經(jīng)濟(jì)、有效地識別特定疾病人群的相關(guān)突變，在突變基因多和突變譜廣的情況下更為有效[14]。急性白血病的突變譜能夠鑒別具有診斷預(yù)后預(yù)測和治療作用的遺傳突變。研究表明，Ion Torrent PGMTM測序可以快速、簡便地獲得AML患者的基因突變譜，明確患者的基因型診斷，為AML進(jìn)一步分層診療、制訂治療方案提供依據(jù)[15]。

田淼等[16]報道了利用高通量微RNA(microRNA，miRNA)測序技術(shù)分析AML血漿外泌體miRNA，作為疾病監(jiān)測的標(biāo)志物來替代傳統(tǒng)骨髓穿刺活檢的研究。該研究采用Solexa高通量測序技術(shù)，分析了AML患者和正常人血漿外泌體miRNA的表達(dá)，獲得了211個顯著差異表達(dá)的miRNA。該結(jié)果與Hornick等[17]在小鼠模型中的研究結(jié)果一致。其中，血漿外泌體miR-155-5p、miR-335-5p、miR-451a有望作為AML早期診斷的分子標(biāo)志物，證實(shí)了高通量測序技術(shù)在癌癥早期診斷中的潛力。

高通量測序技術(shù)可以改進(jìn)和細(xì)分AML的遺傳學(xué)診斷，除了現(xiàn)有的世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)亞型，利用高通量測序的分析發(fā)現(xiàn)了AML的3個基因組類別：染色質(zhì)-剪接體、TP53基因-非整倍性以及IDH2R172基因突變[18]。

2.1.3兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)的診斷 兒童ALL的臨床遺傳學(xué)診斷通常使用核型分析(G帶)和熒光原位雜交，但是遺傳學(xué)技術(shù)不能捕獲癌癥基因組中復(fù)雜像差的全部光譜。Nordlund等[19]采用全基因組鏈讀測序技術(shù)分析了12例ALL基因組，高精度地解析出由細(xì)胞遺傳學(xué)定義的大多數(shù)基因組畸變，甚至在其中10例鑒定出遺傳學(xué)方法未能檢出的結(jié)構(gòu)重排，但DUX4-IGH融合基因未能檢出。全基因組鏈讀測序技術(shù)在ALL診斷方面可以作為傳統(tǒng)遺傳學(xué)技術(shù)的補(bǔ)充，有助于提高ALL遺傳學(xué)診斷的精準(zhǔn)度。

2.2在白血病患者風(fēng)險分層中的應(yīng)用 隨著白血病研究的不斷深入，患者在確診后還需要進(jìn)行各種預(yù)后指標(biāo)的全面檢查，根據(jù)不同的指標(biāo)對患者進(jìn)行風(fēng)險預(yù)測和分層，然后制訂合理的個性化治療方案，目的是減少低?；颊叩闹委煻拘?，使高?；颊叩玫接行е委?。染色體和各種基因變異是進(jìn)行風(fēng)險分層的重要指標(biāo)，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用提高了患者風(fēng)險分層的準(zhǔn)確性。

2.2.1ALL風(fēng)險分層 RNA測序技術(shù)和全基因組測序技術(shù)可以檢測基因的結(jié)構(gòu)變化和序列改變，細(xì)化ALL的亞型分類和風(fēng)險預(yù)測。ALL中有一種高危亞型被稱為費(fèi)城染色體樣(Philadelphia chromosome like,Ph-like)ALL。2016年，Ph-like ALL作為一種暫定亞型被納入WHO急性白血病分類，作為一種獨(dú)立的亞型存在。隨著基因組高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，更多與Ph-like ALL高危特點(diǎn)及預(yù)后不良有關(guān)的基因組改變被不斷發(fā)現(xiàn)。目前，Ph-like ALL的臨床試驗(yàn)正在檢測靶向性治療方法的可行性，研究人員預(yù)測高通量測序技術(shù)將開拓新穎精確的治療方案，包括脫細(xì)胞技術(shù)、以基因變異為導(dǎo)向的殘留病灶的監(jiān)測等[20]。

2.2.2AML風(fēng)險分層 基于高通量測序的多基因檢測在AML的風(fēng)險分層中也發(fā)揮了重要作用。日本科學(xué)家選取369例初生兒科AML患者中的139例進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析(RNA測序)，在53例患者中鑒定出54個框內(nèi)基因融合和1個Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1)基因框外融合。RNA測序結(jié)果揭示了兒童AML中基因重排和突變的復(fù)雜性，顯示了兒童AML患者和成人AML患者不同的實(shí)體特征，因此應(yīng)重新考慮風(fēng)險分層，為兒童AML患者臨床治療方案的制訂提供依據(jù)[21]。

傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)將AML患者分為良好、中度和不良風(fēng)險組。然而在包含了大部分患者的中等風(fēng)險組中，患者治療結(jié)果卻各不相同。Lin等[22]的研究利用高通量測序技術(shù)分析了112例接受標(biāo)準(zhǔn)治療的AML患者中的260個基因，從中找到了與預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立突變基因。在中等風(fēng)險細(xì)胞遺傳學(xué)的患者中，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α基因雙突變，異檸檬酸脫氫酶2和核仁磷酸蛋白1基因突變且缺乏FMS樣酪氨酸激酶3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)基因的患者更接近于具有良好風(fēng)險細(xì)胞遺傳學(xué)的患者。甲基胞嘧啶雙加氧酶2、RUNX1、ASXL1和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A基因突變的患者，則類似于具有不良細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險的患者。在此基礎(chǔ)上對患者重新分類，顯著減少了被分類為中度風(fēng)險的患者數(shù)量。此項(xiàng)研究表明，基于高通量測序的多基因測序在臨床上可用于建立指導(dǎo)治療決策的準(zhǔn)確風(fēng)險分層系統(tǒng)。

應(yīng)用高通量測序技術(shù)建立大量AML患者基因圖譜的數(shù)據(jù)庫，為AML的風(fēng)險分層等多種研究提供了有力支持。在癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)計(jì)劃的一項(xiàng)研究中，應(yīng)用高通量測序技術(shù)對200例AML患者進(jìn)行全基因組(50例)或全外顯子組測序(150例)，對RNA和miRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，得到了突變譜分析數(shù)據(jù)[23]。Gerstung等[24]設(shè)計(jì)了可以準(zhǔn)確預(yù)測緩解率、復(fù)發(fā)率和死亡率的多階段統(tǒng)計(jì)模型，并在單獨(dú)的TCGA患者數(shù)據(jù)集合上成功驗(yàn)證。在模擬中，總生存率不變的情況下，基于新算法的精確風(fēng)險分層能夠?qū)⑼N異體造血細(xì)胞移植術(shù)的數(shù)量減少多達(dá)25%。

2.3在白血病治療中的應(yīng)用 高通量測序是分析髓樣腫瘤基因變異頻譜的有力工具，再與靶向治療和基因組生物標(biāo)志物相結(jié)合，為許多患者的精準(zhǔn)醫(yī)療創(chuàng)造了條件[25-26]。傳統(tǒng)技術(shù)對于基因變異無法深入研究，因而對很多特殊、罕見的病例，高通量測序技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)技術(shù)的缺點(diǎn)。

2.3.1侵襲性自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)白血病的治療 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，多基因聯(lián)合檢測可以更好地進(jìn)行疾病發(fā)病機(jī)制的研究，基于高通量測序的突變分析的優(yōu)勢更加明顯[27-28]。侵襲性NK細(xì)胞白血病(aggressive natural killer cell leukemia，ANKL)是NK細(xì)胞腫瘤的一種罕見形式，大多數(shù)患者短期內(nèi)出現(xiàn)多器官功能衰竭，甚至在接受及時治療后數(shù)天至數(shù)月內(nèi)死亡，且常規(guī)的化療并不起作用[29-30]。Huang等[31]通過結(jié)合全基因組、轉(zhuǎn)錄組和靶向測序以及細(xì)胞因子芯片對ANKL的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了全面研究，先從8例新發(fā)ANKL患者的血液中分選帶有CD25+CD3-標(biāo)記的NK細(xì)胞、受損的正常粒細(xì)胞進(jìn)行全基因組測序，以尋找與ANKL相關(guān)的功能序列。研究人員采用美國Illumina公司的Ampli-Seq對29例ANKL患者的血漿樣本進(jìn)行靶向測序，在48%(14/29)的ANKL患者中發(fā)現(xiàn)了Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase-signal transduction and activator of transcription，JAK-STAT)途徑的突變。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果表明STAT3激活和MYC表達(dá)對于ANKL細(xì)胞的增殖和存活至關(guān)重要。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-10可以刺激STAT3的磷酸化，從而使癌細(xì)胞增殖，STAT3磷酸化抑制劑(Stattic)和MYC抑制劑(JQ1)可以抑制癌細(xì)胞增殖。該研究利用高通量測序技術(shù)，鑒定并在功能上驗(yàn)證了參與ANKL發(fā)病機(jī)制的IL-10/JAK-STAT/MYC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為開發(fā)治療這種亞型白血病的新藥提供了有力的支持。

2.3.2混合表型急性白血病的治療 應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析混合表型急性白血病致病基因潛在的調(diào)控位點(diǎn)，可為靶向治療提供依據(jù)。Granja等[32]通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù)和單細(xì)胞ATAC測序技術(shù)聯(lián)合分析，使用健康人的外周血和骨髓單個核細(xì)胞構(gòu)建造血發(fā)育的免疫表型、轉(zhuǎn)錄組和表觀單細(xì)胞圖譜，再將混合表型急性白血病患者的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子RUNX1可能潛在調(diào)控混合表型急性白血病患者惡性致癌基因，針對RUNX1抑制劑的研究將為治療混合表型急性白血病的藥物研發(fā)提供新思路。Hou等[33]利用高通量測序技術(shù)對原發(fā)性血小板增多癥患者進(jìn)行單細(xì)胞全外顯子測序發(fā)現(xiàn)了與原發(fā)性血小板增多癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)基因SESN2、NTRK1基因。關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)可以作為新的靶點(diǎn)，為新藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2.3.3AML的治療 通過高通量測序技術(shù)篩選出的AML相關(guān)突變基因包括核仁磷酸蛋白1、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α、RUNX1、FMS樣酪氨酸激酶3、TP53、ASXL1等[34]。目前，已被作為治療靶點(diǎn)列入白血病治療指南中。應(yīng)用這些靶點(diǎn)研發(fā)的分子靶向治療藥物有望提高AML患者的療效。如針對AML患者中FMS樣酪氨酸激酶3突變的抑制劑米朵妥林，異檸檬酸脫氫酶2突變選擇性抑制劑Enasidenib等[35]。Fu等[36]利用TCGA數(shù)據(jù)，結(jié)合德國AML合作組織提供的AML患者的臨床和生存信息數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析在全基因組范圍內(nèi)篩選出了與預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志基因FHL1基因，實(shí)驗(yàn)證實(shí)FHL1高表達(dá)不利于AML化療和骨髓移植的預(yù)后及患者的生存，因此FHL1有望成為新的治療靶點(diǎn)。高通量測序技術(shù)為AML患者的精準(zhǔn)治療提供了技術(shù)保障，逐漸推動AML由化療治療轉(zhuǎn)為靶向治療[36]，而精準(zhǔn)的靶向治療還有利于改善患者的預(yù)后[37]。

2.4在白血病預(yù)后分析中的應(yīng)用 微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是指經(jīng)治療后患者體內(nèi)仍存在惡性細(xì)胞，是ALL中最重要的獨(dú)立預(yù)后因素。使用高通量測序技術(shù)可以檢測治療后ALL患者體內(nèi)是否存在MRD，從而可以預(yù)測并采取措施預(yù)防白血病的復(fù)發(fā)。研究顯示，使用高通量測序檢測兒童ALL患者體內(nèi)球蛋白重鏈基因和互補(bǔ)決定區(qū)3基因，有助于分析白血病的分支演變模式；同時通過檢測MRD，協(xié)助判斷ALL患者復(fù)發(fā)的可能性[38]。目前公認(rèn)ALL的MRD分析金標(biāo)準(zhǔn)是利用等位基因特異性引物對克隆免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因重排進(jìn)行實(shí)時定量PCR。研究顯示，高通量測序在預(yù)測復(fù)發(fā)方面的靈敏度高于實(shí)時定量PCR[39]；此外，高通量測序還可以提供有關(guān)治療期間和治療后生理性B細(xì)胞和T細(xì)胞庫的信息，這些信息已顯示出與預(yù)后相關(guān)。因此，高通量測序在預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)方面有巨大的潛力且有望成為新的金標(biāo)準(zhǔn)。

在白血病的預(yù)后分析中，基因突變也是不容忽視的因素。特定基因突變與疾病的不良預(yù)后相關(guān)，如FBXW7基因[40]、IL-7R[41]、JAK1[42]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多與白血病預(yù)后不良的基因突變被檢出。目前WHO等權(quán)威的臨床指南已將基因突變引入惡性血液腫瘤的危險度預(yù)后分層和細(xì)化分類中，臨床相關(guān)的基因在指南更新中所占比例逐年增加。WHO對于髓樣腫瘤和AML的最新更新中包括了兩個新的分類：RUNX1突變的AML和BCR-ABL1基因的AML，且2017年歐洲白血病網(wǎng)關(guān)于AML的建議風(fēng)險分層中新增了RUNX1、ASXL1和TP53的基因突變[37]。因此，結(jié)合高通量測序技術(shù)的基因水平綜合評估和最小殘留疾病的評估有望進(jìn)一步改善風(fēng)險分層和白血病的預(yù)后。

3 展 望

高通量測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于白血病的臨床研究，在白血病相關(guān)突變基因的篩查、尋找新的治療靶點(diǎn)、個性化治療以及預(yù)后監(jiān)測方面均顯示出巨大優(yōu)勢，但仍面臨許多困難和挑戰(zhàn)。高通量測序技術(shù)測定的致病基因靶點(diǎn)，需要進(jìn)行大量驗(yàn)證以區(qū)分白血病基因變異的共性和異質(zhì)性，排除干擾因素。高通量測序技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷仍缺少規(guī)范的操作指南和數(shù)據(jù)解讀標(biāo)準(zhǔn)，不同的實(shí)驗(yàn)室測序方法、平臺、閱讀深度和變異分析可能不同。此外，通過高通量測序技術(shù)測定的標(biāo)志物目前還無法取代大多數(shù)的形態(tài)學(xué)檢查，需要大量的臨床研究制訂相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。為規(guī)范高通量測序技術(shù)在血液腫瘤診療中的應(yīng)用，中國抗癌協(xié)會血液腫瘤專業(yè)委員會聯(lián)合多家權(quán)威機(jī)構(gòu)和專家共同制訂了《二代測序技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用中國專家共識(2018年版)》[43]，該共識的制訂對高通量測序技術(shù)在血液腫瘤中的臨床應(yīng)用起到規(guī)范化的作用，為提高我國血液腫瘤的診療水平發(fā)揮重要作用。

美國國立癌癥研究院提出的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念是將個體疾病的遺傳學(xué)信息用于指導(dǎo)其診斷和治療的醫(yī)學(xué)。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，未來人們利用單分子測序技術(shù)可以建立個人基因組的信息檔案[44]，人類對疾病的認(rèn)識更加微觀，從基因的層面尋找治療靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。高通量測序技術(shù)在白血病臨床診斷、治療、預(yù)后以及新藥研發(fā)方面的應(yīng)用中已經(jīng)展示了巨大的潛力，對白血病的分類細(xì)化甚至為罕見病的治療帶來希望。目前，高通量測序技術(shù)還在飛速發(fā)展，其潛力有待進(jìn)一步發(fā)掘?？梢灶A(yù)見，隨著與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的突變基因、細(xì)胞信號通路和靶點(diǎn)的不斷發(fā)現(xiàn)，白血病有望早日實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。