徐嘉欣，武雪寧，王顯赫，徐梧皓，高鑫譽(yù)，鄭亮，2，吳志軍，2，3，張華，2，3，曹宏偉，2，3

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染仔豬引起的一種急性接觸性腸道傳染性疾病[1]。臨床上主要表現(xiàn)為豬的腹瀉、嘔吐、脫水、體重減輕等[2-3]。各個年齡階段的豬均易感染PEDV，不同年齡階段的豬感染時發(fā)病程度各不相同，其中以仔豬的發(fā)病情況最為嚴(yán)重，死亡率高達(dá)100%[4-5]。PED首次在英國爆發(fā)，隨后在歐洲、亞洲等國家相繼出現(xiàn)，2010年10月，PED在南方的多個省份暴發(fā)后，中國才開始出現(xiàn)大規(guī)模的流行，并迅速席卷全國[6-7]。新生仔豬因PED導(dǎo)致的死亡率飆升至80%~100%，使得養(yǎng)豬業(yè)遭受到毀滅性的打擊，給全球經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV是單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb[8-9]。PEDV基因組包括5'和3'非翻譯區(qū)，3'端含有poly（A）尾。其基因組編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（纖突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N）以及16個非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1-Nsp16（nonstructural protein）和輔助蛋白ORF3[10-11]。

病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，主要通過宿主來完成自我復(fù)制及釋放病毒顆粒[12]。研究表明，病毒能夠利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜促進(jìn)病毒蛋白的合成，導(dǎo)致宿主中錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，進(jìn)而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)[13]。許多RNA病毒已經(jīng)能夠通過改變宿主的膜室重排現(xiàn)象，如脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）和柯薩奇病毒B3（CVB3）感染細(xì)胞所產(chǎn)生的囊泡簇來自于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)[14]；在PEDV感染細(xì)胞時，也可出現(xiàn)囊泡現(xiàn)象，但是有關(guān)囊泡是否與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的機(jī)制研究還未被報道。

Nsp6是PEDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，屬于膜蛋白，包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域[15]，目前對于nsp6蛋白的功能介紹并不全面。根據(jù)已有研究表明，Nsp6可以通過PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)病毒復(fù)制[16]，雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）的Nsp6與其類似，也可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬體的形成，并對病毒復(fù)制也有影響[17]。

RNA病毒利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的功能進(jìn)行自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在病毒復(fù)制的過程中，病毒蛋白迅速聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的破壞和消耗，錯誤折疊的蛋白和未折疊的蛋白聚積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹等現(xiàn)象，破話內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為了延緩此現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以延緩和減少蛋白合成額載量和蛋白的聚積[19]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要是在機(jī)體受到外界環(huán)境刺激時，蛋白質(zhì)在合成、加工、修飾、轉(zhuǎn)運的過程中，導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中過度積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[18-19]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，含有大量可溶性分子伴侶和折疊酶，GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中首個被發(fā)現(xiàn)的分子伴侶。GRP78通過其多肽結(jié)合域和ATP酶功能域之間協(xié)同作用，輔助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽形成正確構(gòu)象，因此GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白合成質(zhì)控（Quality control）過程中發(fā)揮重要作用[19-21]。研究通過構(gòu)建PEDV Nsp6真核表達(dá)載體，鑒定其表達(dá)和亞細(xì)胞定位，利用間接免疫熒光方法觀察到Nsp6可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜關(guān)鍵蛋白PDI共定位，并激活GRP78表達(dá)上調(diào)。研究有利于豐富PEDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中Nsp6的結(jié)構(gòu)和功能以及為PEDV與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間復(fù)雜關(guān)系提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

豬腎細(xì)胞（PK15）、宮頸癌細(xì)胞（Hela）由實驗室保存；豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）由浙江大學(xué)黃耀偉教授饋贈。細(xì)胞用Gibco生物公司DMEM培養(yǎng)基，加入10%的胎牛血清（FBS）、100μg·mL-1青霉素和鏈霉素，在37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pCMV-Myc、pEGFP-N1質(zhì)粒由實驗室保存；PRK5-Nsp6由浙江大學(xué)黃耀偉教授饋贈。pEGFPN1-Nsp6為實驗室構(gòu)建，驗證表達(dá)并保存。DH5α感受態(tài)購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑和抗體

轉(zhuǎn)染試劑LippfectamineTM2000（11668019）購自Invitrogen公司；小鼠抗GFP標(biāo)簽單克隆抗體（ab1218）購自Abmart公司；鼠抗Myc單克隆抗體（TA-01）、兔抗β-actin單克隆抗體（ZM-0001）、山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記IgG（ZB-2305）、山羊抗兔辣根酶標(biāo)記IgG（ZB-2301）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗GRP78抗體（AF-0171）購自碧云天生物技術(shù)公司；質(zhì)粒小提試劑盒（D6943-02）和膠回收試劑盒（D2500-02）購自O(shè)mega公司；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑Thapsigargin（T9033）購自Sigma公司；2×Seamless Cloning Mix（CL117）購自Biomed公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體

根據(jù)GenBank網(wǎng)站中nsp6基因序列號為KU558701.1，設(shè)計nsp6基因特異性引物序列，上游引物序列：TCGAGCTCAAGCTTCGAATTCAGTGGTTATGTTTCACGCGC（EcoR I），下游引物序列：CATGGTGGCGACCGGTGGATCCCTGAACGGAAGAA ATCTTAA（BamH I）。將nsp6基因按照無縫克隆方法插入pEGFP-N1載體片段中，構(gòu)建pEGFP-N1-Nsp6真核表達(dá)載體。

首先，PCR擴(kuò)增nsp6基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再將PCR產(chǎn)物與EcoR I和BamH I雙酶切后的pEGFP-N1載體片段進(jìn)行連接，其體系為：PCR產(chǎn)物50 ng，pEGFP-N1載體片段100 ng，2×Seamless Cloning Mix 5μL，補(bǔ)水至總體積10μL。輕輕混合后，瞬時離心，放置于PCR儀上50℃保溫15 min。最后，產(chǎn)物用DH5α感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布平板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。挑取單菌落，并提取質(zhì)粒。將所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，選取酶切正確的質(zhì)粒送至吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序正確的載體將其命名為pEGFP-N1-Nsp6，保存于-20℃。

1.2.2 Western blot檢測

將Hela細(xì)胞均勻鋪在24孔板中，待細(xì)胞密度長到80%左右時，用Lipofectin2000將pEGFP-N1-Nsp6或PRK5-Nsp6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，6 h后更換含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收取蛋白樣品。收樣：首先，用RAPI裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min，其次，加入5×Loading Buffer并按體積稀釋至總濃度為1×Loading Buffer，最后用沸水將蛋白樣品煮10 min，12 000×g離心10 min。跑膠：首配置10%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，組裝電泳槽，倒入1×SDS電泳液，插上電極，分離蛋白樣品，80 V，20 min，120 V，1.5 h；轉(zhuǎn)膜：將膠板撬開，按照條帶大小對應(yīng)切下膠條，組裝轉(zhuǎn)膜裝置，用PVDF膜吸附蛋白，冰水混合物中轉(zhuǎn)膜150 min。封閉：配置0.5%脫脂奶粉，將PVDF膜放入奶粉中，搖床上封閉2 h，結(jié)束后，用1×TBST溶液洗膜3次，每次5 min。孵育抗體：按照說明書配置一抗和二抗，一抗孵育2 h，1×TBST溶液洗膜8次，每次15 min；二抗孵育2 h，1×TBST溶液洗膜8次，每次15 min。曝光：用AI600儀器曝光，保存結(jié)果圖片。

1.2.3 間接免疫熒光

細(xì)胞傳代爬片，待細(xì)胞密度長到60%左右時，用Lipofectin2000將pEGFP-N1-Nsp6或PRK5-Nsp6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min；PBS洗3次，每次5 min，加入0.1%Triton X-100，室溫透膜20 min，PBS洗3次，加入5%BSA封閉2 h，加入一抗孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，加入熒光素標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育2 h，PBS洗3次。最后取干凈的載玻片，滴少量封片劑，用針頭挑出爬片，將有細(xì)胞的一面放在封片劑上，用紙巾輕輕將多余的液體，壓緊，再將指甲油均勻涂抹在爬片周圍，阻止細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞中，避光晾干，待片子干燥后用熒光顯微鏡觀察拍照，并保存圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建pEGFP-N1-Nsp6真核表達(dá)載體及雙酶切鑒定

利用無縫克隆法PCR擴(kuò)增大小為840 bp的nsp6基因序列，并將PCR產(chǎn)物連接到于pEGFP-N1載體中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nsp6，通過菌液PCR和雙酶切對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定（如圖1）結(jié)果顯示，pEGFP-N1-Nsp6真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 菌液PCR鑒定結(jié)果 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pEGFP-N1-nsp6 using PCR and double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pEGFP-N1-nsp6

2.2 Western blot鑒定Nsp6蛋白表達(dá)

為驗證Nsp6蛋白表達(dá)是否正確，研究將pEGFPN1-Nsp6轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，24 h后裂解細(xì)胞，用GFP標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，在55 KDa附近有條帶（如圖2），大小與預(yù)期符合，表明pEGFP-N1-Nsp6蛋白表達(dá)成功。

圖2 pEGFP-N1-Nsp6蛋白表達(dá)鑒定Fig.2 pEGFP-N1-Nsp6 protein expression identification

2.3 間接免疫熒光鑒定Nsp6細(xì)胞定位

為確定Nsp6蛋白在細(xì)胞中的定位，研究將PRK5-Nsp6轉(zhuǎn)染于Hela細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，通過熒光顯微鏡觀察Nsp6蛋白分布情況。結(jié)果顯示，（如圖3），Nsp6蛋白大部分定位細(xì)胞質(zhì)中，并呈彌散形態(tài)。

圖3 PRK5-Nsp6定位在細(xì)胞質(zhì)中Fig.3 Nsp6 protein localizes in the cytoplasm

2.4 Nsp6亞細(xì)胞共定位

為了確定Nsp6蛋白在細(xì)胞中的定位情況，研究通過登錄生物信息學(xué)網(wǎng)址（https：//www.genscript.com/psort.html）預(yù)測Nsp6蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示（如圖4A），52.2%的Nsp6蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，為了進(jìn)一步明確Nsp6與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位情況，研究將PRK5-Nsp6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于PK15細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，通過熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示（如圖4B），Nsp6蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位。

圖4 A Nsp6蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig.4A Nsp6 protein subcellular localization prediction

圖4 B Nsp6蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位Fig.4B Nsp6 protein co-localizes with endoplasmic reticulum

2.5 Nsp6誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

GRP78是發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵信號蛋白，為檢測Nsp6是否誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，研究將PRK5-Nsp6和pEGFP-N1-Nsp6兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于PK15細(xì)胞中，另用毒胡蘿卜素（Tg）刺激細(xì)胞作為陽性對照，Western blot檢測結(jié)果顯示（如圖5），與空白對照組及空載體組相比，轉(zhuǎn)染Nsp6質(zhì)粒和用Tg處理后，GRP78表達(dá)明顯上調(diào)。此外，為了進(jìn)一步確定Nsp6蛋白是否通過PERK信號途徑導(dǎo)致GRP78表達(dá)上調(diào)，研究檢測了eIF2α的磷酸化水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PRK5-Nsp6或EGFP-N1-Nsp6后，p-eIF2α表達(dá)量升高，以上結(jié)果表明Nsp6蛋白能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵信號蛋白GRP78的表達(dá)以及激活eIF2α的磷酸化水平。

圖5 Nsp6蛋白上調(diào)GRP78蛋白的表達(dá)Fig.5 Nsp6 protein upregulation of GRP78 protein expression

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾的重要場所，因此也是病毒復(fù)制和成熟的關(guān)鍵細(xì)胞器[22]。在病毒感染后，影響機(jī)體鈣離子平衡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體膜轉(zhuǎn)運等，干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能從而增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)，進(jìn)而導(dǎo)致大量未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白的堆積[23-24]。因此，病毒感染后通常會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，位于細(xì)胞膜上的GRP78蛋白能夠識別并結(jié)合到未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)上，并激活下游PERK、IRE1和ATF6關(guān)鍵信號蛋白，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作出相應(yīng)反應(yīng)[25-27]。

根據(jù)已有研究顯示，諸多冠狀病毒能夠引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且大多數(shù)病毒的復(fù)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密切相關(guān)，在感染宿主細(xì)胞后引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[28]。如丙型肝炎病毒基因組在肝癌細(xì)胞中復(fù)制能導(dǎo)致大量病毒蛋白和RNA復(fù)制中間產(chǎn)物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，從而產(chǎn)生數(shù)以千計的新病毒顆粒[29]。登革病毒以ER為復(fù)制位點，在感染過程中有UPR激活的標(biāo)志，UPR激活后誘導(dǎo)內(nèi)膜合成，病毒蛋白優(yōu)先翻譯，促進(jìn)復(fù)制[30]。HRV16的非結(jié)構(gòu)蛋白2B通過PERK和ATF6途徑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[31]。MHV A59蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)eif2α磷酸化水平，阻止宿主蛋白的合成[32]；過表達(dá)PEDV S蛋白能夠上調(diào)GRP78的表達(dá)，并且可與GRP78蛋白發(fā)生共定位情況，但是具體的機(jī)制有待被闡明[33]；PEDV ORF3蛋白可以亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。

冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制中的功能相對保守[34-35]，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)的研究更是少之又少。PEDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白目前已有研究相繼報道，如nsp5編碼3C樣蛋白酶（3C-like proteinase，3CLpro），其在病毒成熟過程中扮演重要角色；非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp12是核酸解旋酶，屬于解旋酶超級家族Ⅰ，可以有效地解開RNA和DNA雙螺旋；Nsp14是一種尿苷酸特異性核糖核酸內(nèi)切酶，它與SARS的nsp15基因有60%同源性[16，36-37]；Nsp6能夠誘導(dǎo)自噬小體的形成抑制病毒復(fù)制，這一特點同PEDV編碼的輔助蛋白ORF3類似，Zou[38]等研究表明ORF3通過誘導(dǎo)自噬進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，Nsp6能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)識蛋白GRP78的表達(dá)以及激活eIF2α的磷酸化水平，表明Nsp6能夠參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并且結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果中可以看出，Nsp6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中占52%，這說明Nsp6是影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要非結(jié)構(gòu)蛋白。目前關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與PEDV之間的機(jī)制研究還處于初級階段，Nsp6參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的具體機(jī)制尚不清楚，比如Nsp6參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激哪條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)識蛋白是否存在互作進(jìn)而影響病毒復(fù)制等一系列問題有待進(jìn)一步深入研究。