王竹雯，國艷嬌，李 爽，周晨光，姜立泉，李 偉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))， 黑龍江 哈爾濱 150040)

木材是與人類生產(chǎn)生活息息相關(guān)的重要可再生資源[1-3]。木材的形成是復(fù)雜的、動態(tài)的、連續(xù)的[4]，包括維管形成層細(xì)胞的分化、木質(zhì)部細(xì)胞分化、次生細(xì)胞壁的積累和細(xì)胞程序性死亡[5-6]。轉(zhuǎn)錄因子在木材形成過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用[7]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族[8-10]。該基因家族在調(diào)控發(fā)育、脅迫響應(yīng)、信號傳導(dǎo)和次生生長方面起著重要作用[11-13]，能夠形成穩(wěn)定、復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來提高植物的抗逆反應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，AtHBI1參與擬南芥細(xì)胞伸長的信號調(diào)節(jié)，是油菜素內(nèi)脂(BR)、赤霉素(GA)、溫度和光信號通路下游細(xì)胞延伸的正向調(diào)節(jié)因子[15-17]，其過表達(dá)植株的葉柄和下胚軸均伸長，且HBI1能和bHLH家族蛋白PRE1形成一個拮抗開關(guān)來影響光信號通路、溫度和激素來調(diào)控細(xì)胞生長[18]，而HBI1及其同源物的顯性失活導(dǎo)致了細(xì)胞的矮化表型，表明HBI1作為中樞生長調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，介導(dǎo)激素、環(huán)境和病原體信號的整合，在bHLH網(wǎng)絡(luò)的反饋調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)葉綠體功能和免疫應(yīng)答方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，在細(xì)胞延伸相關(guān)的激活基因中具有重要作用[19]。

繼CRISPR/Cas9技術(shù)在哺乳動物細(xì)胞基因編輯應(yīng)用之后，經(jīng)過改造的CRISPR/Cas9載體也很快用于擬南芥、煙草、水稻、小麥、大豆和玉米等植物基因組的定向編輯研究[20-23]。2015年Fan等[24]率先將該系統(tǒng)應(yīng)用在毛白楊(Populustomentosa)中的PtoPDS基因，獲得了白化植株，自此CRISPR系統(tǒng)開始應(yīng)用在樹木中；Zhou等[25]首次對木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因4CLs進(jìn)行敲除，獲得的4CL1基因的突變體在木質(zhì)素含量、紫丁香基木質(zhì)素與愈創(chuàng)木基素之質(zhì)量比(S/G)、濃縮單寧酸(原花青素)上均有著顯著的降低，4CL2基因的突變體在濃縮單寧酸含量上有顯著降低，這一結(jié)果為4CLs在木質(zhì)素及類黃酮生物合成途徑中的主要作用及功能冗余現(xiàn)象提供了遺傳學(xué)證據(jù)。

本研究利用東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期對毛果楊莖干中多種細(xì)胞類型進(jìn)行的RNA-seq分析，獲得了1個在形成層和木質(zhì)部高表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子PtrHBI1，利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制了毛果楊(Populustrichorcarpa)PtrHBI1基因突變體，通過對突變體的生長表型、組織切片觀察及木材組分分析，初步解析PtrHBI1轉(zhuǎn)錄因子在木材形成過程中的功能，為創(chuàng)制適用于制漿造紙的林木優(yōu)良品種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樹木材料

樹木材料均取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室)溫室培養(yǎng)的野生型(WT)毛果楊，基因型為Nisqually-1。選取株高為(120 ± 5) cm的WT植株用于原位雜交，株高為(180 ± 20) cm的WT植株用于木質(zhì)部原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，株高為(150 ± 5)cm的WT植株用于石蠟切片觀察。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛果楊PtrHBI1基因的克隆、載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

1)PtrHBI1基因的克隆。通過PtrHBI1基因序列號(Potri.007G023600)在毛果楊網(wǎng)站中查找基因的完整轉(zhuǎn)錄組序列信息(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，根據(jù)其上游與下游的序列信息設(shè)計(jì)特異性引物(見表1中PtrHBI1-1F、PtrHBI1-1R)，以毛果楊木質(zhì)部cDNA為模板進(jìn)行基因克隆并連接pENTR/D_TOPO載體(life invitrogen)，構(gòu)建pENTR-PtrHBI1載體。利用熱激法將連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10(本實(shí)驗(yàn)室保存)，電泳檢測獲得陽性克隆后測序鑒定，與理論序列比對查看序列的準(zhǔn)確性。利用Plasmid mini kit(Qiagen)質(zhì)粒提取試劑盒對pENTR-PtrHBI1進(jìn)行質(zhì)粒提取，產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩?/p>

2)亞細(xì)胞定位。利用雙酶切法構(gòu)建亞細(xì)胞定位的瞬時(shí)表達(dá)載體pUC19-35S-PtrHBI1-GFP，PCR模板為pENTR-PtrHBI1，引物為PtrHBI1-2F、PtrHBI1-2R(表1)，PCR反應(yīng)體系、產(chǎn)物檢測等步驟同上。參照東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姜立泉團(tuán)隊(duì)已發(fā)表的毛果楊木質(zhì)部原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[26]瞬時(shí)轉(zhuǎn)化pUC19-35S-PtrHBI1-GFP，激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果，用以確定亞細(xì)胞定位情況。

表1 所用引物及序列

1.2.2 毛果楊PtrHBI1基因的原位雜交

原位雜交參考文獻(xiàn)[27]的方法并根據(jù)本研究材料做適當(dāng)改進(jìn)。

1)毛果楊PtrHBI1基因探針制備。轉(zhuǎn)錄模板選取目的基因中150～200 bp且無poly A尾的非保守區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄模板。擴(kuò)增引物為表1中PtrHBI1-3F、PtrHBI1-3R，正義探針轉(zhuǎn)錄模板為PtrHBI1-4F，反義探針轉(zhuǎn)錄模板為PtrHBI1-4R。

2)PtrHBI1基因原位雜交。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)供試材料第6莖節(jié)的切片形態(tài)最好且雜交后的組織較完整，因此選擇毛果楊植株第6莖節(jié)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將毛果楊第6莖節(jié)進(jìn)行固定液固定、組織脫水、浸蠟、包埋和切片。用半定量的方法估計(jì)特異探針的質(zhì)量濃度，經(jīng)過計(jì)算得出，PtrHBI1基因正義探針的質(zhì)量濃度是25 ng/μL，PtrHBI1基因反義探針的質(zhì)量濃度是25 ng/μL。原位雜交時(shí)，在黑暗的條件下光線會促進(jìn)甲酰胺的電離作用影響雜交效果，原位雜交后，用顯微鏡觀察雜交情況。

1.2.3 毛果楊PtrHBI1基因突變體的創(chuàng)制

1)構(gòu)建pEgP237-U6-PtrHBI1gRNA-35S-Cas9載體。設(shè)計(jì)PtrHBI1基因gRNA的網(wǎng)站為http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，遵循脫靶概率低于0.5、GC含量在50%左右的設(shè)計(jì)原則，合成gRNA的序列為表1中PtrHBI1-g-F、PtrHBI1-g-R，對gRNA進(jìn)行引物復(fù)性。PCR產(chǎn)物稀釋100倍。載體pEgP237-2A-GFP經(jīng)BsaⅠ單酶切，與PtrHBI1的gRNA用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌中，篩選陽性單克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，后將陽性質(zhì)粒pEgP237-U6-PtrHBI1gRNA-35S-Cas9轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，用于毛果楊的遺傳轉(zhuǎn)化。

2)毛果楊PtrHBI1基因突變體的創(chuàng)制。參照毛果楊快速遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[28-29]進(jìn)行。選擇生長30 d左右健康的毛果楊無菌組培苗，切下第2～3節(jié)莖段，農(nóng)桿菌侵染20 min后共培養(yǎng)48 h，用含有250 mg/L頭孢霉素的無菌水浸泡清洗莖段，隨后移至含有25 mg/L卡那霉素和250 mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上。生長25～30 d出抗性芽后，將抗性芽移至含有20 mg/L卡那霉素和125 mg/L頭孢霉素的抗性芽生根培養(yǎng)基中。

3)突變體的鑒定。用pEgP237-2A-GFP上的F端引物M13F(表1)和PtrHBI1-g-R(表1)為引物，以待鑒定的植株的DNA作為模板PCR擴(kuò)增約500 bp，連接pMD18-T(Takara)載體。取5 μL連接液進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，隨機(jī)挑取過夜培養(yǎng)的30個單克隆用引物M13F進(jìn)行測序，使用DNAStar軟件比對測序結(jié)果，鑒定編輯情況。

1.2.4 毛果楊PtrHBI1基因突變體的表型分析

1)突變體植株的表型觀察。以野生型的毛果楊植株作為對照組，對生長60、90、120 d的突變體植株進(jìn)行拍照，測量各個植株的生長指標(biāo)，包括莖節(jié)數(shù)量、第8莖節(jié)長、地徑以及株高。每個基因型選取3株樹，重復(fù)測量3次，利用SPSS對各生長指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

2)石蠟切片觀察。提前準(zhǔn)備好西林瓶標(biāo)記名稱及日期，提前2 h左右配置石蠟切片的固定液并置于4 ℃冰箱預(yù)冷，對溫室中生長至1.5 m左右苗高的突變體及野生型植株進(jìn)行石蠟切片。收集材料時(shí)按照從上到下依次進(jìn)行切割，選取第2、4、6、8、10莖節(jié)的中間區(qū)域，將每個莖段切成2 cm的厚度，切好的莖段立即放到裝有預(yù)冷固定液的西林瓶里，每個西林瓶放7個左右莖段。固定好之后脫水、浸蠟，浸蠟4 d后進(jìn)行包埋、切片，將用二甲苯脫蠟、酒精脫水后的切片用甲苯胺藍(lán)水溶液染色，染色后的切片用樹脂封片。用數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)M8和View Point Light 軟件對毛果楊石蠟切片進(jìn)行觀察與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。野生型和每株轉(zhuǎn)基因株系分別隨機(jī)選3張第8莖節(jié)切片，每個切片隨機(jī)選3個等比例區(qū)域，統(tǒng)計(jì)了單位面積(mm2)導(dǎo)管和纖維細(xì)胞數(shù)量及單個導(dǎo)管細(xì)胞孔徑面積(μm2)。

1.2.5PtrHBI1基因突變體的木材組分分析

利用Klason酸水解法和高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行木質(zhì)素及纖維素、半纖維素單糖含量測定[28]。分別選取3株4月苗齡的毛果楊野生型、ptrhbi1突變體植株作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行木材組分分析：將毛果楊莖段切下修剪成5 cm左右，剝掉樹皮在室溫下用90%(體積分?jǐn)?shù))丙酮浸泡2 d，室溫下轉(zhuǎn)入100%丙酮中培養(yǎng)14 d，每隔2 d更換1次新鮮的丙酮，晾干切片。用風(fēng)干的莖段來測定木材組成(指標(biāo)為酸不溶性木質(zhì)素、酸可溶性木質(zhì)素和單糖含量)和不同類型的木質(zhì)素組成。

1.3 引物合成及測序

本研究全部的引物合成及測序服務(wù)均由吉林省庫美生物科技有限公司完成(www.comatebio.com)。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊 PtrHBI1基因的原位雜交

實(shí)驗(yàn)室前期通過激光顯微切割技術(shù)捕獲了毛果楊野生型植株莖干不同類型的細(xì)胞，進(jìn)行RNA-seq分析，結(jié)果顯示，PtrHBI1在形成層、木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞中具有不同的表達(dá)水平，其中在形成層細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，其次是木質(zhì)部(圖1A)。對該基因進(jìn)行毛果楊莖干原位雜交，結(jié)果如圖1B和1C所示，PtrHBI1基因雜交信號集中于形成層和木質(zhì)部，但在韌皮部也可觀察到微弱的雜交信號，這與RNA-seq數(shù)據(jù)(圖1A)中PtrHBI1基因的表達(dá)模式一致。通過對該基因的克隆及測序，獲得了1 167 bp長度的CDS序列，用于后續(xù)研究。

A. RNA-seq數(shù)據(jù)中PtrHBI1基因在不同細(xì)胞類型的表達(dá)量(標(biāo)準(zhǔn)化FPKM值是指轉(zhuǎn)錄本豐度標(biāo)準(zhǔn)化為每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)，誤差線代表3個生物學(xué)重復(fù)的SE值)The transcript abundance of PtrHBI1 in RNA-seq data of different cell types (Normalized FPKM indicates normalized transcript abundances as fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments. Error bars indicate one SE of three biological replicates)； B.PtrHBI1基因的正義探針;C.PtrHBI1基因的反義探針。In situ mRNA localization of PtrHBI1. Digoxigenin-labeled sense PtrHBI1 RNA probe in B and digoxigenin-labeled antisense PtrHBI1 RNA probes in C(p.韌皮部phloem;ca.形成層cambium;x.木質(zhì)部xylem)。圖1 毛果楊PtrHBI1基因的表達(dá)模式Fig.1 Expression patterns of PtrHBI1 in Populus trichocarpa

2.2 PtrHBI1的亞細(xì)胞定位

利用毛果楊分化木質(zhì)部原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對PtrHBI1進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果如圖2所示，激光共聚焦顯微鏡下顯示PtrHBI1定位在細(xì)胞核中。此結(jié)果表明PtrHBI1具有轉(zhuǎn)錄因子定位細(xì)胞核的一般特性。

圖2 毛果楊PtrHBI1基因亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular localization of PtrHBI1 gene in P. trichocarpa

2.3 毛果楊PtrHBI1基因CRISPR突變體的獲得

為了進(jìn)一步研究PtrHBI1在木材形成過程中的功能，筆者采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制了毛果楊PtrHBI1基因功能缺失突變體。利用毛果楊快速遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[26]，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，獲得抗性植株(圖3A—3C)。提取待鑒定的抗性植株葉片基因組DNA，使用載體引物M13F和PtrHBI1-g-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3D所示，野生型(陰性對照，第3泳道)未擴(kuò)增出條帶，而2株抗性植株(4、5泳道)均擴(kuò)增出與陽性對照(第2泳道)相同大小的條帶，說明PtrHBI1重組質(zhì)粒已經(jīng)成功整合到毛果楊基因組中。

A. 愈傷組織分化誘導(dǎo)callus induction；B. 抗性芽誘導(dǎo)shoot induction；C. 抗性植株篩選the screening of the resistant plants；D. 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定the PCR detection results(M. DNA marker DL2000; 1. ddH2O為模板的陰性對照negative control with ddH2O as PCR template; 2. pEgP237-U6-PtrHBI1gRNA-35S-Cas9質(zhì)粒為模板的陽性對照 positive control with plasmid pEgP237-U6-PtrHBI1 gRNA-35S-Cas9 as PCR template; 3. 野生型毛果楊葉片DNA為模板的陰性對照negative control with leaf DNA of wild-type plant as PCR template; 4-5. 抗性植株葉片DNA為模板的樣品sample with leaf DNA of kanamycin-resistant plant as PCR template)。圖3 毛果楊轉(zhuǎn)基因植株的獲得Fig.3 Generation of P. trichocarpa transgenic plants

為了鑒定轉(zhuǎn)基因植株的PtrHBI1基因編輯情況，提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA為擴(kuò)增模板，參照毛果楊DNA序列，在包含gRNA位點(diǎn)的上下游共500 bp處設(shè)計(jì)引物PtrHBI1-5F、PtrHBI1-5R(表1)，擴(kuò)增目的片段DNA，加A尾后連接到T載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，每個植株挑取30個陽性單克隆進(jìn)行測序，與野生型序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖4所示：獲得1株ptrhbi1純合突變體，其gRNA靶位點(diǎn)序列中缺失1個堿基“G”(圖4A)；造成PtrHBI1氨基酸序列翻譯提前終止(圖4B)；另獲得1株雙等位突變體，其中一條等位基因缺失2個堿基，另一條等位基因缺失21個堿基(圖4A)，蛋白預(yù)測顯示該突變體保留了典型的HLH結(jié)構(gòu)域[30](圖4B)，表明該突變體可能仍具有PtrHBI1的功能。因此選取純合突變體進(jìn)行后續(xù)研究。

A. 等位基因編輯情況(紅色“-”表示堿基缺失，“-21 bp-”表示缺失21個堿基)gene editing of alleles (The red short lines “-” represent deletion, “-21 bp-” represent 21 nucleotide deletion)；B.被編輯基因的蛋白翻譯情況預(yù)測(紅色塊區(qū)域表示缺失7個氨基酸) the prediction of amino acid sequence translation (The red short lines represent amino acid changed)。圖4 毛果楊PtrHBI1基因編輯情況Fig.4 Gene editing of PtrHBI1 gene in P. trichocarpa

2.4 PtrHBI1突變體植株生長表型分析

為了分析PtrHBI1功能缺失后對樹木的影響，首先對株高150 cm左右的ptrhbi1純合突變體和野生型進(jìn)行生長指標(biāo)的測定，結(jié)果如圖5所示。與野生型相比，ptrhbi1突變體植株的株高顯著增高，莖節(jié)數(shù)、地徑及第8莖節(jié)長度均有增加的趨勢，表明PtrHBI1基因的功能缺失促進(jìn)了植株的生長。

誤差線代表3個生物學(xué)重復(fù)的SE值，*表示通過t檢驗(yàn)，突變體與野生型植物各株系之間存在顯著差異；*.P<0.05，**.P<0.01。下同。Error bars represent SE values of three independent experiments. Asterisks indicate significant differences between each line of the mutants and wild-type plants by Student’s t test. The same below.圖5 毛果楊野生型和突變體植株生長表型分析Fig.5 Growthphenotype analysis of WT and ptrhbi1 mutants in P. trichocarpa

A. 野生型(WT)和突變體(ptrhbi1)毛果楊各莖節(jié)細(xì)胞形態(tài)觀察(比例尺代表200 μm)morphologic observation of stem internodes of WT and ptrhbi1 (Bars=200 μm)；B. 形成層細(xì)胞形態(tài)觀察(紅色線表示形成層區(qū)域，比例尺代表100 μm)morphologic observation of cambium cells (Red line showed cambium areas, Bars=100 μm)；C. 單位面積細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)statistics analysis of number of cambium cell layer；D. 導(dǎo)管孔徑大小統(tǒng)計(jì)statistics analysis of lumen area of per vessel；E. 形成層細(xì)胞層數(shù)統(tǒng)計(jì)statistics analysis number of cambium cell layer。圖6 毛果楊野生型與ptrhbi1 突變體植株組織切片表型觀察Fig.6 Paraffin section observation of WT and ptrhbi1 mutants

為了進(jìn)一步解析PtrHBI1在楊樹木材形成過程中發(fā)揮的功能，筆者通過石蠟切片技術(shù)及化學(xué)組織染色觀察突變體莖橫切面細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖6所示，在ptrhbi1突變體植株中，形成層細(xì)胞的大小、形態(tài)、數(shù)量、細(xì)胞層數(shù)均沒有明顯變化(圖6A—6C)。這一結(jié)果表明，PtrHBI1基因的功能缺失，并未對維管形成層的分化造成影響。除了形成層的表型，筆者也對ptrhbi1突變體植株木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞和纖維細(xì)胞表型進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖6A所示，各莖節(jié)中的導(dǎo)管和纖維細(xì)胞形態(tài)與野生型毛果楊沒有差異。與野生型相比，ptrhbi1突變體植株中導(dǎo)管細(xì)胞孔徑顯著增大(圖6D)，纖維細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(圖6E)，導(dǎo)管細(xì)胞的數(shù)量沒有改變。以上結(jié)果表明，PtrHBI1轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控毛果楊木質(zhì)部的發(fā)育過程。

2.5 ptrhbi1 突變體植株木材組分分析

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知PtrHBI1轉(zhuǎn)錄因子的功能缺失，影響了木質(zhì)部細(xì)胞的發(fā)育，推測突變體的木材組分也會發(fā)生改變。因此，利用Klason酸水解法和HPLC分別對木質(zhì)素、纖維素和半纖維素進(jìn)行組分分析。木質(zhì)素含量結(jié)果(表2)表明，ptrhbi1突變體植株的酸不可溶性木質(zhì)素含量顯著降低，酸可溶性木質(zhì)素含量顯著升高，總木質(zhì)素含量變化不顯著；紫丁香基木質(zhì)素(S型木質(zhì)素)、對-羥基苯基木質(zhì)素(H型木質(zhì)素)含量均顯著降低，愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G型木質(zhì)素)含量顯著升高，S/G比例顯著降低。有報(bào)道指出木質(zhì)部纖維細(xì)胞次生壁的木質(zhì)素主要由S型木質(zhì)素組成，而導(dǎo)管細(xì)胞次生壁主要由G型木質(zhì)素組成[31-33]，因此以上S型和G型木質(zhì)素含量結(jié)果與ptrhbi1突變體植株纖維細(xì)胞數(shù)量減少、導(dǎo)管孔徑變大的表型(圖6D和6E)相一致。

此外，纖維素、半纖維素含量測定結(jié)果(表2)顯示，ptrhbi1突變體植株中葡萄糖的含量顯著增加，表明PtrHBI1基因的功能缺失促進(jìn)纖維素的合成。綜合以上結(jié)果，表明PtrHBI1轉(zhuǎn)錄因子在木質(zhì)素合成及纖維素合成中發(fā)揮著調(diào)控作用。

表2 毛果楊野生型與ptrhbi1 突變體植株木材組分占比

表3 毛果楊野生型與ptrhbi1 突變體植株木質(zhì)素組分組成

3 討 論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中一個較為龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控眾多復(fù)雜的生物學(xué)過程，廣泛參與植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)[34]。本研究基于前期利用LCM捕獲的毛果楊形成層、木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞進(jìn)行的RNA-seq數(shù)據(jù)分析，篩選得到1個在形成層和木質(zhì)部表達(dá)的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子PtrHBI1，為了研究其具體功能，采用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制了PtrHBI1的功能缺失突變體，對突變體進(jìn)行表型、組織切片及木材組分分析，發(fā)現(xiàn)PtrHBI1的功能缺失促進(jìn)了植株的高生長，直接影響了木質(zhì)部細(xì)胞的分裂分化，導(dǎo)致突變體木材纖維素含量增加、木質(zhì)素S/G比例顯著降低，揭示了PtrHBI1參與調(diào)控毛果楊的生長及次生木質(zhì)部發(fā)育，為進(jìn)一步解析植物次生木質(zhì)部發(fā)育的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)提供了新的線索。

毛果楊PtrHBI1與擬南芥的HBI1(AT2G18300)是同源基因[34]。對擬南芥HBI1的研究表明，HBI1作為植物生長調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，通過介導(dǎo)激素、環(huán)境和病原體信號的整合，在植物生長和免疫之間的平衡中起關(guān)鍵作用[19]。在本研究中，毛果楊PtrHBI1的功能缺失顯著提高了植株的高度，表明PtrHBI1在樹木生長方面起到調(diào)控作用，這與擬南芥HBI1在植物生長中的功能相類似，但其在樹木生長調(diào)控中的機(jī)制有待深入研究。通過對基于LCM技術(shù)的毛果楊木材細(xì)胞類型RNA-seq數(shù)據(jù)以及原位雜交的分析，確定了PtrHBI1在毛果楊莖干的維管形成層和木質(zhì)部中高表達(dá)，因此推測該基因可能在維管形成層的分化上具有一定調(diào)控作用。但是對ptrhbi1突變體的各類型木材細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，形成層的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)均沒有顯著變化，說明PtrHBI1的功能缺失并未對毛果楊維管形成層的分化造成影響。PtrHBI1又名PtrbHLH94，毛果楊bHLH家族進(jìn)化分析顯示PtrbHLH67(Potri.005G121900)與PtrHBI1在同一個進(jìn)化分支[34]，說明PtrbHLH67和PtrHBI1可能具有相似的功能，即存在功能冗余，單一敲除PtrHBI1基因功能可能不足以影響形成層的分化。這種對具有相近進(jìn)化關(guān)系的其中一個基因進(jìn)行編輯，而未出現(xiàn)相關(guān)表型的現(xiàn)象，也出現(xiàn)在以往的報(bào)道中[28]。

在被子植物中，木材細(xì)胞的次生細(xì)胞壁主要由厚壁組織細(xì)胞構(gòu)成，這些細(xì)胞經(jīng)過分化形成木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，其決定了木材的品質(zhì)。對林產(chǎn)品工業(yè)來說，纖維素是紙漿和紙張生產(chǎn)的主要來源，木質(zhì)素是糖化生產(chǎn)液體生物燃料的障礙[31,35]，木質(zhì)素的存在阻礙了纖維素纖維的提取。因此，獲得高纖維素、低木質(zhì)素含量的樹種，對林產(chǎn)品工業(yè)以及生物能源行業(yè)具有重要意義。本研究通過對ptrhbi1突變體植株木材組分分析發(fā)現(xiàn)，其葡萄糖含量顯著增加，碳水化合物含量顯著提高，說明PtrHBI1的功能缺失促進(jìn)了纖維素的合成，表明PtrHBI1基因可以作為利用分子育種技術(shù)進(jìn)行木材材性改良的重要候選基因，對速生材的研究與定向培育起著重要的指導(dǎo)作用。雙子葉植物的木質(zhì)素主要由S型(syringyl)和G型(guaiacyl)木質(zhì)素聚合而成[36-37]。普遍認(rèn)為，木質(zhì)部纖維細(xì)胞次生壁的木質(zhì)素主要由S型木質(zhì)素組成，而導(dǎo)管細(xì)胞次生壁主要由G型木質(zhì)素組成[31-33]。木質(zhì)素S/G比例的變化反應(yīng)樹木纖維細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的數(shù)量或形態(tài)的變化，也是衡量制漿造紙木材的一個重要特性。研究表明，G型木質(zhì)素會降低紙漿的產(chǎn)率，而S型木質(zhì)素能提高紙漿的產(chǎn)率[37-39]。在楊樹中過量表達(dá)木質(zhì)素合成酶基因CAld5H增加了S/G木質(zhì)素的比例，使得紙漿造紙效率大幅提高[40]。本研究中ptrhbi1突變體的S型木質(zhì)素含量降低，同時(shí)G型木質(zhì)素含量增加，使得S/G比例下降，表明PtrHBI1的功能缺失，不利于制漿造紙。近期研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的木質(zhì)部細(xì)胞中抑制木質(zhì)素的合成，S型和G型木質(zhì)素分別在不同的轉(zhuǎn)基因楊樹中顯著降低，并且特異降低纖維細(xì)胞木質(zhì)素的轉(zhuǎn)基因植株生物量增加，而針對導(dǎo)管細(xì)胞木質(zhì)素抑制的結(jié)果則相反[33]。由此可見，基于PtrHBI1對纖維素和不同類型木質(zhì)素含量的影響，若在特定木質(zhì)部細(xì)胞類型中改變PtrHBI1基因的表達(dá)，可能會為創(chuàng)制利于制漿造紙樹木品種策略提供參考。目前在細(xì)胞水平上改變木質(zhì)素含量，仍需要對調(diào)控特定類型木質(zhì)部細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行挖掘。PtrHBI1的功能缺失，分別對纖維細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的數(shù)量和孔徑大小有顯著影響，說明該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控毛果楊次生木質(zhì)部細(xì)胞的發(fā)育，可能是在細(xì)胞水平進(jìn)行木材改良的候選基因。

利用基因工程等技術(shù)進(jìn)行林木遺傳改良，選育產(chǎn)量更高、品質(zhì)更優(yōu)、抗逆性更強(qiáng)、適應(yīng)性更廣的林木品種用于生產(chǎn)，用更少的人工林面積生產(chǎn)更多的木材等林產(chǎn)品，以減少對天然林的依賴，是今后林木遺傳育種的發(fā)展趨勢和重點(diǎn)[38]。PtrHBI1參與調(diào)控毛果楊次生木質(zhì)部發(fā)育過程，對植株的生長和木材形成具有重要的調(diào)控作用。PtrHBI1的基因功能缺失研究為創(chuàng)制適合于制漿造紙的優(yōu)良樹種提供了新思路。