黃凌佳 楊舒奇 孫欣 黃明莉

胚胎停育的定義為早孕期(妊娠12周以內(nèi))的胚胎丟失或胎兒停止發(fā)育的病理過程，影像學(xué)診斷提示空孕囊或無胎心的胎兒。隨育齡期婦女中發(fā)病率的逐年增高，探討胚胎停育原因的研究也在不斷發(fā)展及細(xì)化。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育組織中存在細(xì)胞過度凋亡和胎盤血管增殖不良[1]，以及免疫調(diào)節(jié)過度的現(xiàn)象。各種各樣參與不同途徑的分子標(biāo)記物被用于胚胎停育妊娠組織的研究，本文總結(jié)了近十年研究熱點(diǎn)的標(biāo)記物，按作用機(jī)制分析，從滋養(yǎng)細(xì)胞異常侵入與黏附、胎盤及絨毛血管生成、調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化這五個方面分別介紹這些分子標(biāo)記物具體的作用途徑，探究胚胎停育具體的發(fā)病機(jī)制。

一、滋養(yǎng)細(xì)胞異常侵入與黏附

1. 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類結(jié)構(gòu)中含有Zn2+、Ca2+的蛋白酶[1]，能夠特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)作為其特異的抑制劑，通過與有活性的MMPs中高度保守的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制MMPs作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育患者蛻膜組織中，MMP-2及MMP-9的表達(dá)水平明顯高于對照組，TIMP-1作為MMP-9的特異性抑制劑，其表達(dá)水平明顯低于對照組。在胚胎植入及胎盤形成過程中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)的適當(dāng)降解和滋養(yǎng)細(xì)胞侵入內(nèi)膜之間的某種平衡狀態(tài)能夠保證胚胎成功著床和發(fā)育[4]。在孕6～8周，MMP-2是滋養(yǎng)細(xì)胞侵入作用的主要蛋白酶，在孕9～12周，MMP-2及MMP-9同時對滋養(yǎng)細(xì)胞侵入起作用。在早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵入和子宮螺旋動脈重塑過程中，這些蛋白酶水解蛻膜基質(zhì)及基底膜，為胚胎絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕消除物理屏障[1]。同時研究表明，MMP-2、TIMP-1及TIMP-2對血管建立有重要作用，胚胎停育組織的絨毛和蛻膜中TIMP-1表達(dá)明顯下降，母胎界面不能形成正常妊娠需要的低阻力血管，使滋養(yǎng)層功能不良，胚胎缺乏血氧供應(yīng)，同時MMP-2及MMP-9表達(dá)上調(diào)，造成滋養(yǎng)細(xì)胞異常侵入，導(dǎo)致胚胎停育[5-6]。

2. E-鈣粘連蛋白(E-Cadherin，E-cad)是一種鈣依賴黏附分子，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞，主要功能介導(dǎo)特定組織和器官同型細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的完整性和極性[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，E-cad參與胚胎正常發(fā)育、組織形成和滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕活動，妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞表面均有E-cad的黏附與表達(dá)，這樣有利于胚泡的黏附與植入[8-9]。E-cad水平表達(dá)的高低可以有效反映滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤能力。有研究用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在胚胎停育蛻膜組織中E-cad在mRNA水平表達(dá)增加，子宮內(nèi)膜從增殖期到分泌期過渡時，子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞表達(dá)E-cad水平逐漸增加，而分泌期過渡到蛻膜期，E-cad表達(dá)水平則下降[8]。當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞需要進(jìn)一步與子宮內(nèi)膜相容時，上皮細(xì)胞表達(dá)的E-cad降低，使子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞相互粘附力降低，有利于滋養(yǎng)細(xì)胞入侵。研究證實(shí)，在胚胎停育患者的絨毛組織中E-cad的高表達(dá)，影響滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜的兼容性，無法形成胚胎正常發(fā)育的微環(huán)境，同時阻礙絨毛血管的重鑄，造成胎盤淺著床，從而導(dǎo)致胚胎停育的發(fā)生。有國外學(xué)者提出，E-cad的正常表達(dá)受SLIT/Roundout(Robot)信號的調(diào)節(jié)[10]，同時SLIT2/Roundout1(Robot)的單鏈化可能引導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移及浸潤。隨著妊娠的進(jìn)展，E-cad在各絨毛部位表達(dá)有所下降，這有助于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入，保證滋養(yǎng)細(xì)胞層的正常生理功能，維持胚胎的正常發(fā)育。

二、胎盤及絨毛血管生成

胚胎及胎兒的生長發(fā)育與胎盤絨毛血管發(fā)育關(guān)系密切，而胎盤絨毛血管的形成過程實(shí)際上就是血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長發(fā)育過程，本文總結(jié)了以下兩個熱門研究的分子標(biāo)記物。

1. miR-126(MicroRNA-126)基因組:miR-126(MicroRNA-126)基因組定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(epidermal growth factor-likedomain7,EGFL7)基因的第七個內(nèi)含子中，EGFL7本身就是血管內(nèi)皮特異性表達(dá)的基因，因而兩者共同對血管的形成、發(fā)育及功能起調(diào)控作用[11]。Sehmid等研究將小鼠的EGFL7基因敲除后部分胚胎死于血管發(fā)育異常及異常的胚胎干細(xì)胞聚集[12]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是miR-126的預(yù)測靶基因之一，miR-126與VEGF在胚胎正常發(fā)生、發(fā)展過程中起正向調(diào)節(jié)作用，miR-126在正常妊娠時可以通過抑制Spred1基因，提高內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF和成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的敏感性，參與胚胎血管的新生并維持血管的完整性[13]。在針對研究 miR-126 在肺癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，上調(diào) miR-126 可以明顯抑制 VEGF 的表達(dá)，對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起抑制作用。國內(nèi)學(xué)者針對 miR-126 與 VEGF 的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)兩者在胚胎停育組中呈負(fù)相關(guān)，提示 miR-126 與 VEGF 在胚胎停育的發(fā)生、發(fā)展中有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，miR-126可能直接抑制VEGF基因的表達(dá)，從而使胚胎血管發(fā)育減少或功能異常[13]。

2. VEGF是一類具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，是血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子[14]，形態(tài)學(xué)分析提出VEGF的表達(dá)區(qū)域正是絨毛血管形成區(qū)域，它操控了胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的完整建立。其中VEGFR屬于酪氨酸激酶受體，分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，有VEGFR1及VEGFR2及VEGFR3三個受體，其中VEGFR2發(fā)揮主要作用，學(xué)者們對VEGF的深入研究后發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)下降會削弱內(nèi)皮細(xì)胞侵襲、遷移及增殖功能，使血管通透性相關(guān)活性因子表達(dá)下降，導(dǎo)致絨毛及蛻膜血管生成減少，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞植入過淺，胎盤血管網(wǎng)路建立不完善，影響母胎間血流供應(yīng)及物質(zhì)交換，最終導(dǎo)致胚胎停育的發(fā)生[13]。國外學(xué)者對母體螺旋動脈重塑及滋養(yǎng)細(xì)胞侵入的過程研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子α(hypoxia inducible factor-1，HIF1)/VEGF與絨毛血管生成之間存在正相關(guān)關(guān)系，HIF1α/VEGF在調(diào)節(jié)絨毛血管生成有重要作用[15]，已知HIF1調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)，穩(wěn)定的HIF1與細(xì)胞核結(jié)合，并與多個靶基因(比如VEGF)的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，參與調(diào)節(jié)血管生成。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)人滋養(yǎng)細(xì)胞中HIF1信號的丟失與流產(chǎn)有關(guān)[15]。本文推測胎盤血管的發(fā)育可能是通過激活HIF1α信號通路及其靶點(diǎn)VEGF來實(shí)現(xiàn)。

三、滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡

1. 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)是一類蛋白酶家族。Caspase家族在細(xì)胞凋亡途徑中起主要作用，是啟動和執(zhí)行細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的凋亡蛋白[16]。起細(xì)胞凋亡執(zhí)行者作用的是caspase3,6,7。研究證實(shí)，正常妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象，而滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與凋亡處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)。針對胚胎停育的絨毛和蛻膜組織研究發(fā)現(xiàn)，胚胎停育組織中Caspase-3 RNA和蛋白表達(dá)較對照組顯著升高，提示胚胎停育的發(fā)生機(jī)制可能是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡比例失衡[17]。Caspase-3 RNA和蛋白在胚胎停育組織的高表達(dá)，可能啟動了線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞滋養(yǎng)層和胎盤滋養(yǎng)層中的細(xì)胞凋亡比例增高，大量凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞使滋養(yǎng)細(xì)胞層正常功能受損，阻礙胚胎正常生長發(fā)育，造成胚胎停育[18]。

2. 研究發(fā)現(xiàn)大量的微RNA(MicroRNA)對胎盤的發(fā)育和功能起著重要作用[19]。據(jù)報道，正常妊娠有一定程度的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，是一種正常的生理現(xiàn)象，這有利于絨毛和絨毛分支的形成與發(fā)育，然而當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡時，會導(dǎo)致絨毛發(fā)育不良或者滋養(yǎng)細(xì)胞變性[20]，高水平的凋亡可能是導(dǎo)致胚胎停育的主要原因[21-22]。實(shí)驗證明，在miR-575的模擬實(shí)驗組中，p53基因表達(dá)上調(diào)，當(dāng)用miR-575抑制劑轉(zhuǎn)染實(shí)驗組人絨毛膜癌細(xì)胞后，p53基因的表達(dá)明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示miR-575可能通過調(diào)節(jié)絨毛細(xì)胞凋亡維持胚胎的正常發(fā)育。同時實(shí)驗進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-575抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)蛋白的表達(dá)也顯著降低，進(jìn)一步表明miR-575在絨毛細(xì)胞中的凋亡作用[23]。成功的妊娠不僅取決于細(xì)胞的凋亡，還取決于足夠的絨毛血管生成，能夠為胚胎提供足夠的氧氣和營養(yǎng)[24]。有學(xué)者研究miR-575與絨毛血管生成的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-575的過度表達(dá)顯著降低了VEGF和人類血管生成素-2(Human Angiopoietin 2，Ang-2)的表達(dá)，用miR-575抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組，VEGF/Ang-2的表達(dá)水平明顯升高，表明了miR-575在絨毛血管中也起到了調(diào)節(jié)作用[19]。因此，我們總結(jié)miR-575不僅可以作為胚胎停育的生物標(biāo)記物，也可以作為未來預(yù)防性治療胚胎停育的潛在分子靶點(diǎn)。

四、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

TIPE是腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8[25-29]家族中的一員，是一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子[25]，其中TIPE2是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制劑，在炎癥和免疫維持中表現(xiàn)出負(fù)調(diào)節(jié)作用[30]。Sun的Westernblot實(shí)驗結(jié)果表明TIPE2陽性染色主要存在于蛻膜腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、蛻膜血管的內(nèi)皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞中，而且TIPE2蛋白在流產(chǎn)及胚胎停育患者的蛻膜組織中表達(dá)明顯下調(diào)[25]，有學(xué)者進(jìn)一步分析TIPE2與免疫因子TNF-α、IL-10的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TIPE2與IL-10的表達(dá)成正相關(guān)，TIPE2可以通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞的有絲分裂來抑制炎癥細(xì)胞的活化。對于妊娠這一生理過程來說，巨噬細(xì)胞M2極化也是人類早期妊娠成功的重要因素[31]。有報道提出，TIPE2蛋白通過激活PI3K-AKT信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2的分化[32]，從而維持妊娠。所以TIPE2在維持母胎免疫耐受性方面起著重要作用，在母胎免疫耐受的機(jī)制中，可以下調(diào)促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)及炎癥細(xì)胞的有絲分裂，降低母體免疫系統(tǒng)對胎兒的過度免疫識別及應(yīng)答，從而保證胚胎的良好發(fā)育。同時有學(xué)者提出，TIPE2可以抑制各種癌細(xì)胞的侵襲[33]，早期胚胎的著床和胎盤的形成建立在滋養(yǎng)細(xì)胞成功侵入母體子宮內(nèi)膜的基礎(chǔ)之上，一旦滋養(yǎng)細(xì)胞侵入過強(qiáng)，導(dǎo)致蛻膜組織中的膠原過度水解，使蛻膜組織壞死脫落，從而導(dǎo)致胚胎停育的發(fā)生。TIPE2在這一過程中可以抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的過度侵襲，維持蛻膜組織的正常形態(tài)和生理功能，從而維持胚胎正常發(fā)育，但滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲具有局限性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究驗證。

五、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化

妊娠是一個非常復(fù)雜卻又精細(xì)的生理過程，卵子被排出后，增殖期的子宮內(nèi)膜在雌孕激素的共同作用下轉(zhuǎn)化為分泌期子宮內(nèi)膜，這就是蛻膜化的過程。這是胚胎植入與正常發(fā)育的基礎(chǔ)條件。蛻膜化是一個需要多種細(xì)胞因子、激素及免疫細(xì)胞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子共同參與的過程[34]。

1. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是誘導(dǎo)骨生長的重要因子，研究發(fā)現(xiàn)黃體來源的黃體酮(P4)可能通過Ihh-Nr2f2-Bmp2信號軸作用于Bmp2的下游因子Wnt4進(jìn)而激活Wnt信號通路來調(diào)控蛻膜化的過程。泌乳素(prolactin,PRL)是子宮內(nèi)膜蛻膜化的公認(rèn)標(biāo)記分子，P4可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分泌PRL，PRL可以正向促進(jìn)黃體酮及其受體表達(dá)，加強(qiáng)上述信號通路作用。實(shí)驗證明Bmp2在正常早孕蛻膜組織表達(dá)強(qiáng)陽性，在胚胎停育蛻膜組織中表達(dá)弱陽性及陰性，正常早孕蛻膜細(xì)胞的PRL表達(dá)明顯高于胚胎停育組織。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜蛻膜化的孕激素信號中Bmp2是重要的調(diào)控因子，條件敲除雌鼠Bmp2基因，雌鼠會因蛻膜化失敗而導(dǎo)致不孕，人Bmp2重組蛋白可以顯著增強(qiáng)體外誘導(dǎo)蛻膜化反應(yīng)[35]。因此推測Bmp2可作為子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)中重要的調(diào)控因子。

2. 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(Insulin like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)作為子宮內(nèi)膜蛻膜化的重要參與者，可與胰島素樣生長因子、胰島素、卵巢激素、細(xì)胞因子等共同參與調(diào)控胚胎種植和胎兒生長。蛻膜化IGFBP-1濃度過高造成子宮內(nèi)膜容受性下降，胚胎種植障礙進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生，IGFBP-1表達(dá)降低還與胎盤形成不良有關(guān)[36]。

綜上所述，胚胎的正常發(fā)育是一個復(fù)雜而精密的過程。子宮內(nèi)膜正常蛻膜化，滋養(yǎng)細(xì)胞的絨毛及蛻膜血管網(wǎng)絡(luò)的建立，母胎免疫機(jī)制等這些過程都是胚胎正常發(fā)育必須經(jīng)歷的環(huán)節(jié)。在這個過程中，每一個環(huán)節(jié)都不是孤立的，眾多分子水平標(biāo)記物將一個個環(huán)節(jié)緊密銜接起來，協(xié)同完成一個完整的妊娠過程。本文總結(jié)了上述目前作為研究重點(diǎn)的分子標(biāo)記物，希望為胚胎停育發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供幫助和思路。