關茗巖，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨外科，哈爾濱 150081)

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNI)的影響人群較廣泛，其中發(fā)展中國家患者的占比較高，且人數(shù)逐漸增多[1-3]，除可直接導致與傷害相關的功能和心理后果外，PNI還與全球社會經(jīng)濟和成本相關[4]。PNI的原因主要包括事故、穿透傷、摔傷、缺血、感染、骨折后鄰近神經(jīng)損傷、醫(yī)源性損傷等[5]。

目前PNI的治療方法多樣，如在外科手術中行神經(jīng)外膜縫合，但術后神經(jīng)功能恢復情況受到炎癥、感染、手術縫線、瘢痕等的影響，修復效果不能令人滿意[6]；自體不帶血管神經(jīng)移植對于成段的神經(jīng)缺損效果最好，但可導致供體神經(jīng)功能缺失，故來源有限、無法滿足臨床需求；此外，中醫(yī)中藥起效慢，長期服用具有肝、腎毒性，缺少更多循證醫(yī)學證據(jù)。為了解決上述難題，依據(jù)不同類型干細胞的特征研究PNI與修復的機制發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)因子在PNI與其修復機制中發(fā)揮重要作用，特別是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[7]?，F(xiàn)就BDNF轉染干細胞治療PNI的研究進展予以綜述。

1 PNI及修復機制

PNI后導致?lián)p傷平面軸突和髓鞘破壞，神經(jīng)支配的靶器官與軸突之間發(fā)生斷裂，軸漿運輸中斷，受損神經(jīng)短時間內自近端向遠端發(fā)生變性，神經(jīng)元細胞形態(tài)發(fā)生改變，這一系列反應稱為沃勒變性(Wallerian degeneration)，可導致運動終板乙酰膽堿酯酶活性下降。沃勒變性會引起血液-神經(jīng)屏障通透化[8]，并通過對組織損傷敏感的受體激活附近的施萬細胞和巨噬細胞，施萬細胞通過脫落髓鞘、增殖、吞噬碎屑、釋放募集血液中的單核細胞/巨噬細胞的細胞因子對損傷做出反應[9]。隨后，施萬細胞沿神經(jīng)內膜鞘增生，通過與多種細胞外基質相互作用穩(wěn)定髓鞘的正常狀態(tài)，并可分泌細胞因子(血管內皮生長因子、肝細胞生長因子、BDNF等)，其中BDNF可調節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和功能的幾乎所有方面，包括誘導、增殖及分化[7]，升高的BDNF水平通過促分裂原活化的蛋白激酶信號轉導通路修復退化的神經(jīng)元、增強神經(jīng)元活動、促進軸突生長[10]。此外，施萬細胞還通過Ca2+/鈣調神經(jīng)磷酸酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等信號通路參與PNI的早期修復[11-12]。

2 BDNF的應用研究

神經(jīng)營養(yǎng)蛋白首次由Brade等[13]通過純化豬腦發(fā)現(xiàn)，該蛋白質具有營養(yǎng)作用，可促進神經(jīng)元發(fā)育，且分布廣泛，對于調節(jié)神經(jīng)增殖、分化、成熟和可塑性等過程至關重要，可影響細胞的生命和死亡途徑之間的轉換，其中BDNF在大腦特別是海馬組織中呈高表達，幾乎可調節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和功能的所有方面[14-15]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，BDNF在腦認知功能(如記憶、學習、行為和情緒控制)中起重要作用[16]，BDNF還可通過Ras-促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B以及磷脂酶Cγ、Ca2+等[7]信號轉導通路發(fā)揮多種不可或缺的作用，如保護神經(jīng)細胞、促進神經(jīng)元的存活和發(fā)育繁殖、防止神經(jīng)元受損死亡，維持海馬內突觸可塑性和促進突觸再生，同時上述信號轉導通路還影響患者認知功能，而認知功能是獲取和鞏固記憶的基礎，表明BDNF高水平表達與言語記憶和識別能力相關，并可能抵消慢性壓力和認知能力下降的影響。此外，BDNF還作用于阿爾茨海默病中耗竭的膽堿能神經(jīng)元[17]、帕金森病中丟失的黑質多巴胺能神經(jīng)元[18]，而高水平BDNF產生的抗抑郁藥能夠產生更好的神經(jīng)塑性結果[19]，起到延緩疾病進展的作用。因此，老年人BDNF水平降低可能導致記憶力減退、神經(jīng)退行性變以及其他認知障礙[20]。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，微RNA-1與BDNF的3′非翻譯區(qū)靶向位點結合，抑制BDNF信使RNA的降解和翻譯，培養(yǎng)的施萬細胞中微RNA-1的過表達或沉默分別抑制或增強了細胞的BDNF分泌，并分別抑制或促進施萬細胞的增殖和遷移[21]。BDNF通過結合軸突上原肌球蛋白受體激酶B受體增強神經(jīng)突伸長，若BDNF再生軸突的可用性減弱，則軸突再生將受到嚴重損害[22]。Fornaro等[23]使用兩個背根神經(jīng)節(jié)外植體和背根神經(jīng)節(jié)衍生的原代細胞制作分離培養(yǎng)物的體外模型，研究BDNF對神經(jīng)突生長的影響，定量數(shù)據(jù)表明，BDNF可刺激感覺纖維的曲折生長和細胞簇的形成，促使軸突向周圍靶標分布，上述發(fā)現(xiàn)對于BDNF在周圍神經(jīng)再生中的臨床應用具有重要意義。Scheper等[24]在人骨髓中分離人間充質干細胞，通過轉導和基因表達分析將人間充質干細胞分化為過量表達BDNF的軟骨細胞，從而增加體外神經(jīng)元的存活率，證實BDNF過表達后人間充質干細胞可進一步對神經(jīng)產生保護作用。綜上所述，BDNF在中樞及外周神經(jīng)均可直接、間接(轉染、誘導等)促進軸突再生，是修復損傷神經(jīng)的重要元素。

3 BDNF轉染干細胞后的治療

干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，根據(jù)所處發(fā)育階段不同可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細胞。從胚胎分離的干細胞稱為ESCs，從成人分離的干細胞稱為成體干細胞[25]。根據(jù)干細胞發(fā)育能力的不同又可分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是經(jīng)細胞核重新編程為胚胎樣多能狀態(tài)的成體細胞，可通過將體細胞核轉移到卵母細胞中[26]，或通過多能轉錄因子[27]誘導。

3.1ESCs ESCs來源于發(fā)育中的胚泡的內部細胞團，通過體外或體內形成胚狀體來評估，其可在體外維持較長的時間，且不會失去自我更新或發(fā)育潛能，產生代表內胚層、中胚層和外胚層的細胞類型，用于PNI修復的治療。Cui等[28]證實，經(jīng)ESCs誘導施萬細胞移植入大鼠坐骨神經(jīng)后會出現(xiàn)大量的軸突再生和神經(jīng)修復。另有研究表明，基因修飾后的人ESCs過表達成纖維細胞生長因子-2，有助于強化脊髓損傷后神經(jīng)元的保護作用，并促進BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，表明ESCs可能通過過表達BDNF保護運動神經(jīng)元，保持突觸覆蓋并降低星形膠質細胞反應性[29]。有實驗證明，BDNF和綠色熒光蛋白轉染后的ESCs可使神經(jīng)元數(shù)量增加，且適用于各種神經(jīng)病理學條件下BDNF細胞移植改善作用的研究[30]。但是，ESCs源自體外受精的人類胚胎，存在倫理問題，具有致畸胎瘤的潛在風險。目前已成功通過電穿孔法使ESCs過表達BDNF[31]，但后續(xù)對周圍神經(jīng)的修復暫無相關報道。

3.2成體干細胞

3.2.1骨髓來源干細胞 間充質干細胞是中胚層來源的成體干細胞，具有高度的自我更新、多向分化潛能，且來源豐富，可從骨髓、脂肪組織、臍帶、羊水、肌腱、胚胎絨毛膜、乳牙和胎兒的肝臟等組織分離出來。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有可塑性的多能干細胞，可被誘導分化為多種細胞譜系，包括成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞等，易于分離，移植排斥率低。實驗表明，用慢病毒轉染BDNF的BMSCs可在體外分化為神經(jīng)樣細胞，這與原肌球蛋白受體激酶B受體結合的表達有關，促進未分化人間充質干細胞發(fā)育為成熟神經(jīng)元，以治療神經(jīng)元疾病[32-33]。Li等[34]通過腺病毒方法轉染BMSCs并聯(lián)合促紅細胞生成素促進軸突生長，修復脊髓損傷后大鼠神經(jīng)，改善其后肢運動功能。同理，采用腺病毒方法使BMSCs過表達BDNF，并在功能化的自組裝肽水凝膠中誘導神經(jīng)元樣細胞治療脊髓損傷后神經(jīng)修復的效果較好[35]。將過表達BDNF和神經(jīng)膠質細胞系神經(jīng)營養(yǎng)因子的BMSCs作為種子細胞引入高度定向的聚(L-乳酸)/大豆分離蛋白納米纖維神經(jīng)導管的方法，大幅度提高了神經(jīng)修復的效率[36]。

3.2.2脂肪來源干細胞 近年來，脂肪組織已能夠作為分化為中胚層細胞譜系的基質細胞的替代來源，脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是具有類似于BMSCs的表型和基因表達譜的多能干細胞，具有神經(jīng)營養(yǎng)特性，能夠分化為多種細胞譜系。國內研究已實現(xiàn)BDNF過表達慢病毒載體，并建立了穩(wěn)定表達的ADSCs株[37]。也有研究表明，ADSCs和施萬細胞共培養(yǎng)后，ADSCs表現(xiàn)出典型的紡錘形S-100標記細胞——施萬細胞的特征，使用慢病毒轉染方法使ADSCs過表達BDNF，并通過對鼠損傷的坐骨神經(jīng)的電生理、步態(tài)分析獲得坐骨神經(jīng)恢復指數(shù)等證明ADSCs具有促進神經(jīng)髓鞘再生、改善運動和神經(jīng)的功能[38]。Schweizer等[39]將ADSCs移植到嚙齒動物坐骨神經(jīng)損傷模型中，證實ADSCs對神經(jīng)再生有良好的影響，另外，BDNF聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3通過慢病毒法共轉染大鼠ADSCs后可成功向施萬細胞方向誘導，對維持神經(jīng)元存活和促進神經(jīng)元分化有促進作用,也驗證了雙因子比單一營養(yǎng)因子更具有優(yōu)越性，為組織工程技術治療脊髓損傷的未來實驗提供了堅實的理論基礎[40]。

3.2.3臍帶來源干細胞 臍帶是在母體和胎兒之間運輸營養(yǎng)物質的樞紐，含有大量的間充質干細胞即人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，胎兒出生后的臍帶來源豐富，不會出現(xiàn)倫理問題，具有促血管生成、抗炎、神經(jīng)修復、免疫調節(jié)功能及非致瘤性[41-44]。hUCMSCs可通過分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子并沉積細胞外基質蛋白來調節(jié)施萬細胞并促進神經(jīng)軸突生長，其中旁分泌機制參與了hUCMSCs的細胞療法，在PNI治療中起重要作用。另有實驗表明，腺病毒載體介導的BDNF向hUCMSCs的離體基因轉移，修飾后的hUCMSCs存活時間較長，可維持神經(jīng)分化，促進擠壓傷大鼠坐骨神經(jīng)軸突再生和功能恢復，且效果優(yōu)于未轉染組，可以用于缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)功能的恢復，但需要進一步評估神經(jīng)再生的根本機制及長期治療效果[45-46]。

3.2.4神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs) NSCs是一種神經(jīng)組織特異性的前體細胞，存在于腦和脊髓神經(jīng)系統(tǒng)中，具有多向分化的潛能和自我更新能力，在不同微環(huán)境中可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞、少突膠質細胞。國內研究表明，BDNF通過非脂質體法基因修飾大鼠胚胎NSCs后進行體外誘導分化，基因轉染48 h后顯示，NSCs形成了雙極神經(jīng)元樣細胞，誘導7 d后獲得巢蛋白陽性、βⅢ-微管蛋白陽性的NSCs比例明顯高于單一NSCs組、外加BDNF誘導組，反轉錄聚合酶鏈反應檢測BDNF基因表達的增強，證明了NSCs具有體外分泌BDNF的能力，促進了NSCs定向分化為神經(jīng)元及突觸的發(fā)生[47]。另有研究表明，大鼠全腦輻照4周后，將慢病毒載體基因修飾的神經(jīng)干細胞移植入腦組織海馬中4周，高比例膠質纖維酸性蛋白陽性的星形膠質細胞廣泛分布于海馬內，說明移植海馬內過表達BDNF的NSCs在輻射所引起惡劣的海馬環(huán)境中具有整合優(yōu)勢[48]。Kwon等[49]和Moro等[50]應用腺病毒、慢病毒載體介導BDNF修飾NSCs，能夠防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元萎縮，并促進再生相關基因表達。此外，神經(jīng)生長因子+BDNF+堿性成纖維細胞生長因子的聯(lián)合使用可顯著提高NSCs增殖和分化能力，大幅提高了NSCs治療效果[51]?？梢娡ㄟ^BDNF修飾NSCs用于修復神經(jīng)效果佳，基因療法對于治療中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了臨床思路。

3.2.5肌源干細胞(muscle-derived stem cells，MDSCs) MDSCs是從骨骼肌中分離出的細胞群體，具有成肌、成脂肪、成軟骨和成骨等多向分化能力，并有很強的自我更新能力，在長時間連續(xù)傳代60代仍保持表型不變。MDSCs來源廣泛，代表衛(wèi)星細胞的前身，具有更高的再生能力和細胞存活率，是近年理想的種子細胞。MDSCs在體外可被誘導分化成施萬細胞[52]，其與BDNF共培養(yǎng)誘導后[53]神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，相關分析表明，BDNF水平與神經(jīng)元損傷之間存在顯著的相關性，有助于MDSCs發(fā)揮作用，體內植入MDSCs后，受損神經(jīng)區(qū)域的軸突再生，神經(jīng)元的凋亡減弱，抗氧化劑的表達以及B細胞淋巴瘤/白血病-2和B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白的比例上調，BDNF還可促進MDSCs向神經(jīng)元樣細胞的轉化，從而替代受損神經(jīng)，治療PNI效果佳。此外，采用脂質體法將SMDF基因轉染小鼠MDSCs后與施萬細胞共培養(yǎng)誘導分化，被誘導成施萬樣細胞的陽性率約為89%，明顯高于直接誘導的陽性率63%，證實轉染可提高誘導效率[54]。目前，BDNF轉染MDSCs后誘導神經(jīng)元樣細胞用于坐骨神經(jīng)損傷修復的研究正在進行中。

3.3iPSC iPSC是指通過不同基因直接導入成體干細胞，并將分化后細胞的細胞核重新編程到未分化狀態(tài)，最終獲得類似ESCs的多能干細胞。iPSC誘導是一種利用轉錄因子重新編程體細胞的機制[55-56]。iPSC可分化為內胚層、中胚層和外胚層三個胚層型，NSCs[57]可誘導干細胞中的神經(jīng)分化，并具有修復神經(jīng)系統(tǒng)的潛力，BDNF通過激活Wnt/β聯(lián)蛋白和胞外信號調節(jié)激酶5信號通路，促進iPSC衍生的NSCs的生長，并分化成疾病特異性的細胞類型，有助于治療神經(jīng)元疾病。研究顯示，選用腺病毒法將BDNF基因修飾的真皮多能干細胞移植入脊髓損傷局部，鏡下可見大量BDNF陽性細胞，3 d后過表達BDNF的iPSC組凋亡率低于單純BDNF組，根據(jù)BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)運動量表神經(jīng)行為學評分法，大鼠神經(jīng)功能恢復效果明顯優(yōu)于單純BDNF組，能夠更大程度地改善神經(jīng)損傷修復[58]。但是，iPSC具有潛在的致瘤性，包括致畸胎瘤性和致癌性，因此有必要進行更加高效、穩(wěn)定的重編程方案[59]。目前產生iPSc的源細胞、基因修飾方法及相關機制正在不斷更新，其在基因修飾層面能否對神經(jīng)產生更好的效果暫無相關研究。

4 小 結

隨著組織工程技術蓬勃發(fā)展，從全能干細胞ESCs到重新編程的iPSC，經(jīng)BDNF修飾的細胞大部分均已應用于周圍神經(jīng)再生和修復，目前BDNF轉染肌源干細胞治療神經(jīng)再生和修復的研究正在進行中。近年PNI修復的研究取得了很大進步，但基因修飾后干細胞修復神經(jīng)的機制尚不明確，相關研究仍處于臨床前研究階段，且面臨一些熱點問題，如基因修飾后細胞的變異、應用安全性、基因表達的不穩(wěn)定性、細胞致瘤性等，隨著對基因修飾干細胞研究及科研水平的提高，基因修飾后干細胞移植應用于PNI修復將有廣闊的前景。