倪惠華，曉 霄，張家怡，李 娟，花敏慧

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南通 226001)

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的特殊類型，其主要表現(xiàn)為胚胎或者胎兒在停止發(fā)育死亡后在宮腔內(nèi)滯留，未能正常排出體外[1]。有研究報(bào)道指出[2]，精神壓力、遺傳因素、不良生活習(xí)慣、母體自身性疾病及免疫功能異常均可造成稽留流產(chǎn)的產(chǎn)生，其主要表現(xiàn)為停經(jīng)、腹痛、陰道流血等。胎盤(pán)中的血管畸形可阻斷患者的母體螺旋動(dòng)脈的血流，造成局部病灶部位的缺氧，造成了稽留流產(chǎn)的形成[3]。EphB4屬于酪氨酸蛋白激酶受體(Receptor tyrosine kinase，RTK)家族中的一員，與胚胎的發(fā)育、神經(jīng)軸突的導(dǎo)向以及血管的形成顯著相關(guān)[4]；自噬基因Beclin-1在胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)以及凋亡中發(fā)揮重要作用，是自身免疫性疾病、癌癥、炎癥性疾病等治療的重要靶點(diǎn)，目前關(guān)于稽留流產(chǎn)患者的研究較少[5]。本研究檢測(cè)比較稽留流產(chǎn)患者和正?；颊呓q毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白表達(dá)和微血管密度(Microvessel density，MVD)，并分析兩者的相關(guān)性，為臨床稽留流產(chǎn)診斷以及治療提供科學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究以2020年1月至12月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為稽留流產(chǎn)終止妊娠的患者62例為觀察組，平均年齡26.33±2.33歲(20～35歲)，平均孕周8.56±2.03周；另選取同期正常早孕自愿終止妊娠患者60例為對(duì)照組；兩組患者的年齡、體重指數(shù)(Body Mass Index，BMI)及孕周間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往月經(jīng)規(guī)則；②妊娠期間無(wú)明顯感染及服藥史，無(wú)黃體酮等保胎治療史；③觀察組患者通過(guò)末次月經(jīng)推算胎齡并且通過(guò)B型超聲核對(duì)孕周、孕囊小于停經(jīng)天數(shù)、妊娠囊>2cm未見(jiàn)胚芽、胚芽的長(zhǎng)度>lcm未見(jiàn)心管搏動(dòng)；④對(duì)照組患者早孕人流組血清人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)陽(yáng)性，B型超聲檢查可見(jiàn)胚芽或(和)心管搏動(dòng)以證實(shí)胚胎存活，妊娠囊大小與停經(jīng)天數(shù)相符合。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠時(shí)間在6周以下或10周以上；②年齡在20歲以下或40歲以上；③生殖道結(jié)構(gòu)畸形、月經(jīng)周期不規(guī)律、生殖道感染等；④母體患有全身性疾??；⑤孕早期毒物、藥物、射線接觸史、家族遺傳史等。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)倫理委員會(huì)論證通過(guò)。

1.2試劑與儀器

主要試劑：EphB4鼠抗人單克隆抗體、Beclin-1鼠抗人單克隆抗體、CD34鼠抗人單克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體(santa cruz公司，美國(guó))、蛋白裂解液(Roche公司，德國(guó))、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、免疫組化試劑盒、HPR標(biāo)記山羊抗鼠二抗、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：組織石蠟包埋機(jī)LK-l型(北京滔達(dá)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)、自動(dòng)封片機(jī)(SAKURA公司，日本)、凝膠成像分析處理系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國(guó))、垂直電泳槽(Bio-rad公司，美國(guó))、光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集

觀察組和對(duì)照組所有患者在負(fù)壓吸宮術(shù)后取出胎盤(pán)絨毛，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后，分裝2份；一份置于凍存管內(nèi)-80℃冰箱保存，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)；一份包埋成組織蠟塊，行免疫組化染色。

1.3.2 Western Blot檢測(cè)絨毛組織中EphB4和Beclin-1蛋白的表達(dá)

分別對(duì)患者的絨毛組織進(jìn)行收集20mg，將其內(nèi)加入細(xì)胞裂解液，在4℃保存20min。使用10 000r/min進(jìn)行離心10min，取上清液30μL，加入10μL SDS loading buffer，在100℃下進(jìn)行預(yù)處理10min，再次使用10000r/min進(jìn)行離心10min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。隨后使用12%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，每孔上樣為10μL，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉1h。將膜在4℃下與一抗抗EphB4(1∶1 000稀釋)、Beclin-1(1∶1 500稀釋)、β-actin(1∶1 000 稀釋)進(jìn)行孵育過(guò)夜。同時(shí)使用PBST進(jìn)行洗滌3次，同時(shí)加入HPR標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)在室溫下孵育1小時(shí)。使用ECL底物化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算EphB4和Beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)絨毛組織中MVD的表達(dá)

對(duì)所有石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，于高壓枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%的雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用山羊血清封閉液孵育。加入一抗CD34(1∶100稀釋)4℃孵育過(guò)夜后,滴加HPR標(biāo)記山羊抗鼠二抗，室溫孵育20min，DAB顯色，經(jīng)過(guò)蘇木精復(fù)染后脫水封片后顯微鏡下觀察CD34的染色情況。用CD34的表達(dá)量代表MVD。結(jié)果判定：CD34分布于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。微血管計(jì)數(shù)參考Weidner等[6]的標(biāo)準(zhǔn)：凡標(biāo)記清晰，著色強(qiáng)，與背景明顯有別的單個(gè)染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞、管腔直徑小于8個(gè)紅細(xì)胞的血管或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇，不論是否形成管腔或管腔內(nèi)是否有紅細(xì)胞，只要不和臨近的微血管、細(xì)胞及其它結(jié)締組織相連，就作為一個(gè)微血管。管壁有平滑肌的血管不予計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下尋找新生血管最密集區(qū)，然后在200倍視野下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)微血管染色數(shù)目,其平均值即該例的MVD。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組患者一般情況比較

觀察組62例患者平均年齡為(26.33±2.33)歲，平均BMI為(23.18±1.39)kg/m2，平均孕周(8.56±2.03)周；對(duì)照組60例患者平均年齡(26.53±2.36)歲，孕前平均BMI為(23.13±2.36)kg/m2，平均孕周(8.62±2.22)周；兩組患者的年齡、BMI及孕周之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為0.47、0.14、0.16，P>0.05)，兩組具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的一般情況比較 Table 1 Comparison of general conditions of the pregnantwomen between the two

2.2兩組患者絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

觀察組絨毛組織中EphB4蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(t=4.97，P<0.01)，如圖1；觀察組絨毛組織中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.04，P<0.01)，見(jiàn)圖2、表2。

表2 兩組患者絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 2 Comparison of relative expression levels of EphB4and Beclin-1 proteins in the chorionic villous tissues ofthe pregnant women between the two

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05。圖1 兩組絨毛組織中EphB4蛋白表達(dá)量比較Fig.1 Comparison of relative expression level of EphB4 protein in the chorionic villous tissues ofthe pregnant women betweenthe two groups

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05。圖2 兩組絨毛組織中Beclin-1蛋白表達(dá)量比較Fig.2 Comparison of relative expression level of Beclin-1 protein in the chorionic villous tissues ofthe pregnant women between the two groups

2.3兩組患者絨毛組織中MVD的比較

觀察組患者絨毛組織中MVD(6.74±1.37)明顯低于對(duì)照組(15.70±5.51)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.42，P<0.01)，見(jiàn)圖3、表3。

表3 兩組患者絨毛組織中MVD的比較Table 3 Comparison of MVD in the chorionic villous tissues of the pregnant women

2.4稽留流產(chǎn)絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白水平與MVD的相關(guān)性分析

在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，EphB4蛋白相對(duì)表達(dá)量與MVD呈正相關(guān)(r=0.44，P<0.01)，Beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量與MVD負(fù)正相關(guān)(r=-0.52，P<0.01)，具體如表4。

表4 稽留流產(chǎn)絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白水平與MVD的相關(guān)性分析Table 4 Correlations of expression levels ofEphB4 and Beclin-1 proteins in chorionicvillous tissues of missed abortion with MVD

A.觀察組絨毛組織MVD(SP×200)；B.對(duì)照組絨毛組織MVD(SP×200)；C.兩組絨毛組織中MVD的比較；*表示與對(duì)照組比較，P<0.05。

3討論

以往研究認(rèn)為，遺傳因素以及內(nèi)分泌因素均是造成患者稽留流產(chǎn)的重要影響因素，但仍然有超過(guò)50%稽留流產(chǎn)患者的病理生理學(xué)基礎(chǔ)尚不清晰[7]。最新研究報(bào)道顯示，胎盤(pán)的血管異常時(shí)造成患者稽留流產(chǎn)的重要原因，胎盤(pán)的發(fā)育與病灶部位的血管形成情況相關(guān)[8]。在正常的解剖關(guān)系中，胎盤(pán)組織具有較為復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)，而在此結(jié)構(gòu)形成的過(guò)程中，主要可分為血管的形成以及血管的發(fā)生兩個(gè)階段，而血管的生成主要包括血管的出芽、內(nèi)填以及延長(zhǎng)三個(gè)階段。而在胎盤(pán)組織上的氧分壓、炎性反應(yīng)以及局部氧化應(yīng)激反應(yīng)水平發(fā)生改變后，均可造成局部胎盤(pán)組織血管的形成發(fā)生障礙[9]。而隨著局部病灶部位的血管發(fā)生障礙后，局部組織的營(yíng)養(yǎng)供給水平顯著下降，患者發(fā)生先兆流產(chǎn)以及胎兒窘迫的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。有研究報(bào)道顯示，隨著病灶部位的胎盤(pán)血管形成顯著下降，顯著阻斷了病灶部位的螺旋小動(dòng)脈的血液供應(yīng)，進(jìn)而維持了1%～2%的低氧環(huán)境，隨著低氧環(huán)境的顯著升高，毛細(xì)血管的形成以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用也隨之下降，進(jìn)一步造成了患者稽留流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的升高[10]。

3.1絨毛組織EphB4表達(dá)與稽留流產(chǎn)MVD的相關(guān)性

Eph(Erythropoietin producing hepatoma cell line)受體家族是受體酪氨酸激酶家族的最大亞族，分成兩個(gè)亞群，EphA和EphB，其配體也被分為兩個(gè)亞群，分別為Ephrin-A和Ephrin-B。Eph的失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)甚至惡性轉(zhuǎn)化。EphB4是其重要組成成員，通過(guò)與其配體EphinB2結(jié)合，在血管的生成中發(fā)揮重要作用，對(duì)于血管的形成具有重要的意義。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)對(duì)小鼠的EphB4基因進(jìn)行敲除，小鼠的胚胎顯著壞死，而通過(guò)對(duì)死亡胚胎的解剖學(xué)分析，小鼠的胚胎壞死主要是由于缺陷型血管形成[11]。也有研究報(bào)道認(rèn)為，患者的EphB4與機(jī)體的血管形成以及黏附、增殖顯著相關(guān)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，隨著EphB4活性的顯著性下降，可造成胚胎發(fā)育的突然中止[12]。所以，EphB4的表達(dá)在胚胎的血管發(fā)育以及重塑中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者絨毛組織中EphB4蛋白相對(duì)量的表達(dá)顯著低于對(duì)照組；同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果提示，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中EphB4蛋白表達(dá)與MVD呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。覃琴紅等[13]通過(guò)對(duì)早期稽留流產(chǎn)患者絨毛組織的EphB4水平分析顯示，在早期稽留流產(chǎn)患者中，患者的EphB4顯著下降，與本研究結(jié)果一致。

3.2絨毛組織 Beclin-1表達(dá)與稽留流產(chǎn)MVD的相關(guān)性

有研究報(bào)道顯示，在低氧狀態(tài)下，可通過(guò)對(duì)雷帕霉素靶蛋白信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬作用，在正常的細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)機(jī)體的局部滋養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)，少量的自噬細(xì)胞可通過(guò)對(duì)錯(cuò)誤信號(hào)的折疊蛋白以及受損的細(xì)胞器進(jìn)行吞噬，對(duì)機(jī)體的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行供能，維持機(jī)體的穩(wěn)定狀態(tài)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)患者細(xì)胞的凋亡以及自噬作用的相互促進(jìn)作用，維持機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[14]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者絨毛組織中Beclin-1蛋白相對(duì)量的表達(dá)顯著高于對(duì)照組；同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果提示，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中Beclin-1蛋白表達(dá)與MVD呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。提示在稽留流產(chǎn)患者的疾病進(jìn)展中，局部胎盤(pán)的缺氧癥狀顯著，血管的形成以及畸形率顯著下降。目前對(duì)于稽留流產(chǎn)患者的研究中，機(jī)體的自噬作用對(duì)于稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)揮關(guān)鍵性作用[15]，認(rèn)為在缺氧狀態(tài)下機(jī)體的mTOR負(fù)調(diào)控的自噬誘導(dǎo)、3級(jí)PI3K復(fù)合物與Beclin-1結(jié)合造成的自噬誘導(dǎo)、泛素養(yǎng)蛋白Atg8-PE 以及Atg12-Atg5-Atg16參與的雙層膜自噬誘導(dǎo)、自噬體與溶酶體形成的溶解階段自噬誘導(dǎo)顯著被激活，進(jìn)一步對(duì)自噬體的形成以及成熟進(jìn)行調(diào)控。本研究中，隨著患者的缺氧狀況的顯著升高，患者的Beclin-1顯著升高，MVD水平顯著下降，謝冰等[16]在對(duì)稽留流產(chǎn)患者的Beclin-1水平的分析中，患者的Beclin-1顯著升高，與本研究相互印證。

綜上所述，絨毛組織中EphB4、Beclin-1水平與稽留流產(chǎn)患者M(jìn)VD有相關(guān)性，早孕期EphB4的低表達(dá)和Beclin-1水平高表達(dá)可導(dǎo)致血管生成障礙，可能與稽留流產(chǎn)發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。