龍 舉，吳彩妮，曾軍杰，梅光明

(1 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究室，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 舟山 316021；2 浙江伊渼源檢測(cè)科技有限公司，浙江 舟山 316100)

激素是指由體內(nèi)的某一細(xì)胞、腺體或者器官所產(chǎn)生的可以影響機(jī)體內(nèi)其他細(xì)胞活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)[1]。由于激素化合物能提高飼料轉(zhuǎn)化率，縮短動(dòng)物生長(zhǎng)周期，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖等作用近年來(lái)被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[2]，被用以提高養(yǎng)殖魚的經(jīng)濟(jì)效益。激素在養(yǎng)殖魚中違規(guī)使用，造成了嚴(yán)重的安全隱患。激素隨著食用養(yǎng)殖魚肉進(jìn)入人體會(huì)干擾機(jī)體激素平衡，導(dǎo)致性早熟，機(jī)體中水、電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪和糖的代謝紊亂，以及提高乳腺癌、前列腺癌等發(fā)病率，對(duì)健康具有潛在的危害[3]，會(huì)影響人體生理活動(dòng)[4]。歐盟規(guī)定在飼料中禁止使用雄激素[5]，中國(guó)明確規(guī)定了部分激素在動(dòng)物性源性食品中的最大殘留量[6]。

目前檢測(cè)激素類殘留的方法主要有酶聯(lián)免疫法[7]、高效液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS /MS)[12]。結(jié)合方法穩(wěn)定性、靈敏度、工作效率等因素，選用LC- MS /MS 作為本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，建立了同時(shí)測(cè)定養(yǎng)殖魚肌肉中酚類、天然生成及人工合成雌激素以及環(huán)境激素的新方法，該方法前處理方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能快速高效的檢測(cè)養(yǎng)殖魚肌肉中多種激素的殘留，同時(shí)也為其他動(dòng)物源性食品中的獸藥多殘留分析提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

水產(chǎn)樣品共120個(gè)，隨機(jī)在浙江省內(nèi)寧波、溫州、杭州、舟山等地市場(chǎng)及養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)品包括諾龍、群伯龍、甲基睪酮、己烷雌酚、己二烯雌酚、雙酚A、雌二醇 (純度98.5%～99.0%) 德國(guó)Dr公司；馬拉硫磷購(gòu)自國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心；氯化鈉(分析純)，阿拉丁試劑公司；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純)Sigma公司；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別取8種激素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；臨用時(shí)用甲醇配制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)用現(xiàn)配。用流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一系列濃度是標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：Waters Acquity 超高效液相色譜儀-高分辨-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Waters Xevo G2-S QTof-MS)、AcquityTM型超高效液相色譜儀(UPLC)、Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；渦旋振蕩器(IKAM S1)，德國(guó)IKA公司；Eppendorf Centrifuge 5810高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；N-EVAP-45氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g(±0.01)樣品于50 mL離心管中，加入 0.7 g氯化鈉，再加5 mL乙腈，渦旋混勻，40℃超聲提取10 min后，在4 ℃下7000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至15 mL聚四氟乙烯離心管中。再用5 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并后的上清液45 ℃氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL 5 mmol乙酸銨水溶液-乙腈(90:10)復(fù)溶殘?jiān)?，?0 mg PSA，渦旋1.0 min，在4 ℃下7000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm， 1.7 μm)； 柱溫40 ℃；樣品溫度25 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為5 mmol乙酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 8種激素梯度洗脫表Table 1 8 hormone gradient elution tables

1.5 質(zhì)譜條件

離子源: 電噴霧正負(fù)離子源；掃描模式為Full Scan/MSE；檢測(cè)方式: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為35 V; 離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為380 ℃；錐孔反吹氣為高純氮?dú)?，流速?0 L/h；脫溶劑氣為高純氮?dú)猓魉贋?00 L/h；運(yùn)行時(shí)間為15 min。Source Acquisition Mode、Da Range及Collision Energy根據(jù)不同激素的特性選擇調(diào)試合適的條件，低碰撞為0V，高碰撞能為20～30 V；質(zhì)量掃描范圍為100～1000 Da；采用2.0 μg/L亮氨酸腦啡肽(分子量為556.2771/554.2615(+/-))進(jìn)行實(shí)時(shí)校準(zhǔn)以保證目標(biāo)物的質(zhì)量數(shù)精度。錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件如表2所示。

表2 8 種激素質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件Table 2 8 hormones mass spectrometry multiple reaction monitoring experimental conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取試劑，比較了震蕩超聲提取及振蕩提取對(duì)養(yǎng)殖魚肌肉中8種激素的提取效果。如圖1所示，取同一草魚陰性樣本兩組，均加入100 μL 100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用震蕩超聲提取及振蕩提取，經(jīng)試驗(yàn)震蕩超聲提取時(shí)，己二烯雌酚回收率最低為70.2%，諾龍回收率最高為98.5%；振蕩提取時(shí)己群勃龍回收率最低為66.4%，馬拉硫磷回收率最高為86.2%，振蕩提取效果明顯不及震蕩超聲提取。

由圖1可知震蕩加超聲提取方式的提取效果優(yōu)于振蕩提取。這是由于樣品基質(zhì)含蛋白質(zhì)以及水分含量高，成分復(fù)雜且分散，振蕩提取易使其粘壁對(duì)目標(biāo)物造成損失。超聲提取利用機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，來(lái)增加大分子運(yùn)動(dòng)速度以及頻率，從而提高介質(zhì)的穿透力達(dá)到對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行高效提取。

圖1 兩種不同提取方式的回收率Fig.1 Recovery of two different extraction methods

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵連續(xù)進(jìn)樣對(duì)8種激素進(jìn)行分析，諾龍、群伯龍、馬拉硫磷、甲基睪酮采用ESI+模式，己烷雌酚、己二烯雌酚、雙酚A、雌二醇采用ESI-模式，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到每種激素的分子離子，對(duì)錐孔電壓及毛細(xì)管電壓進(jìn)行優(yōu)化，確定準(zhǔn)分子離子峰。通過(guò)子離子掃描，并對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，確定8種激素的定量及定性離子。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，分別選擇乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相同時(shí)分析8種激素的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，乙腈-0.1%甲酸水可使諾龍、群伯龍、馬拉硫磷、甲基睪酮等4種激素(EIS+)出峰分離，且峰形良好，但不能使4種激素(EIS-)完全出峰。使用5 mmol乙酸銨水溶液-乙腈為流動(dòng)相可使己烷雌酚、己二烯雌酚、雙酚A、雌二醇等4種激素出峰分離，峰形較好，且其他4種激素目標(biāo)峰無(wú)明顯變化。故本實(shí)驗(yàn)選擇5 mmol乙酸銨水溶液-乙腈為流動(dòng)相分析8種激素，如圖2為各激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

圖2 8種激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 8 hormone standard solutions

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

用甲醇將8種激素標(biāo)準(zhǔn)使用稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以外標(biāo)法獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)樣后，以目標(biāo)物的峰面積(y)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)。方法在2.0～100 μg/kg范圍內(nèi)8種激素線性良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。分別以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比確定方法檢出限(LOD)及定量限(LOQ)，檢出限范圍為0.3～0.5 μg /kg，定量限范圍為0.9～1.5 μg /kg，具體結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 8種激素的線性方程、LOD和LOQTable 3 Linear equations, LOD and LOQ of 8 hormones

2.4.2 回收率及精密度

通過(guò)配制基質(zhì)工作溶液來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。分別采用空白草魚、大黃魚樣品制作基質(zhì)提取液和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，根據(jù)目標(biāo)藥物在質(zhì)譜中響應(yīng)的強(qiáng)弱加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，得到每種物質(zhì)的線性范圍及相關(guān)系數(shù)。每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，按本方法進(jìn)行檢測(cè)，得到回收率為70.2%～86.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.56%～8.58%。大黃魚中8種激素的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 8種激素的線性范圍、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Linear range, recovery, RSDs of 8 hormones

2.4.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

表5 養(yǎng)殖魚肌肉中激素類檢出情況表Table 5 Table of hormone detection in Farmed fish muscle

用此方法對(duì)浙江省不同地域、季節(jié)和品種的養(yǎng)殖魚肌肉中激素類藥物開展了篩查和定量檢測(cè)工作。共計(jì)采集和篩查養(yǎng)殖魚樣品120個(gè)，包括鳙魚、多寶魚、石斑魚、大黃魚、烏鱧、草魚、鱸魚、黃鱔、鯉魚、黃顙魚、烏鱧、黑鯛共12種。樣品均取肌肉可食部位，勻漿后冷凍保存。在120個(gè)樣品中共篩查出2例樣品共2種激素，經(jīng)確證和UPLC-MS/MS定量檢測(cè)后確定為2個(gè)激素參數(shù)有檢出樣品。養(yǎng)殖魚肌肉中激素類檢出情況見(jiàn)表5。

3 結(jié) 論

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)殖魚肌肉中8種激素的檢測(cè)方法，并優(yōu)化了前處理方法及色譜、質(zhì)譜條件，整體實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，此方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，能快速高效的定性篩查和定量分析大批量樣品中的多種激素類藥物，也為保障養(yǎng)殖魚類水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。